Methodenartikel

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

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DOI:

10.3791/60182

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27. September 2019

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt die Probenvorbereitung aus kultivierten Zellen und tierischen Geweben, die Extraktion und Derivatisierung von Coenzym A in den Proben, gefolgt von einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zur Reinigung und Quantifizierung des derivatisierten Coenzyms A durch Absorptions- oder Fluoreszenzdetektion.

Zusammenfassung

Neue Forschungen haben gezeigt, dass die zelluläre Coenzym A (CoA) Versorgung mit nachteiligen Auswirkungen auf Wachstum, Stoffwechsel und Überleben einschränkenkann. Die Messung von zellulärem CoA ist eine Herausforderung aufgrund seiner relativ geringen Häufigkeit und der dynamischen Umwandlung von freiem CoA in CoA-Thioester, die wiederum an zahlreichen Stoffwechselreaktionen teilnehmen. Es wird eine Methode beschrieben, die während der Probenvorbereitung durch mögliche Fallstricke navigiert, um einen Assay mit einem breiten linearen Nachweisbereich zu ergeben, der für den Einsatz in vielen biomedizinischen Laboratorien geeignet ist.

Einleitung

Coenzym A (CoA) ist ein wesentlicher Cofaktor in allen lebenden Organismen und wird aus Pantothensäure, auch Pantothenat (das Salz der Pantothensäure) oder Vitamin B5 genannt, synthetisiert. CoA ist der wichtigste intrazelluläre Träger organischer Säuren, einschließlich kurzkettiger Säuren wie Acetat und Succinat, verzweigtkettige Säuren wie Propionat und Methylmalonat, langkettige Fettsäuren wie Palmitat und Oleat, sehr langkettige Fettsäuren wie mehrfach ungesättigten Fettsäuren und Xenobiotika wie Valproinsäure. Die organische Säure bildet eine Thioester-Verbindung enzymatisch mit CoA, um ihre Verwendung als Substrat bei über 100 Reaktionen im Zwischenstoffwechsel zu ermöglichen1. CoA-Thioester sind auch allosterische Regulatoren und Transkriptionsaktivatoren. Es wird nungeschätzt 2, dass die zelluläre Gesamt-CoA-Versorgung reguliert ist3,4; Daher kann die CoA-Verfügbarkeit begrenzt sein, und dass CoA-Mängel katastrophal sein können, wie vererbte genetische Störungen zeigen, die sich auf die CoA-Biosyntheseauswirken 5. Pantothenatkinase katalysiert den ersten Schritt in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, genannt PKAN, wird durch Mutationen im PANK2-Gen 6verursacht. CoA-Synthase, kodiert durch das COASYN-Gen, katalysiert die letzten beiden Schritte in der CoA-Biosynthese (Abbildung 1) und COASY Protein-Associated Neurodegeneration, genannt CoPAN, wird durch eine Mutation im COASYN-Gen verursacht 7. Sowohl PKAN als auch CoPAN sind vererbte neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Eisenakkumulation im Gehirn verbunden sind, und CoA-Mangel unterbewertet die Krankheitspathologien.

Die Zellulären Konzentrationen der gesamten CoA variieren zwischenGeweben 8 und Gesamt-CoA kann unter einer Vielzahl von physiologischen, pathologischen und pharmakologischen Zuständen erhöhen oder abnehmen. Leber CoA erhöht während kraftstoffumstellung von der Fütterung in den gefasteten Zustand9, und Leber CoA-Spiegel sind ungewöhnlich hoch bei Leptin-mangelhafte fettleibige Mäuse10. Leber CoA nimmt als Reaktion auf chronische Ethanol-Aufnahme11ab. Gehirn CoA-Spiegel im Pank2 Knockout-Maus-Modell sind während der perinatalen Periode depressiv, aber später im Erwachsenenstadium Gehirn CoA-Gehalt ist gleich wilde-Typ-Ebenen, was auf eine adaptive CoA-Antwort während der Entwicklung12. Die Manipulation des CoA-Gehalts des Gewebes durch Transgenese oder Genabgabemethoden wirkt sich auf metabolische und neuronale Funktionenaus 13,14,15. Die präklinische Entwicklung potenzieller Therapien für PKAN oder CoPAN umfasst Zell- oder Gewebe-CoA-Messungen als Indikatoren für die Wirksamkeit16,17,18,19,20 . Die Bewertung all dieser Bedingungen und ihrer metabolischen oder funktionellen Folgen erfordert eine quantitative Methode zur Messung der gesamten CoA.

Ein genauer, zuverlässiger Test zur Messung von CoA in biologischen Proben ist in vielen Labors eine technische Herausforderung. Leider gibt es keine Sonden zur Bewertung oder Quantifizierung von CoA- oder CoA-Thioestern in intakten Zellen, obwohl Analoga natürlicher CoA-Thioester weit verbreitet als mechanistische Sonden in Studien mit CoA-Ester unter Verwendung von Enzymen21verwendet wurden. Die Umwandlung von CoA, mit einem freien Sulfhydryl (-SH) Moiety, zu einem CoA-Thioester (oder umgekehrt) ist schnell in Zellen oder tierischen Geweben während der Übertragung in eine andere Umgebung und während der Zelllyse. Zahlreiche Acyl-CoA-Synthetasen und Acyl-CoA-Thioesterasen in Zellen vermitteln die Interkonversionen innerhalb des CoA-Pools, und zusätzliche Enzyme, die CoA-Thioester als Substrate nutzen, bleiben in biologischen Proben aktiv, bis sie durch chemische oder physikalische mittel. Die Auslagerung von Acylgruppen von CoA zu Carnitin durch Acyltransferasen ist ein Beispiel innerhalb des Netzwerks von Reaktionen, die die CoA/CoA-Thioester-Verteilung verändern können. Radioaktive Tracer können verwendet werden, um die CoA-Syntheseraten in Zellen zu messen. Die aktuellen Methoden zur Messung von CoA- und CoA-Derivaten in biologischen Proben wurden22 überprüft und umfassen gekoppelte enzymatische spektrophotometrische Assays, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und massenspektrometriebasierte Verfahren. Diese Methoden konzentrieren sich jedoch häufig auf bestimmte CoA-Molekulararten und sind blind für Variationen des gesamten CoA-Pools. Die gekoppelten enzymatischen Assays erfordern aufgrund geringer Detektionsempfindlichkeiten in der Regel größere Mengen an Eingangsmaterial und weisen einen begrenzten Linearitätsbereich auf.

Unser Labor hat ein zuverlässiges Verfahren zur Quantifizierung des gesamten CoA in kultivierten Zellen und tierischen Geweben entwickelt. Die Strategie umfasst die Hydrolyse aller CoA-Thioester, um während der Probenvorbereitung nur freies CoA zu liefern, anstatt sich um die Erhaltung und Analyse des gesamten Spektrums der CoA-Arten zu bemühen. Das Verfahren ist eine Zusammenstellung einzelner veröffentlichter Methoden zur Probenvorbereitung, CoA-Ableitung, Reinigung und Identifizierung nach Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Quantifizierung des derivatisierten CoA durch Absorption oder Fluoreszenzdetektion23,24,25. Die mit diesem Verfahren gewonnenen CoA-Bestimmungen haben unser Verständnis der CoA-Regulierung und die Entwicklung eines therapeutischen Ansatzes zur Behandlung von CoA-Mängeln ermöglicht.

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Protokoll

Das in diesem Protokoll erwähnte Tierverfahren wurde gemäß den Protokollen 323 und 556 durchgeführt und vom St. Jude Children es Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee speziell genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen

HINWEIS: Verwenden Sie Reinstwasser für alle Lösungen und wenn in verfahren angegeben.

  1. 1 mM Kaliumhydroxid (KOH) in Wasser vorbereiten.
  2. 0.25 M KOH in Wasser vorbereiten.
  3. 1 M Trizma-HCl in Wasser vorbereiten und auf pH 8,0 einstellen.
  4. 100 mM Monobromobiman (mBBr) in Acetonitril (Optima Grade) vorbereiten. Stocklösungen von mBBr sind viele Monate bei -20 °C stabil, sofern sie im Dunkeln gehalten werden, da die Lichteinwirkung das Monobromobiman zu Bimane26photolyseisieren kann.
  5. Bereiten Sie Wash Buffer für die Festphasenextraktion (SPE) Spalte vor: 50% Methanol (Optima Grade) + 2% Essigsäure.
  6. Elution Buffer für SPE-Säule vorbereiten: 95% Ethanol (HPLC-Grade) mit 50 mM Ammoniumformat.

2. Vorbereitung des CoA-Bimane-Standards

  1. Kaufen Sie einen hochwertigen CoA-Standard aus einer seriösen Quelle (z.B. Avanti Polar Lipids, Inc.).
  2. Bereiten Sie eine hochkonzentrierte Lagerlösung von CoA in 20 mM Tris, pH 8 vor. Die CoA-Menge im hochkonzentrierten Bestand wird durch spektrophotometrische Absorption bei 260 nm bestimmt oderbestätigt . 4-fach molareüberschuss von mBBr hinzufügen; Wirbel auf hoch für 10 s. Zum Beispiel, für 10 mM CoA im Puffer, fügen Sie 40 mM mBBr. Das mBBr wird überzählend hinzugefügt, um sicherzustellen, dass alle CoA ableitung.
  3. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 4 h im Dunkeln ohne schütteln, um die CoA mit mBBr abzuleiten. mBBr reagiert mit der Thiolgruppe der CoA, und es ist pH- und temperaturabhängig27. Die Zugabe des mBBr wandelt CoA in ein wasserlösliches fluoreszierendes (oder ultraviolettes Absorptionsmittel) CoA-Bimane (CoA-Bimane; Abbildung 2).
  4. Fügen Sie 100 l Essigsäure und Wirbel auf hoch für 10 s, um die Reaktion zu stoppen.
  5. Zentrifuge bei 2.000 x g für 15 Minuten, um alle Niederschlagsmittel zu entfernen.
  6. Bereinigen Sie den Überstand mit einer SPE-Säule, um das unreagierte mBBr (siehe unten) zu entfernen. Eine Filtration und Zentrifugierung des Eluats ist nach der SPE-Säulenreinigung (Abschnitt 5.8) nicht erforderlich.
  7. Sammeln Sie das Eluat aus der SPE-Säule, die das CoA-Bimane enthält, in einem vorgewogenen Rohr, trocknen Sie unter Stickstoffgas, wiegen Sie und konstruieren Sie eine Standardkalibrierungskurve mit bekannten CoA-Bimanenmengen.
    1. Prüfen Sie den CoA-Bimane-Standard auf Reinheit durch HPLC (siehe unten) mit Absorptionsdetektion sowohl bei 260 (Adenin-Moiety) als auch bei 393 (bimane moiety) und Beifall beider Spitzen im Chromatogramm.
    2. Bestätigen Sie die Menge des CoA-Bimane-Standards im Hochkonzentrationsbestand mit 260 nm (n = 16.800 M-1cm-1).
  8. Registrieren Sie die HPLC-Retentionszeit für die Identifizierung von CoA-Bimane in experimentellen Proben mit dem CoA-Bimane-Standard.
  9. Lagern Sie Aliquots des hochkonzentrierten Lagerbestands des CoA-Bimane-Standards, der bis zu 2 Jahre lang vor Licht geschützt und bei -20 °C gelagert wird. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und erneutes Einfrieren.

3. Extraktion und Ableitung von CoA in kultivierten Zellen

  1. Ernten Sie anhimante Zellen in der Kultur, wenn sie sich der späten subkonfluenten Dichte nähern. Zum Beispiel werden menschliche HepG2/C3A-Zellen auf eine Dichte von 6-8 x 106angebaut, oder HEK 293T-Zellen werden auf eine Dichte von 1,3 x 107 pro 100 mm Schale angebaut.
    1. Verwenden Sie für CoA-Bestimmungen routinemäßig doppelte oder dreifache Kulturen. Inkubieren Sie separate Kulturgerichte parallel zu den Probenzellkulturen, um die lebensfähige Zellzahl zu bestimmen. Berechnen Sie die CoA-Menge pro 106-107 Zellen nach HPLC-Reinigung.
  2. Aspirieren Kultur Medium aus dem Teller. Waschen Sie zellen schnell auf der Schale mit eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS), um restliche Mittel zu entfernen und das PBS von der Schale abzusaugen. Waschen Sie Zellen schnell mit eiskaltem Wasser, um Rest-PBS zu entfernen und das Wasser schnell von der Schale abzusaugen. Vermeiden Sie es, die anhaftenden Zellen beim Hinzufügen des PBS oder Wassers zu stören.
  3. Fügen Sie 1 ml eiskaltes Wasser in das Kulturgericht. Die Zellen in das kalte Wasser in der Schale gießen und die Zellsuspension in ein Glasreageröhrchen mit 400 l 0,25 M KOH und 1,5 ml Wasser übertragen.
    1. Mischen Sie die Suspension kräftig durch Wirbel auf hoch für 10 s. Dann mit Paraffinfolie fest abdecken und bei 55 °C 1 h bebrüten, ohne im Wasserbad zu schütteln. Der pH-Wert der Probe sollte 12 betragen. Der hohe pH-Wert ist wichtig, um die CoA-Thioester zu hydrolysieren und kann bei Bedarf mit zusätzlichen Aliquots von KOH eingestellt werden.
  4. Ernten kultivierte Zellen, die in Suspension durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit wachsen: 136 x g für 6 min bei 4 °C. Einmal mit eiskaltem PBS waschen, dann kurz wieder mit kaltem Wasser waschen und schließlich in 2,5 ml kaltem Wasser plus 400 l 0,25 M KOH wieder aufhängen. kräftig mischen und bei 55 °C inkubieren, wie oben beschrieben.
  5. 160 l von 1 M Trizma-HCl und 10 l von 100 mM mBBr hinzufügen und mit Wirbel auf hoch für 10 s mischen. Dadurch erhöht sich der pH-Wert auf ca. 8, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen. Bedecken und bebrüten Proben bei Raumtemperatur für 2 h im Dunkeln, damit der mBBr mit dem Thiol von CoA reagiert.
  6. Fügen Sie 100 l Essigsäure hinzu und mischen Sie mit Wirbel auf hoch für 10 s, um die Reaktion zu stoppen
  7. Zentrifuge bei 2.000 x g für 15 min, um gefällte Zellablagerungen zu entfernen.
  8. Entfernen und speichern Sie Überstand in einem Glas-Reagenzglas für die SPE-Säulenreinigung, die unten beschrieben wird.

4. Extraktion und Ableitung von CoA in Geweben

  1. Sezieren Sie tierische Gewebestücke, etwa 0,5 cm Durchmesser oder kleiner, und bappen Sie kurz (1-2 s) auf saugfähigem Papier und blitzen sie dann in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie bei -80 °C bis zur Verarbeitung. CoA im Gewebe wird hydrolysiert oder in ein Thioester umgewandelt, wenn nicht blitzgefroren. Dieser Schritt ist wichtig, um die maximale Ausbeute von CoA in Geweben zu erhalten.
  2. Wiegen Sie gefrorene Gewebestücke (5 – 60 mg) schnell vor Beginn der Analyse und erfassen Sie das Gewicht für jede Probe. Diese Nassgewichtsbestimmung wird zur Berechnung des CoA-Gehalts nach HPLC-Reinigung verwendet. Vermeiden Sie ein vollständiges Tauen der Gewebestücke.
  3. Fügen Sie 2 ml 1 mM KOH in ein Glas-Reagenzglas (z. B. 13 mm x 100 mm Einweg) zum Einsetzen einer Sonde und Gewebestörung mit einem Rotor-Stator-Homogenisator. Halten Sie die Röhre auf Eis, bis sie verwendet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Proben bei kalter Temperatur homogenisiert werden und CoA nicht durch die während der Homogenisierung erzeugte Wärme zerstört wird.
  4. Gewebe (30 – 40 mg) im Glas-Reagenzglas (mit kalt 1 mM KOH) 30 s übertragen und homogenisieren. Vollständiges Auftauen des Gewebes vermeiden.
  5. Fügen Sie 500 l von 0,25 M KOH hinzu; Wirbel auf hoch für 10 s und auf Eis halten, bis alle Proben homogenisiert sind. Dadurch wird der pH-Wert der Probe über 12 dazu gebracht, die CoA-Thioester zu hydrolysieren, um insgesamt CoA (freie CoA + hydrolysierte CoA-Thioester) zu ergeben.
  6. Inkubieren Sie Proben bei 55 °C für 2 h in einem Wasserbad ohne Schütteln, um die Hydrolyse zu unterstützen.
  7. 150 l von 1 M Trizma-HCl und 10 l von 100 mM mBBr hinzufügen; Wirbel auf hoch für 10 Sekunden. Dies bringt den pH-Wert auf etwa 8, um die mBBr-Reaktion mit freiem CoA zu unterstützen.
  8. Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 2 h im Dunkeln, um sicherzustellen, dass alle CoA mit mBBr ableitet werden.
  9. Fügen Sie 100 l Essigsäure und Wirbel auf hoch für 10 s, um die Reaktion zu stoppen.
  10. Zentrifuge bei 2.000 x g für 15 min, um ausgefällten Zellschutt zu pellet.
  11. Entfernen und speichern Sie Überstand in einem Glas-Reagenzglas für die SPE-Säulenreinigung (siehe unten).

5. Probenreinigung mit Festphasenextraktionssäule (SPE)

  1. Bei Raumtemperatur jede Einweg-2-(2-Pyridyl)-Ethyl-Kieselgelsäule (1 ml Größe) mit 1 ml Waschpuffer ausdemieren, um sicherzustellen, dass die Pyridylfunktionsgruppe protoniert ist und als Anionenaustauscher fungiert. 2-(2-pyridyl)-ethyl kieselsäuregel ist ein schwacher Anionenaustauscher, der ideal für CoA-Bimane bei einem grundlegenden pH-Wert ist. 2-(2-pyridyl)-ethyl-silgeligel hat eine pKa von 6 und die Elution erfolgt pH-Wert 7.
  2. Fügen Sie Probe überstand (Schritt 4.11) zur Spalte hinzu und sammeln Sie Eluat.
  3. Waschen Sie die Säule zweimal mit 1 ml Waschpuffer, um alle nicht zurückgehaltenen Arten zu entfernen.
  4. Säule einmal mit 1 ml Wasser waschen.
  5. Säule zweimal mit 1 ml Elution Buffer in ein separates Glas-Reagenzglas (12 mm x 75 mm) waschen, um den CoA-Bimane zu sammeln.
  6. Trockene CoA-Bimane Probe in Rohr unter Stickstoffgas bis trocken. Die getrocknete Probe ist bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung stabil. Versiegeln und vollständig abdecken das Rohr und speichern.
  7. Wenn Sie für die HPLC-Analyse bereit sind, setzen Sie die Probe in 300 l Wasser wieder auf und mischen Sie sie kräftig durch Wirbel auf hoch für 10 s.
  8. Resuspendierte Probe in einen Zentrifugenrohrfilter (0,22 m Celluloseacetat, 2 ml Größe) und Zentrifuge bei 5.000 x g für 10 min übertragen, um jeglichen Niederschlag zu entfernen.
  9. Gefilterte Probe in eine Glasdurchstechflasche für die HPLC-Injektion geben.

6. HPLC-Reinigung und Messung von CoA-Bimane

  1. Bereiten Sie Puffer vor. Puffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Puffer B: Acetonitril (Optima Grade).
  2. Schalten Sie das HPLC-System ein.
    HINWEIS: Das HPLC-System in unserem Labor ist ein Waters e2695 Separations Modul, das mit einem 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Absorptionsdetektor und einem 2475 Fluoreszenzdetektor ausgestattet ist, der mit der Empower 3 Software gesteuert wird. Das System verfügt auch über einen automatisierten Probeninjektor.
  3. Injizieren Sie jede Probe (z.B. 20 l) zur Trennung an einer Gemini C18, 3 m 100 , 4,6 mm x 150 mm Säule mit dem Programm in Tabelle 1 mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min. Die Säulentemperatur beträgt 25 °C. Messen Sie die UV/Sichtbare Detektorabsorption bei 393 nm und die Fluoreszenzdetektion bei 393 nm, die - mit 470 nm. Die Retentionszeit wird durch Ausführen einer CoA-Bimane-Standardkurve vor jedem Satz von Samples bestimmt.
  4. Zeichnen Sie die Fläche unter dem CoA-Bimane-Peak für jede Probe auf und vergleichen Sie sie mit der Standardkurve, um Pmol von CoA-Bimane zu berechnen, das in die HPLC-Säule injiziert wurde. Die CoA-Bimane Absorptionsstandardkurve wird für Gewebeproben und die CoA-Bimane-Fluoreszenz-Standardkurve für Gewebekulturproben verwendet.
  5. Da die CoA-Bimane-Werte die gesamte CoA für jede Probe darstellen, normalisieren Sie sich auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen für Kulturproben oder mg-Nassgewicht für Gewebeproben(Abbildung 6). Berechnen Sie alternativ die gesamten CoA-Werte nach normalisierter DNA- oder Proteingehalt für jede Probe. Der DNA- oder Proteingehalt kann separat anhand von Proben-Aliquots bestimmt werden, die während der Probenvorbereitung vor der KOH-Zugabe entfernt werden.

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Ergebnisse

Eine relativ schnelle und zuverlässige Methode zum Nachweis von CoA-Gesamtinkulturzellen und Geweben wurde entwickelt, indem das Thiol von CoA mit mBBr zu einem Fluoreszenzmittel ableitet und dann das derivatisierte CoA-Bimane mit Reverse-Phase-HPLC gereinigt wird. Zunächst wird eine Standardkurve erzeugt, bei der bekannte und steigende Mengen des CoA-Bimane-Standards einzeln injiziert werden und die Bereiche unter den Spitzen in den CoA-Bimane-Chromatogrammen in Abhängigkeit vom Eingang CoA-bimane(A...

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Diskussion

Hier zeigen wir ein zuverlässiges, schrittweises Verfahren zur Quantifizierung von CoA-GesamtcoA in Zellen und tierischen Geweben mit einer breiten Palette linearer Detektion, die in vielen Laboratorien zugänglich ist, die über einen HPLC mit einem Absorptions- oder Fluoreszenz-Ausgangsdetektor verfügen. Alternativ ist die Massenspektrometrie eine gängige Technik zur Bewertung von CoA- und CoA-Thioestern, ist aber aufgrund der Kosten der Instrumentierung und des für die Entwicklung der Methodik und der Interpretation von...

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Offenlegungen

MWF, CS und SJ schrieben das Papier, MWF und CS stellten die Daten und Zahlen zur Verfügung, COR entwarf die Experimente und überprüfte das Manuskript kritisch. SJ und COR sind Erfinder einer anhängigen Patentanmeldung (PCT/US17/39037) "Kleine Molekülmodulatoren von Pantothenat-Kinasen" des St. Jude Children es Research Hospital, die die in diesem Artikel genannte PZ-2891-Verbindung abdeckt.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die Finanzierung von gesponserter Forschung, die von CoA Therapeutics, Inc., einer Tochtergesellschaft von BridgeBio LLC, dem National Institutes of Health Grant GM34496 und den American Lebanese Syrian Associated Charities bereitgestellt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-(2-Pyridyl)-ethyl-Kieselgel SPE-SäuleMillipore-Sigma54127-U
Coenzym AAvanti Polare Lipide870700
Gemini C18 3 μ m 100 & Aring; HPLC-SäulePhenomenex00F-4439-E0
MonobromobimanThermoFisherScientific M-1378
Omni-Tip Sonde GewebedisruptorOmni International32750H
ParafilmFisherS37440
PowerGen 125 motorisierter Rotor-Stator-HomogenisatorThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X ZentrifugenrohrfilterCoStar8161
Trizma-HClFisherT395-1
Wasser 2475 FluoreszenzdetektorWasser2475
Wasser 2489 UV-Vis DetektorWasser2489
Wasser e2695 TrennmodulWassere2695

Referenzen

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Coenzym A QuantifizierungFestphasenextraktionHPLC AnalysemBBr DerivatisierungKaliumhydroxid HydrolyseZellkulturpr parationGewebehomogenisierungFluoreszenzdetektionStandardkurvenanalyseCoA Thioester Messung

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