Diese Methode beschreibt die Probenvorbereitung aus kultivierten Zellen und tierischen Geweben, die Extraktion und Derivatisierung von Coenzym A in den Proben, gefolgt von einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zur Reinigung und Quantifizierung des derivatisierten Coenzyms A durch Absorptions- oder Fluoreszenzdetektion.
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Methodenartikel
Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neue Forschungen haben gezeigt, dass die zelluläre Coenzym A (CoA) Versorgung mit nachteiligen Auswirkungen auf Wachstum, Stoffwechsel und Überleben einschränkenkann. Die Messung von zellulärem CoA ist eine Herausforderung aufgrund seiner relativ geringen Häufigkeit und der dynamischen Umwandlung von freiem CoA in CoA-Thioester, die wiederum an zahlreichen Stoffwechselreaktionen teilnehmen. Es wird eine Methode beschrieben, die während der Probenvorbereitung durch mögliche Fallstricke navigiert, um einen Assay mit einem breiten linearen Nachweisbereich zu ergeben, der für den Einsatz in vielen biomedizinischen Laboratorien geeignet ist.
Einleitung
Coenzym A (CoA) ist ein wesentlicher Cofaktor in allen lebenden Organismen und wird aus Pantothensäure, auch Pantothenat (das Salz der Pantothensäure) oder Vitamin B5 genannt, synthetisiert. CoA ist der wichtigste intrazelluläre Träger organischer Säuren, einschließlich kurzkettiger Säuren wie Acetat und Succinat, verzweigtkettige Säuren wie Propionat und Methylmalonat, langkettige Fettsäuren wie Palmitat und Oleat, sehr langkettige Fettsäuren wie mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Xenobiotika wie Valproinsäure. Die organische Säure bildet eine Thioester-Verbindung enzymatisch mit CoA, um ihre Verwendung als Substrat bei über 100 Reaktionen im Zwischenstoffwechsel ....
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Protokoll
Das in diesem Protokoll erwähnte Tierverfahren wurde gemäß den Protokollen 323 und 556 durchgeführt und vom St. Jude Children es Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee speziell genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen
HINWEIS: Verwenden Sie Reinstwasser für alle Lösungen und wenn in verfahren angegeben.
- 1 mM Kaliumhydroxid (KOH) in Wasser vorbereiten.
- 0.25 M KOH in Wasser vorbereiten.
- 1 M Trizma-HCl in Wasser vorbereiten und auf pH 8,0 einstellen.
- 100 mM Monobromobiman (mBBr) in Acetonitril (Optima Grade) vorbereiten. Stocklösungen von mBBr sind viele ....
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Ergebnisse
Eine relativ schnelle und zuverlässige Methode zum Nachweis von CoA-Gesamtinkulturzellen und Geweben wurde entwickelt, indem das Thiol von CoA mit mBBr zu einem Fluoreszenzmittel ableitet und dann das derivatisierte CoA-Bimane mit Reverse-Phase-HPLC gereinigt wird. Zunächst wird eine Standardkurve erzeugt, bei der bekannte und steigende Mengen des CoA-Bimane-Standards einzeln injiziert werden und die Bereiche unter den Spitzen in den CoA-Bimane-Chromatogrammen in Abhängigkeit vom Eingang CoA-bimane(A.......
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Diskussion
Hier zeigen wir ein zuverlässiges, schrittweises Verfahren zur Quantifizierung von CoA-GesamtcoA in Zellen und tierischen Geweben mit einer breiten Palette linearer Detektion, die in vielen Laboratorien zugänglich ist, die über einen HPLC mit einem Absorptions- oder Fluoreszenz-Ausgangsdetektor verfügen. Alternativ ist die Massenspektrometrie eine gängige Technik zur Bewertung von CoA- und CoA-Thioestern, ist aber aufgrund der Kosten der Instrumentierung und des für die Entwicklung der Methodik und der Interpretation von.......
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Offenlegungen
MWF, CS und SJ schrieben das Papier, MWF und CS stellten die Daten und Zahlen zur Verfügung, COR entwarf die Experimente und überprüfte das Manuskript kritisch. SJ und COR sind Erfinder einer anhängigen Patentanmeldung (PCT/US17/39037) "Kleine Molekülmodulatoren von Pantothenat-Kinasen" des St. Jude Children es Research Hospital, die die in diesem Artikel genannte PZ-2891-Verbindung abdeckt.
Danksagungen
Die Autoren würdigen die Finanzierung von gesponserter Forschung, die von CoA Therapeutics, Inc., einer Tochtergesellschaft von BridgeBio LLC, dem National Institutes of Health Grant GM34496 und den American Lebanese Syrian Associated Charities bereitgestellt wird.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-(2-Pyridyl)-ethyl-Kieselgel SPE-Säule | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| Coenzym A | Avanti Polare Lipide | 870700 | |
| Gemini C18 3 μ m 100 & Aring; HPLC-Säule | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| Monobromobiman | ThermoFisher | Scientific M-1378 | |
| Omni-Tip Sonde Gewebedisruptor | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorisierter Rotor-Stator-Homogenisator | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X Zentrifugenrohrfilter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Wasser 2475 Fluoreszenzdetektor | Wasser | 2475 | |
| Wasser 2489 UV-Vis Detektor | Wasser | 2489 | |
| Wasser e2695 Trennmodul | Wasser | e2695 |
Referenzen
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
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Nachdrucke und Genehmigungen
