Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Zusammenfassung

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.

Zusammenfassung

Primäre Neuronenkultur ist eine wesentliche Technik auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Um tiefere mechanistische Einblicke in das Gehirn zu gewinnen, ist es wichtig, ein robustes In-vitro-Modell zu haben, das für verschiedene neurobiologische Studien genutzt werden kann. Obwohl primäre Neuronenkulturen (d.h. langfristige Hippocampuskulturen) Wissenschaftlern Modelle geliefert haben, stellt sie die Komplexität des Gehirnnetzwerks noch nicht vollständig dar. Im Gefolge dieser Einschränkungen ist ein neues Modell entstanden, das Neurosphären verwendet, die eine engere Ähnlichkeit mit dem Gehirngewebe aufweisen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Beschichtung von hohen und niedrigen Dichten gemischter kortikaler und hippocampaler Neuronen, die aus dem Embryo des embryonalen Tages 14-16 Sprague Dawley Ratten isoliert wurden. Dies ermöglicht die Erzeugung von Neurosphären und langfristige primäre Neuronenkultur als zwei unabhängige Plattformen, um weitere Studien durchzuführen. Dieser Prozess ist extrem einfach und kostengünstig, da er mehrere Schritte und Reagenzien minimiert, die bisher als wesentlich für die Neuronenkultur galten. Dies ist ein robustes Protokoll mit minimalen Anforderungen, das mit erreichbaren Ergebnissen durchgeführt und weiter für eine Vielzahl von Studien im Zusammenhang mit Neurowissenschaften verwendet werden kann.

Einleitung

Das Gehirn ist eine komplizierte Schaltung von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen. Seit Jahren versuchen Wissenschaftler, Einblicke in diese komplexe Maschinerie zu gewinnen. Dazu griffen Neurowissenschaftler zunächst zu verschiedenen transformierten nervenbasierten Zelllinien für Untersuchungen. Jedoch, die Unfähigkeit dieser klonalen Zelllinien starke synaptische Verbindungen und richtige Axone oder Dendriten haben wissenschaftliches Interesse an primären Neuronenkulturen verschoben^1,2. Der aufregendste Aspekt der primären Neuronenkultur ist, dass es eine Gelegenheit schafft, lebende Neuronen zu beobacht....

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden von der Institutional Animal Ethics Committee of CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1) genehmigt.

1. Reagenz- und Medienzubereitung

1. Poly-D-Lysin(PDL)-Lösung: Bereiten Sie PDL-Lösungen in Konzentrationen von 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor und lagern Sie sie in 4 °C bis zur Anwendung.
2. Dissoziationsmedium: Bis 1 L steriles, gefiltertes entionisiertes Wasser, kombinieren Sie die folgenden Komponenten in den jeweiligen Konzentrationen: Natriumchlorid (8 mg/ml), Kaliumchlorid (0,4 mg/ml), Kaliumphosphat monobasic (0,06 mg/ml), D-Glucose ....

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde eine einfache Strategie erläutert, bei der variable Zellbeschichtungsdichten von zwei verschiedenen neuronalen Screening-Plattformen erhalten werden. Abbildung 1A,B zeigt die Adhärenz von Zellen nach 4 h Der Beschichtung der Neuronen in hoch- bzw. niedrigdichten plattierten Zellen. Bei Der Beobachtung der korrekten Einhaltung der Neuronen gemäß Abbildung 1wurde das Beschichtungsmedium du.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, dass durch die Änderung der Zellbeschichtungdichten von primären Neuronen zwei variable neuronale Plattformen erhalten werden. Obwohl dies eine einfache Methode ist, muss jeder Schritt sorgfältig ausgeführt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Andere frühere Methoden haben entweder langfristige primäre Neuronenkulturen oder Neurosphärenkulturen berichtet. Die meisten primären NeuronenkulturProtokolle haben die Kultivierung von Hippocampus-Neuronen für 3-5 Wochen beteiligt, aber .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti-Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Inkubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-Glukose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX83 Modell
Formaldehyd	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Ergänzung	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Pferdeserum	HiMedia	RM10674
Salzsäure	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle' s mit Earle" s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Mikroskop	Dewinter	Victory Modell
Neurobasales Medium	Gibco	21103-049
Kunststoffe (24-Well-Platten, Zellsiebe und Platten mit geringer Adhärenz)	BD Falcon	353047, 352350 und 3471
90 mm Petrischalen	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysin	Millipore	A.003.E
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	BP366-500
Kaliumphosphat monobasisch	Merck	MI6M562401
Natriumchlorid	Qualigem	15918
Natriumphosphat dibasisch	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Modell
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypanblau Lösung	Gibco	15250-061
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072