Robuste Ligatur-induzierte Modell der Murine Parodontitis für die Bewertung von oralen Neutrophilen

Parodontitis (PD) ist eine osteolytische Erkrankung, die mit einer signifikanten Wirtsmorbidität und wirtschaftlichen Belastung verbunden ist, die sich durch Zahnfleischentzündung und Verlust der Weichteilanhaftung und der ossösen Unterstützung für das betroffene Gebiss^1,2,3,4manifestiert. Dieser Prozess wird durch Wechselwirkungen zwischen der oralen Mikrobiota und dem angeborenen Immunsystem des Wirts bestimmt. Es ist auch verbunden mit Verschlimmerung von anderen systemischen entzündlichen Erkrankungen wie Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und Krebs^5,6,7,8. Historisch wurde vermutet, dass pd Pathogenese von großen Mengen spezifischer Bakterien wie Porphyromonas gingivalis⁹abhängig ist. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass die mikrobielle Komponente von PD durch den zahnärztlichen Biofilm vermittelt wird. Der Biofilm ist eine organisierte, komplexe Gemeinschaft zahlreicher Mikroorganismen, die in gesunden symbiotischen und destruktiven dysbiotischen Zuständen existieren können^10,11. Der orale Biofilm bietet normalerweise Resistenzen gegen den Wirt, indem er die Etablierung von Brennpunkten pathogener Bakterien verhindert und fördert die ideale Zahnfleischgewebestruktur und -funktion durch Regulierung der Wirtsimmunantwort^12,13. Störungen der gleichgewichtikomischen Beziehung zwischen commensalen Organismen innerhalb der Mundhöhle und dem Wirtsimmunsystem können zu Veränderungen der Gewebehomöostase führen, was zu Dysbakteriose und Entwicklung des markenzeichen klinischen und radiographischen Aussehens von PD^{5,10,12,13,14}führt.

Interessanterweise ist die Etablierung einer oralen Dysbakteriose, während für die Einleitung von PD erforderlich, nicht ausreichend, um PD bei allen Personen zu treiben, in Richtung der Fähigkeit des Wirts Immunantwort, den Übergang von Mikrobiota zwischen symbiotischen und dysbiotischen Zuständen zu untergraben¹⁵. Dies wirft ein besonderes Schlaglicht auf die Mittel, mit denen PD eine der Hauptfiguren des angeborenen Immunsystems beeinflusst, nämlich das polymorphonukleare Granulozyten (PMN), oder Neutrophil, aus lokaler und systemischer Perspektive^16,17.

Beim Menschen werden PMNs mit einer Rate von 2 x 10⁶ Zellen/h in gesunden parodontalen Bindegeweben aus dem Kreislauf rekrutiert, wo sie die vorherrschende Leukozytenpopulation sind. Hierbei werden sie anschließend als Bestandteil der Zahnfleischflüssigkeit aus dem Zahnfleischsulkus in die Mundhöhle ausgestoßen. In Gegenwart von PD manifestiert sich Neutrophie in der Zirkulation und Mundhöhle, wo diese Effektorzellen einen hyperinflammatorischen Phänotyp besitzen, der zur oben genannten Zerstörung des Parodontiums^{17,18,19,20,21,22}führt. Daher ist es von größter Bedeutung, die Rolle von PMNs bei PD und anderen systemischen entzündungshemmenden Erkrankungen zu verstehen.

Obwohl weithin anerkannt ist, dass chronische Krankheiten wechselseitig mit PD in Verbindung gebracht werden, müssen die zugrunde liegenden Mechanismen noch aufgeklärt werden, was zu Schwierigkeiten bei der Bewältigung dieser morbiden und potenziell tödlichen systemischen Bedingungen beiträgt. Mehrere experimentelle Tiermodelle, jedes mit einzigartigen Vor- und Nachteilen, wurden verwendet, um die Pathophysiologie von PD^23,24zu studieren. Mit Blick auf murine Modelle, gibt es eine Vielzahl von Protokollen, durch die die Untersuchung von PD erleichtert wird; sie besitzen jedoch mehrere technische und physiologische Mängel^{25,26,27,28,29,30,31}.

Erstens erfordert das orale Gavage-Maus-Modell zahlreiche orale Impfungen menschlicher Parodontalerreger, um Zahnfleischentzündungen und Knochenverlust zu erzeugen. Zusätzlich, Es ist in der Regel von einer Periode der Antibiotika-Behandlung voran, um die murine commensale orale Flora zu unterwandern²⁵. Dieses Modell erfordert oft eine spezielle Schulung, um die orale Gavage sicher durchzuführen, verwendet nur einen kleinen Bruchteil der parodontalen Krankheitserreger aus dem komplexeren menschlichen oralen Mikrobiom und erfordert mehrere Monate, um den Knochenverlust von Alveolar zu etablieren.

Im Gegensatz dazu nutzen chemisch induzierte murine Modelle die orale Abgabe von Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) oder Dextransulfat-Natrium (DSS), Wirkstoffe, die häufig bei der Etablierung von murinen Modellen der Kolitis über einen Zeitraum von mehreren Monaten verwendet werden, um parodontalen Knochenverlust zu induzieren²⁶. Es stehen intraorale und extraorale Abszessmodelle zur Verfügung, die die murinen Schneidezähne und Gewebe des Dorsums bzw. Desvariums betreffen. Im früheren Abszessmodell werden mehrere Injektionen von Bakterien verabreicht, wodurch mehrere Gingivaabszesse und ein Mangel an Alveolarknochenverlust entstehen, was ihre Verwendung in der Studie von PD begrenzt. Letztere Abszessmodelle sind deutlich geeigneter, bakterielle Virulenz, Entzündungen und Knochenresorption an Stellen außerhalb der Mundhöhle zu untersuchen, was die Bewertung des Parodontiums und des oralen Mikrobioms^{27,28,29,30,31}eliminiert.

Mit dem ligaturinduzierten Modell der Parodontitis wurde üblicherweise eine geflochtene Seidennaht um den zweiten Molaren herum installiert. Alternativ kann ein einzelnes lineares Segment von Nahtmaterial zwischen dem ersten und zweiten Molaren^32,33eingefügt werden. Das Ziel der Ligatur Platzierung ist es, bakterielle Ansammlung zu erleichtern und Dysbiose innerhalb der Zahnfleischsulci zu erzeugen, was zu parodontalen Gewebeentzündungen und Zerstörung der Gewebe, die das Parodontium bilden. Vor allem ist dieses Modell in der Lage, deutlich mehr alveolären Knochenverlust im Vergleich zu den häufiger verwendeten oralen Gavage Modell³⁴produzieren. Erschwerend kommt hinzu, dass die Natürliche Resistenz mehrerer Mäusestämme (d. h. C57BL/6) gegen die Entwicklung des Alveolarknochenverlustes durch mehrere Mäusestämme (d. h. C57BL/6) erschwert wird. Dies ist auch problematisch, da dieser Stamm am häufigsten in der murinenbasierten Tierforschung verwendet wird³⁵.

Bestehende Verfahren, die von Marchesan et al. und Abe und Hajishengallis beschrieben wurden, wurden entwickelt, um den technischen Akt der Platzierung der Ligatur^33,36zu vereinfachen. Leider erfordert das frühere Protokoll spezielle 3D-gedruckte Geräte und besitzt das Potenzial für vorzeitigen Ligaturverlust, wodurch der Einsatz von Tieren und die Kosten, die mit zusätzlicher Zeit im Operationssaal verbunden sind, erhöht werden. Darüber hinaus erzeugen beide Protokolle nur kleine Regionen des erkrankten Parodontiums, die für eine Studie zur Verfügung stehen.

Die Vorteile, die mit dieser Technik liegen, basieren auf der gleichzeitigen Untersuchung der oralen Dysbiose und Immunologie, die das Parodontium steuern, der Nutzung von Low-Cost-Tieren mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund und einfachen Haltungs- und Haltungspraktiken. Daher sollte das Ziel darin bestehen, das Volumen des erkrankten Gewebes zu maximieren und bei versuchen, die Grundsätze der Reduzierung der Tierforschung zu praktizieren, den Tierkonsum auf ein möglichst niedriges Niveau zu reduzieren. Dies erfordert, dass alle Tiere in die experimentellen Analysen einbezogen werden können³⁷. Es sollte jedoch beachtet werden, dass unabhängig davon, welches Tiermodell der Parodontitis verwendet wird, es kein einziges Modell gibt, das jedes Element der menschlichen PD-Pathophysiologie umfasst.

Dieses neue Protokoll verwendet die Platzierung einer Ligatur um mehrere kieferlänstige Molzähne mit Instrumenten und Materialien, die in den meisten Laboratorien zu finden sind. Es lässt eine ausreichende Zeit, um einfach und sicher eine Ligatur zu installieren, die unwahrscheinlich ist, vorzeitig zu avulsieren. Schließlich wird, da PMNs die Zerstörung des Parodontiums in PD koordinieren, auch eine neuartige Methode zur Wiederherstellung oraler Neutrophile in einer weise vorgestellt, die dem Menschen ähnlich ist.

Alle murinen Studien entsprachen den einschlägigen ethischen Vorschriften und wurden vom University of Toronto Animal Care Committee und der Research Ethics Board (Protokoll 20011930) genehmigt.

1. Ligature Installation

HINWEIS: Dies ist ein nicht-steriler chirurgischer Eingriff, der in einem Standard-Operationssaal durchgeführt werden kann. Die Verwendung von keimfreien Tieren (hier nicht behandelt) erfordert den Umgang innerhalb eines Biosicherheitsschranks, die Verwendung steriler Instrumente und die Impfung der Mundhöhle mit Parodontitis, die die klinischen Manifestationen der Parodontitis verursachen.

1. Verabreichen Sie intraperitoneale Anästhesie an 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse, die mit einer 0,5" 26 G sterilen hypodermischen Nadel und einer 1 ml Spritze gemäß den anerkannten Richtlinien des Institutionellen Tierschutz- und -nutzungsausschusses (IACUC) an ihre Wohnanlage akklimatisiert werden sollten.
   HINWEIS: Eine Kombination aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) Anästhetika induziert schnell und zuverlässig die entsprechende Anästhesie für die Dauer des Verfahrens.
2. Bewerten Sie die Anästhesietiefe vor und alle 15 min während des Eingriffs, wie der Verlust des Pedalreflexes zeigt.
3. Positionieren Sie die Maus auf einer beheizten chirurgischen Plattform (Abbildung 1A). Stabilisieren Sie die Kiefer und Unterkiefer in der offenen Position mit elastischen Bändern und stützen Sie den Hals mit einer Baumwollrolle, um die Maxilla in einer horizontaleren Ausrichtung zu erhalten (Abbildung 1B). Bedecken Sie den Körper und Schwanz des Tieres, um Wärmeverlust während des Verfahrens zu mildern.
4. Positionieren Sie das Operationsmikroskop an der gewünschten Vergrößerung und Beleuchtung (wenn sie nicht direkt am Mikroskop montiert ist) über der Mundhöhle zur Visualisierung des Gebisses. Während die gewünschte Vergrößerung bedienerabhängig ist, wird eine optimale Visualisierung der Mundhöhle bei 16x erhalten.
5. Installieren Sie eine sterile 5-0 geflochtene Seidennaht um die erste (M1) und zweite (M2) Kiefermolaren innerhalb des Zahnfleischsulkus mit Splitterzangen.
   HINWEIS: Geflochtene Seidennähte eines kleineren Messgeräts können zu diesem Zweck verwendet werden, um eine schnellere Installation zu ermöglichen und die Möglichkeit von iatrogenen Weichteilschäden zu reduzieren.
   1. Positionieren Sie den distalen Schwanz der Naht auf der Gaumenseite des Gebisses und fügen Sie das proximale Segment zwischen dem Kontakt von M2 und M3 ein (Abbildung 2A).
   2. Wickeln Sie die Naht um die bukkale Oberfläche von M2 und legen Sie sie zwischen den Kontakt von M1 und M2 ein. Stellen Sie sicher, dass beide Enden der Naht fest gezogen werden, um die Naht in den Zahnfleischsulkus zu treiben und alle Puffer zu entfernen (Abbildung 2B).
   3. Wickeln Sie das proximale Nahtsegment um M1, unterhalb seiner Konturhöhe, und legen Sie es zwischen den Kontakten von M1 und M2 ein. Ziehen Sie den proximalen Schwanz der Naht fest, um die Naht in den Zahnfleischsulkus zu treiben und entfernen Sie alle Puffer (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Wenn beim Einsetzen der Naht zwischen M1 und M2 oder M2 und M3 Widerstand beobachtet wird, kann der Kontakt mit einem Standard-Zahnforscher leicht geöffnet sein.
   4. Binden Sie die Enden der Naht mit einem Chirurgenknoten und trimmen Sie die Schwänze so kurz wie möglich. Legen Sie den Knoten in die Zahnfleischumarmung zwischen M1 und M2 auf der Gaumenseite des Kieferhöhlens (Abbildung 2D).
      HINWEIS: Die Schritte 1.4.1–1.4.4 können bei Bedarf auf der kontralateralen Seite wiederholt werden.
   5. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente in einem heißen Glas Perlensterilisator zwischen jedem Tier.
      VORSICHT: Die Spitzen der Zange sind extrem scharf und können leicht zu einem mundoralen Trauma und erheblichen Blutungen führen. Bereiten Sie kleine Segmente von Gaze vor, um Blut aus der Mundhöhle zu entfernen und Druck auf aktiv blutende Wunden auszuüben.
6. Nach der Ligatur-Installation, entfernen Sie die Maus aus dem chirurgischen Gerät, legen Sie in einen sauberen Käfig unter einer Wärmelampe und überwachen, bis vollständig erholt.
7. Beherbergen Sie jede Maus einzeln mit der entsprechenden Umweltanreicherung und ermöglichen ad libitum den Zugang zu gefiltertem Wasser und püriertem Standard-Chow in einer temperatur- und feuchtigkeitsgesteuerten Umgebung (12-h-Licht/12-h-Dunkelzyklus) für 7–11 Tage.
   ANMERKUNG: Mashed Chow verringert die kräfteerforderlichen Kräfte für die Mastixierung, wodurch Schmerzen im Zusammenhang mit der Fütterung zu reduzieren, und hilft bei der Verhinderung vorzeitigen Verlust der installierten Ligatur.

2. Probensammlung

1. Mäuse gemäß den anerkannten IACUC-Richtlinien zu euthanisieren.
   HINWEIS: Individuelle Euthanasie mit einer_CO2-Kammer gefolgt von Zervixdislokation ist die bevorzugte Methode für dieses Protokoll. Dies kann in Abhängigkeit von Experimenten geändert werden, die die Ernte von zusätzlichem Gewebe erfordern.
2. Mit einer Pipette sofort die Mundhöhle mit 100 l sterilisierter 4 °C 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) ohne Kalzium und Magnesium für 10 s abspülen.
3. Wiederholen Sie Schritt 2.2 2x und legen Sie jede Spülung in einem einzigen 15 ml konischen Polypropylen sterilen Reagenzglas.
4. Übertragen Sie den Inhalt in ein 50 ml konisches Polypropylen-steriles Reagenzglas, indem Sie sie durch einen 40 m lang feinen Nylon-Netzfilter führen.
5. Übertragen Sie diese Inhalte in ein neues 15 ml konisches Polypropylen steriles Reagenzglas.
   HINWEIS: Die endgültige Übertragung der Probe in ein kleineres Rohr ermöglicht eine verbesserte Visualisierung des Zellpellets in den kommenden Schritten.
   1. Auf Wunsch die Molligatur(n) entfernen und in 300 l sterilisierte 1x PBS (4 °C, ohne Kalzium und Magnesium) in ein separates 15 ml konisches Polypropylen-Sterilreagenzglas geben. Rühren Sie sanft und entfernen Sie die Naht aus dem Rohr. Diese Probe wird von diesem Zeitpunkt an identisch mit der oralen Spülprobe behandelt.
6. Fügen Sie 33,3 l von 16% Paraformaldehyd (PFA) hinzu, um die Probenfixierung zu erleichtern.
7. Wirbeln Sie die Proben sofort und inkubieren auf Eis für 15 min.
8. Füllen Sie das Rohr auf 15 ml mit 1x PBS, um PFA zu verdünnen, dann Zentrifuge bei 1000 x g und 4 °C für 5 min.
9. Den Überstand ansaugen und das Pellet in 1 ml fluoreszenzaktiviertem Zellsortierungspuffer (FACS) bei 4 °C wieder aufhängen. Zählen Sie Zellen auf einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
10. Zentrifugieren Sie die Probe wieder bei 1000 RCF und 4 °C für 5 min.
11. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von FACS-Puffer für eine Endkonzentration von 0,5–1,0 x 10⁶ Zellen/50 l FACS-Puffer wieder aus.

3. Antikörperfärbung für die zytometrische Durchflussanalyse

HINWEIS: Beschriften und kühlen Sie alle erforderlichen FACS-Rohre vor der Verwendung.

1. Fügen Sie 1 L Rattenserum und 2 l Anti-Maus-IgG-Antikörper auf 50 l der Probe, Wirbel sofort, und blockieren Sie auf Eis für 20 min.
2. Fügen Sie die entsprechenden Antikörper zu jeder Probe hinzu, wirbeln Sie sofort, und inkubieren Sie auf Eis für 30 min im Dunkeln.
   HINWEIS: Die Auswahl und die Mengen der Antikörper hängen von vorherigen Optimierungsexperimenten ab, die auf diese spezifische Technik zugeschnitten sind.
3. Proben mit 1 ml FACS-Puffer waschen, kurz wirbeln und zentrifugieren 5 min bei 1000 x g und 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
4. Proben in 250 L FACS-Puffer aufsetzen, Rohre mit Paraffinfolie abdecken, in Aluminiumfolie wickeln und bis zur Analyse bei 4 °C halten.
   HINWEIS: Es ist ideal, Proben innerhalb von Stunden nach Abschluss des Protokolls aufgrund des Verlusts von fluoreszierendem Signal während langer Speicherperioden zu analysieren. Proben können jedoch 2 bis 3 Tage später analysiert werden, wenn dies unbedingt erforderlich ist.

Repräsentative Flusszytometriedaten aus oralen Spülproben einer naiven (Abbildung 3A) und entzündeten (Abbildung 3B) murinen Mundhöhle sekundär zu der Ligatur-induzierten Parodontitis zur Verfügung gestellt. Die Wiederherstellung von PMNs aus einer installierten Ligatur wird ebenfalls demonstriert (Abbildung 3C). Durchflusszytometerkanalspannungen wurden manuell kalibriert und die Kompensation mit eingefärbten Kompensationsperlen durchgeführt. PMNs wurden als Ly6G+veF4/80-ve unter Verwendung der skizzierten Gating-Strategie38definiert. Von jeder oralen Spül- und Ligaturprobe wurden mindestens 500 GATEd PMN-Ereignisse erworben. Die PMN-Lebensfähigkeit wurde durch Trypan-Blaufärbung auf ca. 37% festgelegt. Repräsentative Bilder der Alveolarknochenspiegel, gemessen vom Alveolarknochenkamm (ABC) bis zum Zementknotenknoten (CEJ) für gesunde (Abbildung 4A) und ligaierte Mäuse (Abbildung 4B). Die relativen Unterschiede zwischen diesen Messungen (Abbildung 4C) werden angegeben.

Abbildung 1: Tierpositionierung für Molligation. (A) Der Zugang zur Mundhöhle wird durch Halten des Unterkiefers in einer depressiven Position erreicht, indem leichte Traktion auf die Kiefer- und Unterkiefer-Schneidegebisse gebracht wird. (B) Gaze wird unter dem Schädel platziert, um die Bewegung des Kopfes zu verhindern und die Maxilla in eine relativ horizontale Position zu bringen. Körper und Schwanz sind abgedeckt, um Wärmeverluste zu verhindern, bevor sie das Operationsstadium unter dem Mikroskop bewegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Sequenzielles Foto der Ligaturinstallation. (A) Der distale Schwanz der Naht befindet sich auf der Gaumenseite des Gebisses, und das proximale Segment wird zwischen dem Kontakt von M2 und M3 eingefügt. (B) Die Naht wird dann um die bukkale Oberfläche von M2 gewickelt und dann zwischen dem Kontakt von M1 und M2 eingefügt. (C) Das proximale Nahtsegment wird um M1 unter seiner Konturhöhe gewickelt und dann zwischen dem Kontakt von M1 und M2 eingefügt. (D) Die Enden der Naht sind mit dem Knoten eines Chirurgen verbunden und so nah wie möglich am Knoten getrimmt. Der Knoten wird in der Zahnfleischumarmung zwischen M1 und M2 auf der Gaumenseite des Kieferhöhlens platziert. Alle Fotografien wurden auf sezierten Maxilla für die Aufnahme von Verfahrensschritten mit einem ungehinderten Blick auf den Molaren-Gebiss erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative FACS-Plots und Gating-Strategie, die orale Neutrophilenpräsenz demonstriert. Neutrophile wurden aus den folgenden Proben gewonnen und durch Durchflusszytometrie bewertet: (A) orale Spülung von einer naiven Maus, (B) orale Spülung und (C) wiedergewonnene Ligaturen von einer Maus mit Ligatur-induzierten Parodontitis (bilateral). Repräsentative Gating-Strategie-Streudiagramme werden angezeigt. Singlets (SSC-H x SSC-W und FSC-H x FSC-W) und Neutrophile (Ly6G+ve/F480-ve) wurden wie gezeigt abgegrenzt. Numerische Werte geben den Prozentsatz der Zellen innerhalb jedes Gates an. SSC-A = Seitenstreubereich; SSC-W = Seitenstreubreite; SSC-H = Seitenstreuhöhe; FSC-A = Vorwärtsstreubereich; FSC-W = Vorwärtsstreubreite; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Alveolar Knochenverlust Unterschiede zwischen Kontrolle und ligaierten Tieren. Repräsentative Fotos, die Unterschiede im Alveolarknochenverlust zwischen (A) Kontrolle und (B) ligaierten Mäusen zeigen. (C) Messungen von der Zementelnamel-Kreuzung (CEJ) bis zum alveolarigen Knochenkamm (ABC) werden zusammen mit den mesiopalatalen und distopalatalen Linienwinkeln von M1 und M2 (Mittelwert SEM, n = 3) dargestellt. Die P-Werte wurden durch zweiseitige ANOVA mit einem Post-hoc Fisher es LSD-Test bestimmt. (*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.