Methodenartikel

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

11.7K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/59876

⸱

12. September 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Zusammenfassung

Eine der größten Hürden auf dem Gebiet der extrazellulären Vesikelforschung (EV) ist heute die Fähigkeit, gereinigte EV-Präparate in einer Virusinfektion zu erreichen. Die vorgestellte Methode soll Elektrofahrzeuge von Virionen (d. h. HIV-1) abisolaten und eine höhere Effizienz und Ausbeute im Vergleich zu herkömmlichen Ultrazentrifugationsmethoden ermöglichen. Unser Protokoll enthält drei Schritte: EV-Ausfällung, Dichtegradiententrennung und Partikelerfassung. Downstream-Assays (z. B. Western Blot und PCR) können direkt nach der Partikelerfassung ausgeführt werden. Diese Methode ist vorteilhaft gegenüber anderen Isolationsmethoden (d. h. Ultrazentrifugation), da sie die Verwendung von minimalen Startvolumina ermöglicht. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlicher als alternative EV-Isolationsmethoden, die mehrere Ultrazentrifugationsschritte erfordern. Die vorgestellte Methode ist jedoch in ihrem Umfang an funktionellen EV-Assays begrenzt, da es schwierig ist, intakte Elektrofahrzeuge aus unseren Partikeln zu entfernen. Darüber hinaus ist diese Methode auf einen rein forschungsbasierten Rahmen zugeschnitten und wäre kommerziell nicht rentabel.

Einleitung

Die Forschung, die sich auf extrazelluläre Vesikel (EVs) konzentriert, insbesondere Exosomen, eine Art von EV im Bereich 30-120 nm und gekennzeichnet durch das Vorhandensein von drei Tetraspanin-Markern CD81, CD9 und CD63, wurde weitgehend durch die Entwicklung von Methoden zur Isolierung und die Vesikel von Interesse zu reinigen. Die Fähigkeit, vielfältige Mechanismen zu dissektieren, wurde durch komplexe und zeitaufwändige Techniken behindert, die Proben erzeugen, die aus einer heterogenen Population von Vesikeln bestehen, die über verschiedene Wege mit einer Vielzahl von Inhalten, Größen und Dichten. Während dies ein Problem für fast die gesamte EV-Forschung ist, ist es von besonderer Bedeutung bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen im Zusammenhang mit Virusinfektionen, da Virionen und virusähnliche Partikel (VLPs) im Durchmesser den Vesikeln von Interesse ähnlich sein können. Zum Beispiel hat das Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) einen Durchmesser von etwa 100 nm, was ungefähr der Größe vieler Arten von Elektrofahrzeugen entspricht. Aus diesem Grund haben wir einen neuartigen EV-Isolations-Workflow entwickelt, um diese Probleme anzugehen.

Der aktuelle Goldstandard der EV-Isolierung ist die Ultrazentrifugation. Diese Technik nutzt die verschiedenen Vesikeldichten, die es ermöglichen, die Vesikel durch Zentrifugation mit Differentialsedimentation von Partikeln mit höherer Dichte im Vergleich zu Partikeln mit niedrigerer Dichte in jeder Stufe 1,2zu trennen. Mehrere Mittel zur Zentrifugierung mit niedriger Geschwindigkeit sind erforderlich, um intakte Zellen (300-400 x g für 10 min), Zellablagerungen (für 10 min) und apoptotische Körper/große Vesikel (10.000 x g für 10 min) zu entfernen. Auf diese anfänglichen Reinigungen folgt eine Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation (100.000-200.000 x g für 1,5-2 h) zu Sediment-EVs. Waschschritte werden durchgeführt, um die Reinheit der Evev weiter zu gewährleisten, dies führt jedoch zur Verringerung der Anzahl isolierter Elektrofahrzeuge, wodurch die Gesamtausbeute 3,4verringert wird. Der Nutzen dieser Methode wird durch den Bedarf an einer großen Anzahl von Zellen (ca. 1 x 108) und einem großen Probenvolumen (> 100 ml) weiter eingeschränkt, um angemessene Ergebnisse zu erzielen.

Um den wachsenden Bedenken Rechnung zu tragen, ist die Fällung von Vesikeln mit hydrophilen Polymeren in den letzten Jahren zu einer nützlichen Technik geworden. Polyethylenglykol (PEG) oder andere verwandte Niederschlagsreagenzien ermöglichen es dem Anwender, die Vesikel, Viren und Protein- oder Protein-RNA-Aggregate innerhalb einer Probe herunterzuziehen, indem die Probe einfach mit dem Reagenz der Wahl inkubiert wird, gefolgt von einer einzigen Zentrifugation1,2,5. Wir haben bereits berichtet, dass die Verwendung von PEG oder verwandten Methoden zur Ausscheidung von Elektrofahrzeugen im Vergleich zur herkömmlichen Ultrazentrifugation zu einer deutlich höheren Ausbeute6führt. Diese Strategie ist schnell, einfach, erfordert keine zusätzliche teure Ausrüstung, ist leicht skalierbar und behält die EV-Struktur bei. Aufgrund des promiskuitiven Charakters dieser Methode enthalten die resultierenden Proben jedoch eine Vielzahl von Produkten, darunter freie Proteine, Proteinkomplexe, eine Reihe von Elektrofahrzeugen und Virionen, die eine weitere Reinigung erfordern, um die gewünschte Population zu erhalten1 ,2,7,8.

Um die Heterogenität von Elektrofahrzeugen zu überwinden, die aus verschiedenen Niederschlagsmethoden gewonnen werden, wird die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DG) genutzt, um Partikel auf der Grundlage ihrer Dichte besser zu trennen. Diese Methode wird mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung eines Dichtegradientenmediums wie Iodixanol oder Saccharose durchgeführt, das die Trennung von Elektrofahrzeugen von Proteinen, Proteinkomplexen und virus- oder virusähnlichen Partikeln (VLPs) ermöglicht. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl man einst dachte, dass die DG eine genauere Trennung der EV-Subpopulationen zulässt, es heute bekannt ist, dass sich Größen und Dichten verschiedener Vesikel überschneiden können. So haben Exosomen bekanntermaßen Flotationsdichten von 1,08-1,22 g/ml9, während aus dem Golgi isolierte Vesikel (COPI+ oder Clathrin+) Dichten von 1,05-1,12 g/ml und solche aus dem endoplasmatischen Retikulum (COPII+ ) Sediment bei 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Wenn man exosomale Fraktionen mit Fraktionen vergleichen möchte, die Viruspartikel enthalten, kann dies je nach Dichte des Virus von Interesse schwieriger werden – es gibt andere Viren als HIV-1, die wahrscheinlich gleichzeitig ausgleichen. Dichte als exosomale positive Fraktionen2.

Schließlich ist die Anreicherung von EV-Preps für nachgelagerte Visualisierungen und funktionelle Assays für die EV-Forschung von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung von EV-anreichernden Nanopartikeln, insbesondere multifunktionalen Hydrogelpartikeln mit einem Durchmesser von 700-800 nm, ist ein entscheidender Schritt zur Erreichung konzentrierter EV-Preps. Sie besitzen einen aromatischen Köder mit hoher Affinität, der von einer porösen äußeren Siebschale gekapselt wird, um die Selektivität zu fördern. Zu den in dieser Studie verwendeten Nanopartikeln gehören zwei unterschiedliche Präparate mit unterschiedlichen Kernködern (Reactive Red 120 NT80 und Cibacron Blue F3GA NT82), die nachweislich die Erfassung von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Reagenzien und Biofluiden erhöhen (siehe Tabelle der Materialien). )6,10,11,12,13,14,15. Die Partikel bieten eine einfache Anreicherung von Elektrofahrzeugen aus zahlreichen Ausgangsmaterialien, darunter Iodixanolfraktionen, Zellkulturüberstand, sowie Patientenbiofluide wie Plasma, Serum, zerebrale Rückenmarksflüssigkeiten (CSF) und Urin6,13 .

Die hier vorgestellte Methode verbessert die Effizienz der aktuellen EV-Reinigungstechniken durch die Kombination mehrerer Technologien; EV-Fällung, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung, um den Workflow zu optimieren, die Probenanforderungen zu reduzieren und die Ausbeute zu erhöhen, um eine homogenere EV-Probe für den Einsatz in allen EV-Forschungen zu erhalten. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen und deren Inhalt während einer Virusinfektion, da sie einen Filterschritt von 0,22 m umfasst, um große, unerwünschte Vesikel und VLPs sowie die Trennung der gesamten EV-Population auf der Grundlage der Dichte zu einer effektiven EVs von Virions zu isolieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Filtration und Niederschlag von extrazellulären Vesikeln (EVs)

  1. Um den Kulturüberstand aus infizierten oder transfizierten Zellen (d. h. Zelllinien und/oder Primärzellen) vorzubereiten, kulturieren Sie etwa 10 ml Late-Log-Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5 %CO2 in geeigneten Kulturmedien (d. h. RPMI oder DMEM mit 10 % fetalem Rinder Serum [FBS]).
    HINWEIS: Alle Kulturmedium-Reagenzien sollten frei von Elektrofahrzeugen sein und können entweder gekauft werden (siehe Materialtabelle) oder in Eigenung durch Vor-Ultrazentrifugation von Serum bei 100.000 x g für 90 min hergestellt werden. Dieses Protokoll war erfolgreich für mehrere häufig verwendete Zelllinien, darunter: CEM, Jurkat, 293T, U937 (nicht infizierte Linien), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 und HTLV-1 infizierte Linien), mehrere transfizierte Zellen und primäre myeloide und T-Zellen (beide infiziert und nicht infiziert); Dieses Protokoll kann jedoch für jeden Zelltyp verwendet werden, einschließlich derer, die spezielle Medien- oder Kulturbedingungen erfordern. Die Dichte der Zellen muss möglicherweise für verschiedene Zelltypen optimiert werden. Es wird empfohlen, die höchste Dichte mit minimalem Zelltod nach 5 Tagen zu verwenden.
  2. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 3.000 x g für 5 min zu Pelletzellen und entsorgen Sie das Pellet.
  3. Filtern Sie den Kulturüberstand mit einem sterilen 0,22 m Filter und sammeln Filtrat in einem Röhrchen.
  4. Fügen Sie dem gefilterten Überstand das gleiche Volumen des PEG-Niederschlagsreagenzes (1:1-Verhältnis) hinzu. Inverttube mehrmals, um eine homogene Mischung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Nicht wirbeln.
  5. Inkubationsmischung bei 4 °C über Nacht (O/N).
  6. Zentrifugengemisch bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) zu einem heterogenen EV-Pellet.
    HINWEIS: EV Pellet sollte weiß oder off-white in der Farbe erscheinen.
  7. Entsorgen Sie den EV-erschöpften Kulturüberstand.
  8. Das EV-Pellet in 150–300 l phosphatgepufferter Saline ohne Kalzium und Magnesium (PBS) aussetzen und auf Eis halten.

2. Konstruktion eines Dichtegradienten

  1. Mischen Sie Dasiodixanol dichte Gradientenmedium mit 1x PBS, um 11 verschiedene 1 ml Dichtefraktionen von 6 bis 18% Iodixanol in 1,2% Schritten in separaten Mikrozentrifugenröhren zu erzeugen, wie in Abbildung 1Adargestellt.
  2. Wirbel jede Röhre zu mischen.
  3. Schichtdichtefraktionen in ein vorgereinigtes und trocken schwingendes Eimer-Ultrazentrifugenrohr beginnend mit #18 und endend mit #6 wie in Abbildung 1Bangegeben.
    HINWEIS: Alle Rohre sollten mit einem 10% Bleichspray desinfiziert werden, gefolgt von dem Spülen 3x mit entionisiertem Wasser und einer letzten Wäsche von sterilem entionisiertem Wasser vor dem Laden der Gradientenfraktionen.
  4. Fügen Sie resuspendiertes EV-Pellet (300 l) an die Spitze des geschichteten Gradienten im Ultrazentrifugenrohr.
  5. Ultrazentrifuge bei 100,00 x g bei 4 °C für 90 min.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die 1 ml-Fraktionen aus dem Ultrazentrifugenrohr und übertragen Sie jede Fraktion in neue Mikrozentrifugenrohre.

3. Anreicherung von EV-Fraktionen uUsing Nanoparticles

  1. Erstellen Sie eine 30%ige Gülle von Nanopartikeln mit gleichen Volumina von NT80, NT82 und 1x PBS.
    HINWEIS: Das Gemisch sollte vor der Verwendung gewirbelt werden, um homogenzuwerden.
  2. Fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr, das die Dichtefraktionen enthält, 30 l der Gülle hinzu und die Pipette/Invertiten mehrmals zum Mischen.
  3. EV-anreichernde nanopartikelhaltige Dichtefraktion Mikrozentrifugenröhren O/N bei 4 °C bei ca. 20 U/min drehen.
  4. Zentrifugendichte Fraktion Mikrozentrifugenrohre bei 20.000 x g für 5 min bei RT.
  5. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie EV Pellet zweimal mit 1x PBS.
    HINWEIS: Nanopartikelpellets können bei -20 °C eingefroren oder sofort für verschiedene nachgeschaltete Assays (z. B. PCR, Western Blot, Massenspektrometrie und andere Assays) verwendet werden.

4. Empfohlene Herstellung von Nanopartikelpellet für Downstream-Assays

  1. Für RNA-Isolierung
    1. Setzen Sie das Pellet in 50 l autoklaviertem entionisiertem Wasser, das mit 0,001% Diethylpyrocarbonat (DEPC) gefiltert wird, durch einen 0,2-mm-Filter wieder aufundstillen und die RNA gemäß dem Protokoll des Kitherstellers isolieren.
  2. Für Gelelektrophorese
    1. Setzen Sie das Pellet direkt in 15 l Laemmli-Puffer aus.
    2. 3 min. 3 min. 3x 3x vorziehen und zwischen jedem Wärmezyklus nach unten drehen.
    3. Zentrifugenprobe für 15 s bei 20.000 x g und laden Sie das gesamte eluierte Material direkt auf das Gel.
      HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, begrenzen Sie die Menge der Partikel, die auf das Gel geladen werden, und führen Sie das Gel bei 100 V aus, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Partikel in den Brunnen enthalten sind.
  3. Für die Trypsinverdauung
    1. Setzen Sie das Pellet vor der Alkylierung in 20 l Harnstoff aus und versuchen Sie die Probe. Nanopartikel können durch eine Zentrifugation von 14.000 x g bei RT 10 min pelletiert werden. Proben, die das trypsinisierte Peptid enthalten, können in ein sauberes Sammelrohr übertragen werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

PEG-Niederschlag erhöht EV-Ausbeute
Unser Kombinationsansatz zur EV-Isolierung ist in Bezug auf die EV-Rückgewinnung deutlich effizienter als bei der herkömmlichen Ultrazentrifugation, wie die 90%ige Reduzierung des benötigten Ausgangsmaterials zeigt. Ultrazentrifugation, der aktuelle Goldstandard in der EV-Isolierung, benötigt ca. 100 ml Kulturüberstand, um eine adäquate EV-Vorbereitung für nachgeschaltete Assays zu erzeugen, während unser neuartiges Protokoll nur 10 ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die skizzierte Methode ermöglicht eine verbesserte EEV-Ausbeute und die Trennung von Viren von Elektrofahrzeugen mit einem Kombinationsansatz zur Isolierung. Relativ große Mengen an Ausgangsmaterial (d. h. Zellüberstand) können vor der EV-Isolierung durch Niederschlag, DG-Trennung und Nanopartikelanreicherung gefiltert werden, was zu einem Endvolumen von 30 nachgeschaltete Assays. Die Verwendung der Nanopartikelanreicherung ist unerlässlich, da diese EV-anreichernden Nanopartikel im Vergleich zur herkömmlichen Ultrazentr...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

B.L. ist mit Ceres Nanosciences inc. verbunden, die Reagenzien und/oder Instrumente herstellt, die in diesem Artikel verwendet werden. Alle anderen Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir möchten uns bei allen Mitgliedern des Kashanchi-Labors bedanken, insbesondere bei Gwen Cox. Diese Arbeit wurde von national Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 und NS099029 an F.K.) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CEM CD4+ ZellenNIH AIDS Reagenzprogramm117CEM
DPBS ohne Ca und Mg (1x)Qualität Biologisch114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1PEG Fällungsreagenz
Exosom-depletiertes FBSThermo Fisher ScientificA2720801
Fötales RinderserumPeak SerumPS-FB3Serum
HIV-1-infizierte U937-ZellenNIH AIDS-Reagenzprogramm165U1
Nalgene Spritzenfilter 0,2 &Mikro; m SFCAThermo Scientific723-2520
Nanotrap (NT80)Ceres NanosciencesCN1030Reactive Red 120
Core Nanotrap (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA Core
Optima XE-980 UltrazentrifugeBeckman CoulterA94471
OptiPrep Density Gradient MediumSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti AusschwingrotorBeckman Schar331362
Ultra-Clear Rohr, 14 mm x 89 mmBeckman Schar344059

Referenzen

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Aufreinigung extrazellul rer VesikelVirustrennungPEG F llungDichtegradientenzentrifugationAnreicherung von NanopartikelnUltrazentrifugationsprotokollWestern Blot AnalysePCR NachweisSteigerung der EV AusbeuteHIV 1 Kontamination

Verwandte Artikel