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Messung der Spermienführung und-beweglichkeit innerhalb der Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

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DOI:

10.3791/59783

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6. Juni 2019

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Sperma muss erfolgreich durch den ovidukt navigieren, um eine Eizelle zu düngen. Hier beschreiben wir einen Test zur Messung der Spermienwanderung innerhalb der C. elegans Hermaphrodite uterus. Dieser Test kann quantitative Daten über die Spermienverteilung innerhalb der Gebärmutter nach der Paarung sowie über Geschwindigkeit, Richtgeschwindigkeit und Umkehrfrequenz liefern.

Zusammenfassung

Eine erfolgreiche Befruchtung ist für die sexuelle Fortpflanzung von grundlegender Bedeutung, aber über die Mechanismen, die Spermien zu Eizellen innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes führen, ist wenig bekannt. Während in vitro-Studien suggeriert wird, dass Spermien von innerlich befruchtenden Tieren auf verschiedene Hinweise aus ihrer Umgebung reagieren können, schafft die Unfähigkeit, ihr Verhalten innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes zu visualisieren, eine Herausforderung für das Verständnis der Samenwanderung. Und Mobilität in der heimischen Umgebung. Hier beschreiben wir eine Methode mit C. elegans, die diese Einschränkung überwindet und ihre transparente Epidermis ausnutzt. C. elegans Männchen, die mit einem mitochondrialen Farbstoff gefärbt sind, werden mit erwachsenen Hermaphroditen gepaäuzt, die als modifizierte Weibchen wirken, und lagern fluoreszierend beschriftete Spermien in die Hermaphrodite Gebärmutter. Die Migration und die Beweglichkeit der beschrifteten Spermien können dann direkt mit einem Epi-Fornitätsmikroskop in einem lebenden Hermaphrodite verfolgt werden. Bei Wildtieren kriechen etwa 90% der beschrifteten Spermien durch die Gebärmutter und erreichen die Düngestelle, oder Spermatheca. Bilder der Gebärmutter können 1 h nach der Paarung genommen werden, um die Verteilung der Spermien innerhalb der Gebärmutter und den Prozentsatz der Spermien, die die Sperma erreicht haben, zu beurteilen. Alternativ können Zeitraffer-Bilder direkt nach der Paarung aufgenommen werden, um die Spermiengeschwindigkeit, die Richtgeschwindigkeit und die Umkehrfrequenz zu beurteilen. Diese Methode kann mit anderen genetischen und molekularen Werkzeugen kombiniert werden, die den C.eleganern zur Verfügung stehen, um neue genetische und molekulare Mechanismen zu identifizieren, die für die Regulierung von Spermienführung und Beweglichkeit innerhalb des weiblichen Fortpflanzungstraktes wichtig sind.

Einleitung

Die molekularen Mechanismen, mit denen Spermien (Spermien genannt) durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in Richtung Eizelle navigieren, sind nicht gut verstanden, sind aber für die sexuelle Fortpflanzung grundlegend. Die Beweglichkeit der Spermien ist hochdynamisch und hängt von robusten Kommunikationssignalen ab, die die Spermiengeschwindigkeit und die Richtmotilität1,2, 3,4, 5,6verändern. , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. C. elegans ist ein mächtiges Modell für die Untersuchung von Spermienbewegung in vivo geworden, weil die transparente Epidermis der Hermaphrodite das Tracking von lebenden Spermien bei einer einzigen Zellauflösung2,3ermöglicht, 8,10. Der Zweck dieses Papiers ist es, Methoden zur Beurteilung der Spermienbewegung innerhalb der C. elegans Hermaphrodite Gebärmutter.

Bei Tierarten, bei denen Spermien und Eizelle in der äußeren Umgebung aufeinandertreffen (d.h. Erwerbsumgebungen), reagieren Spermien auf chemotaktische Signale, die von Eizellen ausgeschieden werden. Diese Signale leiten die Richtung der Spermienbewegung und bringen sie näher an dieSignalquelle 4,6,11heran. Viel weniger ist jedoch über die Spermienbewegung bei Arten bekannt, die intern düngen. Eine große Herausforderung ist die Architektur des weiblichen Fortpflanzungstraktes, der für die Mikroskopie bei den meisten Arten nicht zugänglich ist. In-vitro-Studien bei Menschen, Mäusen und Schweinen zum Beispiel liefern den Nachweis, dass Unterpopulationen von Spermien auf Chemoattractants, Flüssigkeitsfluss und thermische Verläufe 1,5, 7,9,reagieren können. 12. Mit diesen Systemen setzt die Unfähigkeit, die Spermienbewegung in vivo zu visualisieren und zu verfolgen, die Strategien zur Entdeckung der Schlüsselmechanismen, die diese Funktionen regulieren, stark ein.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Methoden entwickelt, mit der Nematoden C. elegans , um Spermien nach der Befruchtung direkt zu visualisieren, einzelne Spermienwanderungsparameter in vivo zu messen und die Fähigkeit einer Spermienpopulation zu messen, gezielt zu zielen. Die Düngestelle. Diese Methoden, zusammen mit dem C. elegans molekularen und genetischen Werkzeugen, erleichtern die Entdeckung der chemischen Signalmoleküle und molekularen Maschinen, die Spermienmotilitätsverhalten regulieren. Zum Beispiel können genetische Bildschirme in Hermaphroditen oder Männern durchgeführt werden, um Gene zu identifizieren, die für eine effiziente Spermienbewegungin vivo 13 unerlässlich sind. Moleküle können in die Hermaphrodite-Gonade injiziert werden, um auf die Auswirkungen auf die Spermienaktivierung, die Migrationsgeschwindigkeit und die Richtmotilität3zu testen. Darüber hinaus können die beschriebenen Methoden zur Überwachung der Schurkensperrwanderung in ektopische Körperstandorte und zur Bewertung des Spermienwettbewerbs 10,14eingesetztwerden.

C. Eleger existieren in der Natur als Hermaphroditen und Männchen (siehe Abbildung 1). Die Hermaphrodite-Gonade hat zwei U-förmige Arme, die Spiegelbilder voneinander sind. Während des Larvenstadiums der L4-Larvenstufe werden die proximalsten Keimzellen (d.h. die Zellen in der Nähe der Spermatheca) einer Spermatogenese unterzogen. Jedes primäre Spermatozyt tritt in die Meiose ein und produziert vier haploide Spermien. Diese Spermien werden zusammen mit der ersten reifen Eizelle in die Spermatheca geschoben und werden einer Spermiogeneseunterzogen15. Erwachsene Hermaphroditen wechseln von der Spermatogenese zur Oogenese. Die Eizellen reifen in Fließband-Manier entlang der Gonade, mit der reifsten Eizelle am proximalen Ende der Gonade, neben der Spermatheca. MSP-Signale aus dem Sperma werden benötigt, um die meiotische Reifungund den Eisprung 16,17auszulösen. Männliche C. elegans hingegenhaben eine J-förmige Gonade, die nur Spermien hervorbringt. Die Spermien werden in der Samenvesicle gespeichert. Bei der Paarung mit der Hermaphrodite oder Weibchen fügt das Männchen die Schweine in der Nähe des Schwanzes in die Vulva ein. Spermatiden werden während der Ejakulation aktiviert, wenn sie mit der Samenflüssigkeit18in Kontakt kommen. C. elegans Spermien schwimmen nicht, da sie nicht geißelt sind. Stattdessen kriechen sie durch den Fortpflanzungstrakt und nutzen den Pseudopod zur Fortbewegung. Es ist gut etabliert, dass männliche Spermien, die größer sind, haben einen Wettbewerbsvorteil gegenüber Hermaphrodite Spermien14.

Bei dieser Methode fungieren männliche C. elegans als Samenspender und werden zu erwachsenen Hermaprhoditen gepaart. Erwachsene Männchen sind mit einem fluoreszierenden mitochondrialen Farbstoff gefärbt, um beschriftete Spermien zu produzieren. Einmal durch die Hermaphrodite Vulva abgelagert, muss das Sperma um die Embryonen in der Gebärmutter in Richtung der Spermatheca, oder Befruchtungsstelle kriechen. Die transparente Epidermis des C. elegans Modells ermöglicht die direkte Visualisierung jedes einzelnen Spermas, während es durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt navigiert. In den letzten Jahren hat unser Labor diese Methode erfolgreich eingesetzt, um die Bedeutung einer Klasse von F-Serien-Prostaglandinen in der Führung Spermienvonder Vulva bis zur Spermatheca 19,20zudemonstrieren. Die molekularen Mechaniken, die ihre Synthese durch die Hermaphrodite und die Reaktion der Spermien bestimmen, werden noch untersucht. Diese Methode zur Beurteilung von Beweglichkeit und Migration von Spermien erleichtert jedoch die Identifizierung der Schlüsselakteure, die die Kommunikation von Spermien und Eizellen bei der internen Befruchtung von Tieren kontrollieren. Das folgende Protokoll beschreibt Schritt für Schritt, wie dieser Test durchgeführt wird.

Protokoll

Hinweis: Alle Schritte in diesem Protokoll werden bei Raumtemperatur (~ 20-22 ° C) oder in konstanten Temperaturinkubatoren auf 16 ° C oder 20 ° C durchgeführt. Männliche und hermaphrodite C. elegans werden unter den üblichen Kulturbedingungen und NA22 oder OP50 E. coli als Nahrungsquelle21,22 angebaut. In der folgenden Prozedur werden Männer vom Typ N2 Hermaphroditen und fog-2, q71 verwendet .

1. Tag 1: Picking L4 Stage Hermaphrodites for Mating

  1. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, sollten alle Hermaphroditen als aktiv reproduzierende Erwachsene synchronisiert werden. Pick 20-30 L4 Stadium Hermaphrodites zu einem 6 cm gesäten nematode Wachstumsmedium (NGM) Platte. Die Hermaphroditen bei 20 ° C für 28-30 Stunden inspülen.
    NOTE: Für die Paarung werden nur 12-15 Hermaphroditen verwendet. Die übrigen Hermaphroditen sind überschüssig.

2. Tag 1: Färbung der Männchen mit fluoreszierendem Mitochondrial Dye (Mito-Farbstoff)

  1. Machen Sie eine männliche Färbung Platte, indem Sie einen Punkt von E. coli (Lebensmittelpunkt) in der Mitte einer nicht gesättigen NGM-Teller. Um den Lebensmittelpunkt zu machen, verwenden Sie das Ende einer Glasrührstange, um E . coli aus dem Bakterienrasen einer gesäten Platte zu kratzen und auf der nicht gesäten Platte abzulegen. Der Punkt sollte ca. 5-7 mm Durchmesser haben.
  2. 2 μL von 1 mM mito-farbig (siehe Materialtabelle) in DMSO und 10 μL M9 Puffer (3 g KH2PO4, 6 g Na2 HPO 4,5g NaCl, 1 mL von 1 M MgSO 4, H2O bis 1 L.MgSO4 nach Autoklaven). Pipette alle Mito-Farbstoff-Lösung auf den Lebensmittelpunkt auf der männlichen Färbeplatte. Die Platte im Dunkeln trocknen lassen (~ 30 min).
    NOTE: Mito-Farbstoff ist lichtempfindlich. Schild alle Lösung, Platten und Würmer, die Mito-Farbstoff aus Licht enthalten. Bewahren Sie den 1-mM-Vorrat bei-20 ° C auf.
  3. Wählen Sie ~ 100 1-3 Tag alte erwachsene Männer23 zu den mito-farbig gefärbten Lebensmittelpunkt auf der männlichen Färbung Teller. Die Platte in Alufolie wickeln und über Nacht bei 16 ° C inkubieren. Für die Paarung verwenden ~ 50-60 Männchen pro 12-15 Hermaphroditen. Wenn mehr als ~ 100 Männchen benötigt werden, machen mehr Färbeplatten, um eine Überfüllung der Männchen zu verhindern.
    NOTE: Männchen können auch durch Inkubation in einer 10 μM mito-Farbstofflösung im M9-Puffer für 3 h auf einem Uhrenglas befleckt werden. Halten Sie die Würmer bedeckt, um Verdunstung und Lichteinwirkung zu verhindern. Nach 3 Stunden, verwenden Sie einen Pasteur-Pipet, um Männchen auf eine 10 cm gesachelte NGM-Platte zu übertragen. Übertragen Sie so wenig wie möglich von der Mito-Farbstoff-Lösung. Die Platte in Alufolie wickeln und über Nacht in 16 ° C inkubieren.

3. Tag 2: Mating

  1. Die gebeizten Männchen vom ersten Tag auf eine neue, gesäten NGM-Platte pflecken. Die Platte in der Dunkelheit bis zur Paarung liegen lassen. Dieser Schritt sorgt dafür, dass überschüssige Mitfarbbeflecken Bakterien um die Männchen entfernt werden. Die Karryover von übermäßigen, mit Milz gefärbten Bakterien auf die Paarungsplatte kann Hermaphrodite-Gewebe verfärben.
  2. Machen Sie eine Paarungsplatte, indem Sie 2 μL eines dicken E. coli-Gemisches auf eine nicht sitzende NGM-Platte fallen lassen. Lassen Sie die dicken Bakterien trocknen, um den Paarungspunkt zu machen. Männchen und Hermaphroditen werden zur Paarung auf diesen Punkt übertragen. Um dick zu machen E . coli, unten 3 mL von Nacht E. coli und wieder die Bakterien Pellets in 1 mL M9. Dieses Gemisch kann bei 4 ° C gelagert und bis zu 6 Monate wiederverwendet werden.
    NOTE: Die Dicke der E. coli-Lösung kann angepasst werden. Wenn die Lösung zu dünn ist, können Männer vom Paarungspunkt wegkriechen, anstatt sich auf ihm für die Paarung zu aggregieren. Die zu dicken Mähpunkte aus einem E. coli Soluton können die Paarungseffizienz verringern.
  3. Während die Paarungsplatte von Schritt 3.2 trocknet, mischen Sie 300 μL von 1% (w/v) Tricaine (Tri), 300 μL von 0,1% (w/v) Tetramisole (Tet) und 900 μL von M9 zusammen.
    NOTE: Speichern 1% (w/v) Tricaine und 0,1% (w/v) Tetramisole als Aliquotes bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Tauwetter.
  4. Übertragen Sie 600 μL der Tet/Tri-Lösung auf ein Uhrenglas.
  5. Übertragen Sie 12-15 Hermaphroditen, die am 1. Tag auf die Tet/Tri-Lösung im Uhrenglas gepflückt wurden. Inkubieren Sie 30 Minuten, um die Hermaphroditen zu immobilisieren. Halten Sie das Uhrglas bedeckt, um zu verhindern, dass die Tet/Tri-Lösung verdunstet.
    NOTE: Es ist wichtig, dass Hermaphrodite für mindestens 30 Minuten betäubt werden. Weniger Zeit könnte bei der Bildaufnahme zu einem bewegten Wurm führen, der mit der Bildgebung interefere.
  6. Während Hermaphroditen inkubieren, wählen Sie 50-60 gefärbte Männchen aus Schritt 3.1 auf den Paarungspunkt (Schritt 3.2). Bewahren Sie die Platte in der Dunkelheit bis Schritt 3.8.
  7. Nach der 30-minütigen Inkubation in der Tet/Tri-Lösung, verwenden Sie einen Glaspasteur-Pipet, um die immobilisierten Hermaphroditen aus dem Uhrenglas auf eine ungesättigte NGM-Platte zu übertragen. So viel Flüssigkeit wie möglich entfernen und trocknen lassen.
    NOTE: Lassen Sie die Hermaphroditen nicht übermäßig trocknen. Sobald alle sichtbaren Flüssigkeiten verdunstet sind, beginnt der nächste Schritt.
  8. Übertragen Sie die Betäubungsmittel von der nicht sitzenden NGM-Platte auf den Paarungspunkt mit den gebeizten Männchen. Inkubieren Sie im Dunkeln 30 Minuten, damit sich die Männchen mit den Hermaphroditen paaren.
  9. Nach einer 30-minütigen Paarung die Hermaphroditen sofort zur Zeitraffer-Bildgebung montieren oder die Hermaphroditen auf eine neue, gesät MAM-Platte übertragen, um sich vor der Bildgebung 1 Stunde auszuruhen.
    NOTE: Zeitlapse-Videos der Hermaphrodite-Gebärmutter werden zur Quantifizierung der Spermiengeschwindigkeit und der Umkehrfrequenz verwendet. Noch Bilder der Gebärmutter, die 1 h nach der Paarung aufgenommen wurden, werden verwendet, um die Spermienverteilung zu quantifizieren, oder die Führung zu spem.

4. Tag 2: Montage von Würmern für die Visualisierung

  1. Erstellung eines Befestigungskissen mit 2% Acharose in H2O
    Hinweis: 2% Acharose können in Schüttgut hergestellt werden, in Glas-Reagenzgläser verführt und bei 4 ° C gelagert werden. Bei Bedarf kann jeder Aliquot vor jedem Gebrauch mikrowellenförmig gewellt und in einem Wärmeblock gespeichert werden, um zu verhindern, dass er sich verfestigt.
    1. Um das Befestigungspolster zu machen, richten Sie drei Glasmikroskop-Dias nebeneinander mit den langen Kanten aus, die sich berühren. Auf beiden Außenrutschen zwei Maskierband übereinander legen. Diese äußeren Glasscheiben mit Klebeband werden als Stütze fungieren, so dass die Dicke des resultierenden Agarcha-Polsters "zwei Klebebänder tief" sein wird.
    2. Platz ~ 75 μL geschmolzene 2% Azerose auf der Mittelrutsche (das ist das Dia ohne Klebeband). Sofort eine neue Glasmikroskop-Rutsche auf die Acharose legen. Diese obere Glasrutsche sollte senkrecht zu den anderen Dias sein, wobei jedes Ende auf dem Band der beiden Stützrutschen ruht.
    3. Lassen Sie die Agarose verhärten (~ 30 s). Entfernen Sie vorsichtig die obere Glasscheibe, indem Sie sie vom Agarot-Bolster abschalten.
  2. 10-15 μL der Tet/Tri-Lösung auf das 2% agarose Pad legen. Übertragen Sie die gepolsterten Hermaphroditen auf das Pad. Achten Sie darauf, möglichst wenig Bakterien zu übertragen.
  3. Legen Sie einen Deckungsschlitz über die Würmer auf das Aglover-Pad.

5. Tag 2: Image Acquisition Setup

NOTE: Jedes aufrechte Fehlkrötenskop, das mit Epi-Flugsucht, 10x und 60x-Zielen ausgestattet ist, und eine Digitalkamera können verwendet werden, um Bilder für die Spermienverteilung zu erfassen. Für die Beurteilung der Spermiengeschwindigkeit, der Richtgeschwindigkeit und der Umkehrfrequenz werden Software benötigt, die in der Lage ist, zeitverfallene Bilder zu erwerben.

  1. Bildaufnahme 1 h nach der Paarung
    1. Montieren Sie die Folie auf die Mikroskop-Bühne. Schauen Sie sich die Augenstücke an, um Würmer auf dem Agarot-Pad mit dem 10x-Objektiv mit dem roten Fluoreszenzemissionsfilter (TRITC-Filter) zu suchen. Sobald ein Wurm gefunden wurde, schalten Sie kurz das Fluoreszenzlicht ein, um zu sehen, ob der Wurm gebeizt ist. Wenn Spermien in der Gebärmutter sichtbar sind, wechseln Sie zum 60x-Ziel.
      NOTE: Der Druck, der durch das 60x-Objektiv auf den Kenterlip entsteht, kann einige empfindliche Würmer schädigen, wodurch der Darm oder die Gonade aus dem Tier austreten. Das Scannen für eine erfolgreiche Paarung mit dem 10x-Objektiv kann die Belastung der Würmer durch den zusätzlichen Druck minimieren. Setzen Sie die gedeckten Würmer nicht längeren Zeiträumen von fluoreszierendem Licht aus.
    2. Mit Hilfe der Differentiellen Kontrastmikroskopie (DIC) positionieren Sie den Wurm so, dass sowohl die Vulva als auch eine Spermatheca im Blick sind. Konzentrieren Sie das Bild, indem Sie sich auf das Zentrum der Spermatheca konzentrieren. Prüfen Sie die Belichtung sowohl für DIC als auch für TRITC-Kanäle. In DIC sollten interne Wurmstrukturen deutlich sichtbar sein. In TRITC sollten einzelne Spermien als ausgeprägte Pünktchen sichtbar sein.
      NOTE: Jedes Bild sollte die Gebärmutter von der Vulva zu einer der Spermatheca erfassen. Wenn die Gebärmutter zu lang ist, um auf ein Bild zu passen, können zwei separate Bilder aufgenommen werden. Es ist nicht notwendig, dass alle Bilder auf der gleichen Belichtungsebene aufgenommen werden. Wichtig ist aber, dass einzelne Spermien in den Fluoreszenzbildern unterschieden und quantifiziert werden können.
    3. Erwerben Sie DIC und Fluoreszenzbilder für jede Gebärmutter.
    4. Wiederholungsstufen 5.1.1-5.1.3, bis alle georkten Hermaphroditen abgebildet sind.
  2. Zeitraffer-Videos aufnehmen
    1. Scannen Sie das Agloan-Pad und finden Sie Hermaphroditen, die beschriftete Spermien in der Gebärmutter enthalten, wie in Schritt 5.1.1 und 5.1.2
    2. Konfigurieren Sie die Software, um Zeitraffer-Bilder in DIC und TRITC-Kanälen zu erfassen. In der Regel werden Zeitraffer-Bilder in 15-30-Intervallen für 10-20 min pro Gebärmutter aufgenommen.

6. Quantifizierung

  1. Quantifizierung der Spermienverteilung auf Gebärmutterbilder, die 1 h nach der Paarung aufgenommen wurden
    1. Beginnend mit der Vulva an einem Ende und der Spermatheca auf dem anderen, teilen Sie die Gebärmutter in Dritteln. Diese werden die drei Zonen repräsentieren. Zone 1 (Z1) enthält die Vulva und Zone 3 (Z3) die Spermatheca.
    2. Zählen Sie manuell die Anzahl der Spermien in jedem Drittel der Gebärmutter, und melden Sie die Zahl in jeder Zone als ein Prozent der gesamten Spermien in der gesamten Gebärmutter. Ein Beispiel finden Sie unten.
      Formel für die Spermienkonzentration, Verhältnisgleichung; Gleichung zur Berechnung des Spermienanteils in Zonen.
      Hinweis: Manchmal muss die Signalintensität des TRITC-Kanalbildes so angepasst werden, dass jedes im Bild aufgenommene Sperma sichtbar und quantifiziert werden kann.
  2. Spermien in Zeitraffer-Bildern verfolgen
    NOTE: In diesem Beitrag haben wir die Software NIS-Elements für die Analyse verwendet. In den folgenden Abschnitten geben wir Anweisungen für die manuelle Verfolgung von Spermien mit dieser Software (Schritt 6.2.1) sowie der Open-Source-Software ImageJ/Fiji (Schritt 6.2.2).
    1. Spermien mit NIS-Elementen verfolgen
      1. Öffnen Sie die Datei. nd2 mit der zu verfolgenden Zeitrafferserie. Um mit der Verfolgung zu beginnen, öffnen Sie das Tracking-Panel, indem Sie mit der rechten Maustaste in die Software klicken und die Analysekontrollen auswählen | Tracking.
      2. Wählen Sie im Tracking-Panel den neuen ROIdefinieren. Definieren Sie jede Region von Interesse (ROI), indem Sie über jedes Sperma, das verfolgt wird. Über dem ausgewählten Sperma erscheint eine farbige Markierung. Klicken Sie auf Beenden , wenn alle ROIs ausgewählt wurden.
      3. Sobald die ROIs identifiziert sind, bewegen Sie sich in den nächsten Rahmen der Zeitrafferserie. Ziehen Sie die ROI-Markierung auf die neue Position des Spermas im Bild. Machen Sie so lange, bis die Spermien nicht mehr verfolgt werden können. Es werden gekreuzte Linien angezeigt, die alle Orte verbinden, an denen der ROI-Marker durch alle Rahmen des Zeitraffer-Bildes platziert wurde.
        NOTE: Nur Spermien in Zone 2 sollten als Spermien in den Zonen 1 und 3 verfolgt werden, neigen dazu, sich in einem kreisförmigen Muster zu bewegen, auch bei wilden Tieren.
      4. Exportieren Sie alle quantifizierbaren Daten (z.B. Pfadlänge, Uhrzeit, XY-Position, etc.) aus dem gefahrenen Sperma in ein Excel-Dokument, indem Sie auf Export in das Tracking-Panel klicken.
    2. Spermien mit Fidschi verfolgen
      1. Konvertieren Sie die TRITC-Kanalbilder in der Zeitraffer-Serie in .tif-Dateien. Speichern Sie alle Dateien aus einer Serie in einem Ordner.
      2. Importieren Sie die Bilder auf die Fidschi-Inseln, indem Sie die BioFormats-Import-Funktion verwenden. Importieren Sie Bilder aus einer Zeitrafferserie als einen Hyperstack.
      3. Open TrackMate in Fidschi24 via Plugins | Tracking | Manuelles Tracking mit TrackMate. Eine Diaglog-Box öffnet sich.
      4. Wählen Sie das TrackMat-Tool in der Fidji-Toolbar. Doppelklick auf die Spermien, die verfolgt werden. Es erscheint ein grüner Kreis mit gestrichelten Linien. Dieser Kreis kann neu positioniert werden, indem man in den Kreis klickt und an die gewünschte Position zieht. Die Größe dieses Kreises kann durch gleichzeitiges Drücken der ALT-Taste und das Scrollen der Maus verändert werden.
      5. Sobald die Größe und Position des Trackers festgelegt ist, klicken Sie erneut auf den Kreis. Die gestrichelten grünen Linien werden zu einer festen grünen Linie. Klicken Sie gleichzeitig auf die SHIFT und L-Tasten , um den Tracking-Modus einzuschalten. Dies wird in der Fidschi-Werkzeugleiste angezeigt.
      6. In der Zeitrafferserie zum nächsten Rahmen übergehen. Um den neuen Standort des gefahrenen Spermas in den neuen Rahmen zu setzen, schweben Sie die Maus über den neuen Punkt und drücken Sie die A-Taste . Der Tracker wird nun am neuen Standort erscheinen, und es erscheint eine Linie, die die Orte verbindet, an denen der Tracker in den vorherigen Frames platziert wurde.
      7. Nachdem die Spuren abgeschlossen sind, klicken Sie auf Analyse in der TrackMate-Dialogbox , um die benötigten Daten zu generieren.
    3. Um die Geschwindigkeit zu berechnen, teilen Sie die gesamte Pfadlänge der Spermien durch die abgelaufene Zeit.
    4. Um die vektorielle Geschwindigkeit zu berechnen, ziehen Sie eine Linie durch die Gebärmutter, die von der Vulva ausgeht, die auf die Spermatheca zeigt. Messen Sie die Entfernung, die die Spermien entlang dieser Linie vom Anfang bis zum Ende der Spur abgewandert sind. Teilen Sie diese Distanz durch die verstrichene Zeit. Negative Werte deuten darauf hin, dass die Spermien von der Spermatheca abgewandert sind.
    5. Um die Umkehrfrequenz aufzuzeichnen, zählen Sie die Anzahl der Zeiten, in denen die Spermienspur einen Winkel von weniger als 90 ° in drei aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Rahmen erzeugt hat.

Ergebnisse

Um die in diesem Beitrag dargestellten Ergebnisse zu generieren, wurden die Zwerg-2- Frauen mit dem Mito-Farbstoff befleckt und auf Wild-Typ, N2 Hermaphroditen, gePaarungen gepasst. Abbildung 2 bietet ein Gesamtschema für die Methode, einschließlich der Wurmvorbereitung,-matte und-analyse. Wie Film 1 zeigt, hat der erwachsene Hermaphrodite-Fortpflanzungstrakt zwei Arme, die Spiegelbilder voneinander sind. Bei der Paarung werden die beschrifteten Spermien in der Hermaphrodite-Gebärmutter durch die Vulva abgelagert. Die Spermien bewegen sich um die sich entwickelnden Embryonen innerhalb der Gebärmutter in Richtung der Spermatheca, wo sie bis zur Befruchtung gelagert werden. Da sich Keimzellen im erwachsenen Hermaphroditen zu Eizellen entwickeln, wird die proximale, reifste Eizelle über Zellkonterpressen in die Spermatheca gedrückt. Die Befruchtung tritt auf, während die Eizelle in der Spermatheca ist.

Um die Spermienverteilung und Migration durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt zu quantifizieren, ist die Hermaphrodite-Gebärmutter in drei Zonen unterteilt (Film 1, Abbildung 3A). Zone 1 erstreckt sich über das erste Drittel der Gebärmutter, beginnend mit der Vulva. Zone 2 erstreckt sich über das mittlere Drittel der Gebärmutter, und Zone 3 erstreckt sich über das letzte Drittel der Gebärmutter und schließt die Spermatheca ein. Die richtige Spermienführung mit Wild-Typ, N2 Hermaphroditen und Nebel-2 - q71) Männer sollte dazu führen, dass etwa 90% der beschrifteten Spermien die Spermatheca oder Zone 3 (Abbildung 3B) erreichen.  Matings, die zu wenig (Abbildung 3C, weniger als 10-15 Spermien) oder zu viele (Abbildung3D, Gebärmutter mit Spermien gefüllt) Spermien in der Gebärmutter ergeben, sollten nicht gezählt werden. In Matten, die in weniger als 10-15 Spermien führen, 3-4 Schurkenspermien können stark verrutschen die Daten. Ebenso kann das Sperma nicht angemessen wandern, wenn die Gebärmutter vollständig mit Spermien gefüllt ist. Spermien können in der Gebärmutter einiger Mutanten verstreut erscheinen, die einen schlechten Spermienführen-Phenotyp aufweisen. In diesem Fall sollten Spermien jedoch nicht jede Spalte der Gebärmutter füllen, wie in Abbildung 3D zusehen ist. Die Quantifizierung jedes Arms der Gonade wird als eine Probe oder eine n betrachtet.

Zeitlapsebilder werden aufgenommen, um die Spermiengeschwindigkeit und die Umkehrfrequenz zu quantifizieren. Nur Spermien in Zone 2 sollten verfolgt werden (Abbildung 4A), da Spermien in den Zonen 1 und 3 (Film 1) dazu neigen, sich in einem kreisförmigen Muster zu bewegen, auch bei wilden Tieren. Zeit-Laspe-Bilder, die in 15-30 s Intervallen aufgenommen werden, werden in der Regel verwendet, um Spermien zu verfolgen. Quantifiziert werden werden werden nur Spermien, die in aufeinanderfolgenden Frames für mehr als 2,5-3 min verfolgt werden können. In Abbildung 4B-M erfüllendie Spermien, die durch die roten und blauen Punkte gekennzeichnet sind, dieses Kriterium, während das Sperma, das durch den grünen Punkt markiert wird, dieses Kriterium nicht erfüllt. Daher werden die in Abbildung 4N definierten Werte für die Spermien, die durch die roten und blauen Punkte (Abbildung 4O) gekennzeichnet sind, quantifiziert, während die Werte für die Spermien, die durch den grünen Punkt markiert wurden, nicht quantifiziert wurden.

Hermaphroditisches vs. männliches Diagramm der Anatomie von C. elegans, einschließlich Keimbahn, Spermatheca, Samenblase.
Abbildung 1: Karikatur des erwachsenen C. eleganischen Hermaphrodite und Männchen. Große Fortpflanzungsstrukturen sind in der Figur gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Flussdiagramm: Paarungsprotokoll von C. elegans; Farbstoff, anästhetische Verwendung; Spermienanalyse mittels Epi-Fluoreszenzmikroskopie.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Probenaufbereitung und Datenerfassung. Die mit dem Mito-Farbstoff befleckten Männchen werden zu synchronisierten erwachsenen Hermaphroditen gepasst. Zeitverfallbilder von gepaarten Hermaphroditen werden unmittelbar nach der Paarung aufgenommen, um Daten für Spermiengeschwindigkeit und Umkehrfrequenz zu erfassen. Noch Bilder von gepaarten Hermaphroditen werden 1 Stunde nach der Paarung aufgenommen, um die Spermienverteilung innerhalb der Gebärmutter zu beurteilen. Weitere Details finden Sie im Text. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Analyse der Embryobefruchtung, Mikroskopiebilder und -diagramm, Fluoreszenzintensitätszonen Z1-Z3.
Abbildung 3: Quantifizierende Spermienverteilung innerhalb der Hermaphrodite-Gebärmutter. (A). Schematic of the C. elegans hermaphrodite uterus. V = vulva, E = Embryo, S = spermatheca, O = Eizelle, Z1-Z3 = Zonen 1-3, die zur Messung der Spermienverteilung verwendet werden. (B-D). DIC + TRITC verschmolzen (linke Tafeln) und TRITC nur (rechte Tafeln) Bilder des wilden Typs Hermaphrodite uteri 1 h nach der Paarung zu Nebel-2-q71) Männchen mit dem Mito-Farbstoff gefärbt. Spermien erscheinen rot. Gelbe Umrisse deuten auf die Lage der Spermatheca hin. Skalierbalken: 20 μm. Z1, Z2, Z3-Quantifizierung in B stellen die prozentualen Spermien in jeder Zone ± Standardabweichung dar. Bilder in C und D stellen Paarungen dar, die zu wenig (C) oder zu viele (D) Spermien zur Quantifizierung geführt haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Spermienmotilitätsmikroskopie: Zeitrafferanalyse, Vektorgeschwindigkeit, Umkehrfrequenz, Berechnungen.
Abbildung 4: Quantifizierende Spermiengeschwindigkeit und Umkehrfrequenz während der Wanderung durch die Gebärmutter. (A) DIC + TRITC hat das Bild einer Hermaphrodite-Gebärmutter mit fluoreszierenden Spermien (rot) zusammengeführt. V = vulva, gelb = spermatheca, Z1-Z3 = drei Zonen der Gebärmutter, Black Box: Zone 2. (B-M). Zeitraffer TRITC-Kanalbilder zoomten sich auf Zone 2 (Black Box in A). Bilder wurden im Abstand von 20 Jahren erworben. 3 einzelne Spermien wurden in jedem Bild verfolgt (rote, grüne und blaue Punkte). Farbige Punkte in der Tafel M stellen den Weg jedes Sams von B-Ldar. Skalierbalken = 20μm. (N) Gleichungen und Definitionen für Spermiengeschwindigkeit, Vektorgeschwindigkeit und Umkehrfrequenz. (O) Geschwindigkeit, vektorielle Geschwindigkeit und Umkehrfrequenz von Spermien in den Tafeln B-L durch die roten und blauen Punkte verfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nematoden-Fortpflanzungsprozess, Diagramm zeigt die Kontraktionen der Scheide, den Eisprung; Mikroskopische Analyse.
Film 1: Film von Spermienbewegung und Migration. Ein Wildtyp Hermaphrodite wurde zu fog-2-q71) Männchen mit Mito-Farbstoff gefärbt gepasst. Der Film ist ein Zusammenkommen von Zeitraffer-Bildern, die in unterschiedlichen Zeitabständen aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download.)

Diskussion

Die Fähigkeit von Spermien, den verschlungenen weiblichen Fortpflanzungstrakt zu navigieren und Eizellen zu finden, ist für die sexuelle Fortpflanzung entscheidend. Neuere Studien, in denen Spermien von intern düngenden Tieren verwendet werden, legen nahe, dass sie aktiv auf verschiedene Umweltarten reagieren, darunter chemische Signale, Flüssigkeitsfluss und Temperaturverläufe1,5,7, 9 , 12. Diese Beobachtungen sind jedoch weitgehend auf vitro-Experimente zurückzuführen, und über Spermienverhalten und Kommunikation innerhalb des Fortpflanzungstraktes ist wenig bekannt. Eine der Haupthindernisse für den Erwerb von Daten über Samenmigration und Beweglichkeit in vivo ist die mangelnde Sichtbarkeit in den meisten weiblichen Fortpflanzungsgebieten. Die Methode, die wir hier beschrieben haben, um C . elegans zu verwenden, überwindet diese Einschränkung. Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, ermöglicht die transparente Epidermis eine direkte Visualisierung und Verfolgung jedes Sammas bei der Auflösung von Einzelzellen in einem lebendigen, intakten Organismus.

C. elegans hat zwei Geschlechter. Die Männchen, mit einem XO-Genotyp, produzieren nur Spermien, und in dieser Methode, werden als Spermien Spender verwendet. Die Hermaphrodite, mit einem XX-Genotyp, sind modifizierte Weibchen. Ihre Gonaden durchlaufen zunächst im vierten Larvenstadium eine Spermatogenese und wechseln im Erwachsenenalter 25 auf Oogenese. In diesem Test werden erwachsene Hermaphroditen verwendet, deren Fortpflanzungsgewebe ein Modell für den weiblichen Fortpflanzungstrakt darstellen. Die Nutzung beider Geschlechter in diesem Test ermöglicht es uns, genetische und molekulare Wege sowohl in der männlichen als auch in der weiblichen, die Spermienführung und Beweglichkeit zu regulieren. In Kombination mit der ganzen Fülle von genetischen und molekularen Techniken, die für C.elegans zur Verfügung stehen, kann diese Methode zu neuartigen Einsichten in die Samenwanderung und die Beweglichkeit sowie in die Spermien-und Eizellkommunikation führen.

Einige kritische Schritte in diesem Protokoll rechtfertigen neben den Details, die im Protokollabschnitt angegeben sind, weitere Überlegungen.

Würmer
An Stelle vonN2-Männchen können mutzige Männchen verwendet werden , die sichin der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Regel in der Diese Mutationen erhöhen die Häufigkeit von Männern in Kulturen, aber nicht beeinflussen männliche Paarung oder Spermienfunktionen13. Weibchen, wie z.B . fog-2-q71) Weibchen, können anstelle von Hermaphroditen verwendet werden. Allerdings müssen Weibchen mit Männchen vorgepaßen werden, um eine richtige Eizellentwicklung zu ermöglichen. Das Vorhandensein von befruchteten Embryonen aus dieser Vorverpaarung sorgt auch dafür, dass die Gebärmutter lang genug ist, um die Spermienverteilung richtig zu beurteilen. Wenn Mutanten oder experimentelle Hermaphroditen bewertet werden, schließen Sie eine Kontrollgruppe ein. Zum Beispiel sollten mutierte Hermaphrodite mit Wildtyp N2 Hermaphroditen als Steuerung für andere Variablen im Test gepaart werden. Hermaphrodite, die mit Bakterien gefüttert wurden, die Plasmide für RNA-Interferenzuntersuchungen enthalten, sollten auch mit Bakterien gefüttert werden, die eine leere Vektorkontrolle enthalten. Der Abstand von der Vulva, in der Spermien befruchtet werden, zur Spermatheca, der Düngestelle, kann je nach Anzahl der Eier in der Gebärmutter variieren (d.h. die Gebärmutter dehnt sich mit zunehmender Eizellzahl aus). Wenn Vergleiche zwischen Genotypen vorgenommen werden, wählen Sie Hermaphroditen, deren Gebärmutter ähnliche Anzahl von Eiern enthält. Wählen Sie keine Hermaphroditen, die schlüpfende Embryonen oder bewegliche Larven enthalten. Es kann ein Zeitverlauf durchgeführt werden, um das optimale Alter zu ermitteln, in dem Hermaphrodite untersucht werden sollen.

Hermaphroditen und Männchen pflücken
Es ist wichtig, dass die Hermaphroditen, die für diesen Test ausgewählt wurden, nicht von überwucherten oder ausgehungerten Platten stammen. Lebensmittel-und Pheromoncues modulieren den Ausdruck von DAF-7, einem TGFß Homolog. Der DAF-7-Pfad wurde gezeigt, regelt die Synthese von F-Serien-Prostaglandinen, die eine wichtige Rolle bei der Führung Spermien zur Sperma20spielen. Hermaphroditen von überfüllten oder verhungerten Platten zu pflücken, kann zu einer schlechten Spermienführung führen, die nicht mit dem Ziel des Interesses in Verbindung steht. Die Dichte der Platten scheinen nicht auf die männlichen Spermien zu beeinflussen. Allerdings können Männer, die zu jung oder zu alt sind, zu einer verminderten Paarungseffizienz führen (d.h., das Prozent der Hermaphroditen auf der Paarungsplatte, die genug Spermien in ihren Gebärmutter haben, um zu quantifizieren). 1-3 Tage alte erwachsene Männer sind optimal für diesen Test23.

Hermaphroditen verhetzend
In unseren Händen sorgt die Kombination Tetramisole und Tricaine dafür, dass Würmer immobilisiert werden und während der Paarung und Bildaufnahme am Leben bleiben. Auch andere Anästhesie, wie Natriumazid, können verwendet werden. Natriumazid ist jedoch hochgiftig und die Bedingungen müssen standardisiert werden. Immobiliierungstechniken mit Mikroperlen, Acharose und Mikrofluidik-Kammern sind nicht zu empfehlen, da sie die Paarung stören.

Männliche Färbung
Der Mito-Farbstoff, der in diesem Manuskript verwendet wird, MitoTrackerCMXRos, wurde in C. elegansverwendet, um Spermien, sowie andere Mitochondrien, zu kennzeichnen. Das Sperma, das mit diesem Mito-Farbstoff gekennzeichnet ist, ist voll funktionsfähig, behält seine Fähigkeit, aktiviert zu werden, zu migrieren, Eizellen zu düngen und lebensfähige Nachkommen zu produzieren 26,27. Andere mitochondriale Farbstoffe, wie Rhodamine 6G und DiOC6,wurdenverwendet, um C. elegans Mitochondrien 28,29 zu verfärben. Allerdings müssen die Bedingungen für diese Farbstoffe für die Kennzeichnung von Spermien in diesem Test standardisiert werden. Neben mitochrondrialen Kennzeichnungsmechanismen können DNA-Flecken wie Syto17 auch zur Kennzeichnung von SpermienfürMigrationshintergrund 30 verwendet werden. Während diese Beschriftungstechniken relativ einfach und schnell durchzuführen sind, können transgene Strategien auch verwendet werden, um Spermien zu erzeugen, die fluoreszierende Tags unter SpermienspezifischePromoter 31,32ausdrücken.

paarung
Zu dick sind Mating Punkte, die die Paarungseffizienz verringern. Bei der Übertragung von Männchen und Betäubungsmittels auf den Paarungspunkt sollte darauf geachtet werden, möglichst wenig Bakterien zu übertragen.

Aergro-Pads herstellen und den Deckungszettel platzieren
Luftblasen können in den Agarchobstern erzeugt werden. Sie können Licht während der Bildaufnahme brechen oder, wenn sie groß genug sind, dazu führen, dass Würmer durchfallen, was es unmöglich macht, die Bilder zu erwerben. Ebenso können Luftblasen entlang der Hermaphroditen entstehen, wenn der Deckungsrutsch über sie auf dem Agarcha-Pad platziert wird. Diese Blasen brechen das Licht ab und führen zu einer verminderten Bildqualität. Die Praxis wird helfen, das Auftreten von Luftblasen zu verringern.

Quantifizierung
Bei der Quantifizierung der Spermienverteilung können verschiedene z-Ebenen durch die Gebärmutter eines Wurms leichte Unterschiede in der Spermienverteilung haben. Wir stellen fest, dass die Einnahme eines einzigen Bildes, das sich auf die Spermatheca konzentriert, uns reproduzierbare Ergebnisse liefert, die den Ergebnissen ähneln, die durch die Mittelung mehrerer z-Abschnitte erzielt werden. Wir empfehlen, das Bild auf die Mitte der Spermatheca zu konzentrieren, aber die Fokusebenen können je nach Bedarf des Experimentators leicht verändert werden. Kritisch ist aber, dass alle Bilder gleich aufgenommen werden. Außerdem ist es wichtig, dass nur Spermien gezählt werden, die im Fokus stehen. Es ist der Ermessensspielraum des Gegners bei der Bestimmung der Kriterien für In-Focus-Spermien. Entscheidend ist jedoch, dass die Kriterien systematisch auf jeden zu bezifferten Wurm angewendet werden. Für die Spermienverfolgung bieten viele Software automatische Tracking-Funktionen. Wir stellen jedoch fest, dass die manuelle Tracking-Funktion den automatischen Tracking-Algorithmus der Software aus zwei Hauptgründen übertrifft: 1) Die Fülle an ähnlich großen Kernen auf dem beengten Raum macht es für die Software schwierig, zwischen einzelnen Spermien zu unterscheiden. Und erstellen Sie definierte ROIs für jedes Sperma. 2) Während Spermien in und aus dem Fokus gehen, verschieben sich ihre Intensitäten, was es für die Software schwierig macht, den Überblick über die Spermien über längere Zeiträume zu behalten.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken unserem verstorbenen Mentor, Dr. Michael Miller, herzlich für seine inspirierende und selbstlose Mentorenschaft und die Schaffung dieser Methode als Werkzeug, um Spermien und Eizellkommunikation besser zu verstehen. Sein plötzliches Vergehen war ein enormer Verlust für seine Familie, sein Labor und die wissenschaftliche Gemeinschaft. Diese Studie wurde vom NIH (R01GM085105 bis MAM und F30HD094446 bis MH) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und vertritt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der Nationalen Gesundheitsinstitute.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien und Material
FisherFB0875713A
AgarFisher BP1423-500
NatriumchloridFisherS671-3
PeptonFisherBP1420-500
CholesterinSigma-AldrichC8667
LB-Brühe, MillerFisher1426-2
Escherichia coli Stamm NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC)NA22Entweder diese oder OP50 E. coli kann für C. elegans Wartung und Assay verwendet werden. Beide sind erhältlich bei der CGC
N2CGCN2
fog-2(q71)CGCCB4108
Platindraht Ø 0,25 mmAlfa Aesar10288
5 3/4" Einweg-PasteurpipetteFisher13-678-20A
UhrenglasFisher02-612A
GlasstabØ 5 mmFisher50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye)FisherM7512Schutz vor Licht, lagern bei -20 > C
MonopostassiumphosphatFisherP285-500
DinatriumphosphatFisherS374-1
MagnesiumsulfatFisherM63-500
DimethylsulfoxidFisherBP231-1DMSO
AluminiumfolieFisher01-213-102
Ethyl-3-aminobenzoat-MethansulfonatSigmaE10521-10GTricain ist der gebräuchliche Name. In Aliquoten bei -20 °C lagern.
TetramisolhydrochloridSigmaL9756-5GIn Aliquoten bei -20 &° lagern; C
AgaroseFisherBP1356-100
DeckgläserFisher12-548-A18 x 18-1
Frosted ObjektträgerFisher12-552-3
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
16 ° C und 20 ° C InkubatorenFisher97-990EGleiches Modell, eingestellt auf unterschiedliche Temperaturen.
Aufrechtes Mikroskop mit Epi-Fluoreszenzbeleuchtung, Kamera und 10x- und 60x-ObjektivenNikon
Software mit Bilderfassungs- und Tracking-FunktionenNikonNIS-elements AR
StereomikroskopNikonSMZ800NJedes Stereomikroskop, das zur Visualisierung von C. elegans verwendet werden kann, kann mit diesem Protokoll verwendet werden
60 mm x 15 mm Petrischale:

Referenzen

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Spermienmotilit tFortpflanzungstrakt von C elegansmitochondriale FarbungEpifluoreszenzmikroskopieTime lapse BildgebungSpermien TrackingQuantifizierung der SpermathekaUterus Zonierunggenetische Manipulation
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