Iboende uorden domæner er vigtige for onkogen fusion transskription faktor funktion. For terapeutisk at målrette disse proteiner er det nødvendigt med en mere detaljeret forståelse af de reguleringsmekanismer, der anvendes af disse domæner. Her bruger vi transcriptomics til at kortlægge vigtige strukturelle træk ved det iboende uordnede EWS-domæne i Ewing sarkom.
Mange kræftformer er karakteriseret ved kromosomale translokationer, som resulterer i udtryk for onkogen fusion transskription faktorer. Disse proteiner indeholder typisk et iboende uordnet domæne (IDD), der er smeltet sammen med DNA-bindende domæne (DBD) af et andet protein og orkestrerer udbredte transskriptionelle ændringer for at fremme malignitet. Disse fusioner er ofte den eneste tilbagevendende genomiske aberration i de kræftformer, de forårsager, hvilket gør dem attraktive terapeutiske mål. Men målretning onkogen transskription faktorer kræver en bedre forståelse af den mekanistiske rolle, lav kompleksitet, IDD’er spiller i deres funktion. EWSR1’s N-terminaldomæne er et IDD, der er involveret i en række onkogene fusionstransskriptionsfaktorer, herunder EWS/FLI, EWS/ATF og EWS/WT1. Her bruger vi RNA-sekventering til at undersøge de strukturelle træk ved EWS-domænet, der er vigtige for ews/ FLI’s transskriptionsfunktion i Ewing sarkom. Første shRNA-medierede udtømning af den endogene fusion fra Ewing sarkomceller parret med ektopisk udtryk for en række EWS-mutant konstruktioner udføres. Derefter RNA-sekventering bruges til at analysere transcriptomes af celler, der udtrykker disse konstruktioner til at karakterisere de funktionelle underskud forbundet med mutationer i EWS domæne. Ved at integrere transskriptoriske analyser med tidligere offentliggjorte oplysninger om EWS/FLI DNA-bindende motiver og genomisk lokalisering samt funktionelle analyser til transformering af evne, var vi i stand til at identificere strukturelle træk ved EWS/FLI, der er vigtige for onkogenese, og definere et nyt sæt EWS/FLI-målgener, der er afgørende for Ewing sarkom. Dette papir viser brugen af RNA-sekventering som en metode til at kortlægge struktur-funktion forholdet mellem den iboende uorden domæne onkogen transskription faktorer.
En delmængde af kræftformer, herunder mange maligniteter i barndommen og ungdommen, er karakteriseret ved kromosomale translokationer, der genererer ny fusion oncogenes1,2,3,4,5,6. De resulterende fusion proteiner ofte fungerer som onkogen transskription faktorer, orkestrere udbredte ændringer i transskription regulering til fremme tumorigenese7,8. Kræftformer med disse translokationer almindeligvis besidder en ellers stille mutationslandskab, med få tilbagevendende genomiske afvigelser bortset fra patognomonic fusion4,9. Som sådan er direkte rettet mod fusionsproteinet en attraktiv terapeutisk strategi i disse sygdomme. Disse onkogne transskriptionsfaktorer består dog ofte af et lavkompleksitet, iboende uordnet, transskriptionsaktiverende domæne, der er smeltet sammen med et DNA-bindende domæne (DBD)10,11,12,13,14. Både de iboende uordnede domæner (IDD’er) og DBD’er af disse proteiner har vist sig vanskelige at målrette mod med konventionelle farmakologiske tilgange. Udvikling af nye terapeutiske tilgange kræver derfor en mere detaljeret molekylær forståelse af de mekanismer, der anvendes af disse fusioner til afvigende at regulere genekspression.
N-terminal IDD del af EWSR1 er almindeligt smeltet til en DBD i kræft, herunder EWS / FLI i Ewing sarkom, EWS / WT1 i diffus lille runde celle tumor, og EWS / ATF1 i klar celle sarkom af bløde dele10. Ews IDD’s mekanistiske rolle i hver af disse fusioner er ufuldstændigt forstået. EWS/ETS-fusionens familie, specielt EWS/FLI, er den mest funktionelt karakteriserede til dato. EWS/FLI koordinerer genomom-dækkende epigenetiske og transskriptionelle ændringer , der fører til aktivering og undertrykkelse af tusindvis af gener7,11,15,16. Undersøgelser har vist, at IDD er vigtig for rekrutteringen af både transskriptionelle medaktivatorer (såsom p300, WDR5 og BAF-komplekset) samt co-repressorer (såsom NuRD-komplekset)11,15,17. Sammensmeltningen af EWS IDD til C-terminaldelen af FLI1 giver et nyt DNA-bindende specificitet til ETS DBD af FLI1, således at fusion oncoprotein (EWS/FLI) binder sig til gentagne GGAA-mikrosatellit regioner i genomet ud over konsensus ETS motiv18,19,20. Kombineret med co-activator rekruttering funktion, denne emergent DNA-bindende aktivitet EWS/FLI fremmer de novo forstærker dannelse på GGAA-microsatellites distal til transskription start sites (TSS) (“forstærker-lignende” mikrosatellitter) og rekrutterer RNA polymerase II at fremme transskription på GGAA-microsatellites proksimale til TSS (“promotor-lignende” mikrosatellitter)11,15,16,21.
Samlet set førte disse data os til at antage, at diskrete elementer inden for EWS-området bidrager til rekrutteringen af forskellige medregulatorer til forskellige typer EWS / FLI-bindingssteder. Men kræsne disse elementer inden for EWS del af EWS / FLI, og hvordan de fungerer, er blevet hæmmet af den meget gentagne og uordnede karakter af domænet. Her bruger vi et tidligere offentliggjort knockdown-redningssystem i Ewing sarkomceller til funktionelt at kortlægge disse elementer i EWS IDD. I dette system er EWS/FLI udtømt ved hjælp af en shRNA rettet mod 3’UTR af FLI1-genet, og ekspressionen reddes med varierende EWS /FLI mutant cDNA-konstruktioner, der mangler 3’UTR7,17,22. Disse eksperimenter fokuserede på konstruktioner med forskellige sletninger for at kortlægge strukturfunktionsforholdet mellem EWS IDD og vigtige onogene fænotyper, herunder aktivering af en GGAA-mikrosatellit reporterkonstruktion, kolonidannelsesanalyser og målrettet validering af EWS / FLI-aktiverede og -undertrykte gener7,17,22 . Disse undersøgelser fandt imidlertid ikke diskrete underdomæner inden for EWS IDD i EWS/FLI, som er entydigt vigtige for enten aktivering eller undertrykkelse. Alle testede konstruktioner var enten i stand til både at aktivere og undertrykke specifikke målgener, hvilket førte til effektiv kolonidannelse eller ude af stand til at regulere nogen af EWS / FLI-målgener, hvilket førte til tab af kolonidannelse7,17,22.
Transskriptoriske analyser, der er muliggjort af den udbredte indførelse af den næste generations sekventering, anvendes ofte til at sammenligne genekspressionssignaturer under to forhold, ofte i forbindelse med screening eller beskrivende undersøgelser. Vi ønskede i stedet at udnytte evnen til at fange genom-dækkende udtryksdata ved hjælp af RNA-sekventering (RNA-seq) til at karakterisere bidrag fra IDD’er til transskription faktor funktion. I dette tilfælde er RNA-seq parret med knockdown-redningssystemet for at udforske strukturfunktionsforholdet mellem EWS-domænet. Denne tilgang gælder for andre fusion transskription faktorer, herunder andre EWS fusioner eller wildtype transskription faktorer med dårligt forstået funktion, og har flere fordele i forhold til de andre assays, der anvendes til funktionelle kortlægning undersøgelser, såsom reporter assays eller målrettet qRT-PCR. Disse omfatter afprøvning af strukturelle determinanter for funktion i den relevante kromatinkontekst, evnen til at teste flere typer responselementer i en analyse (dvs. aktiverede og undertrykte, GGAA-mikrosatellit og ikke-mikrosatellit osv.) og den resulterende evne til bedre at opdage delvis funktion.
En vellykket gennemførelse af denne tilgang afhænger af et cellebaseret system, der indfanger interessefænotyperne (i dette tilfælde A673-celler med shRNA-medieret EWS/FLI-udtømning), og et panel af mutantkonstruktioner i en ekspresvektor, der passer til det cellebaserede system (i dette tilfælde pMSCV-hygro med forskellige 3x-FLAG-mærkede EWS/FLI-mutanter, der skal leveres ved retroviral transduktion). Viral transduktion af enten CRISPR-baserede udtømning konstruktioner, shRNA-baserede udtømning konstruktioner, og cDNA udtryk konstruktioner med passende valg til at generere stabile celle linjer anbefales over forbigående transfection. Downstream fortolkning af resultater styrkes, når transcriptomic data kan parres med andre data i forbindelse med lokalisering af transskription faktor og andre fænotypiske udlæsninger, hvor det er muligt.
I dette papir anvender vi denne tilgang til at karakterisere aktiviteten af DAF mutant af EWS / FLI14. DAF mutant har 17 tyrosin til alanin mutationer i de gentagne regioner i EWS IDD af EWS / FLI14. Denne særlige EWS mutant var tidligere blevet rapporteret og er ude af stand til at aktivere reporter genekspression, når smeltet til ATF1 DBD14. Foreløbige qRT-PCR-data antydede imidlertid , at denne mutant var i stand til at aktivere transskription af EWS/FLI-målet NR0B123. Den transskriptomiske tilgang, der er beskrevet her, muliggjorde en vellykket påvisning af DAF-mutantens delvise funktion. Ved at parre disse transskriptomiske data med oplysninger om EWS/FLI bindings- og genkendelsesmotiver viser vi yderligere, at DAF-mutanten bevarer funktionen ved GGAA-microsatellit repeats. Disse resultater identificerer DAF som den første delvist funktionelle EWS/FLI mutant og fremhæver funktion på ikke-mikrosatellit gener som vigtigt for onkogenese (som rapporteret23). Dette viser styrken af denne transskriptomiske struktur-funktion kortlægning tilgang til at give indsigt i funktionen af onkogen transskription faktorer.
Undersøgelse af de biokemiske mekanismer af onkogne transskription faktorer er af afgørende betydning for at forstå de sygdomme, de forårsager, og at designe nye terapeutiske strategier. Dette gælder især i maligniteter karakteriseret ved kromosomtranslokationer, der resulterer i fusionstransskriptionsfaktorer. De domæner, der indgår i disse kimærproteiner , kan mangle meningsfulde interaktioner med reguleringsområder , der findes i de vilde proteiner, hvilket komplicerer evnen til at fortolke strukturfunktionsoplysninger i forbindelse med fusion26,27,28. Desuden er mange af disse onkogene fusioner karakteriseret ved lav kompleksitet i sig selv uorden domæner10,13,29,30.
EWS-domænet er et eksempel på et sådant iboende uordnet domæne, der er involveret i en række onkogene fusioner10. Den iboende uordnede og gentagne karakter har hindret bestræbelserne på at forstå de molekylære mekanismer, der anvendes af EWS-domænet. Tidligere bestræbelser på at undersøge strukturfunktionen har i vid udstrækning tyet til at bruge forskellige mutanter i forbindelse med reporter genanalyser eller i celle baggrunde, der undlader at generobre den relevante cellulære sammenhæng, eller mangler strukturelle variationer, der producerer meningsfuld delvis funktion11,17,25. Den metode, der præsenteres her, behandler disse problemer. Strukturfunktionskortlægning udføres i en sygdomsrelevant cellekontekst, og næste generations sekventering gør det muligt for transskriptom profilering at evaluere transskriptionsfaktorfunktion i indstillingen af native chromatin. I det specifikke tilfælde af DAF mutant af EWS / FLI, DAF blev rapporteret at vise lidt aktivitet i reporter assays ved hjælp af isolerede respons elementer, men at vise aktivitet i forbindelse med den fulde gen promotor, enten i en reporter assay eller i hjemmehørende kromatin, hvilket tyder på en interessant fænotype23. Ved hjælp af den metode, der er beskrevet her mere direkte løser spørgsmålet om, hvilken type lovgivningsmæssige elementer på tværs af genomet er mest lydhøre i sygdomsindstillingen. Ved at teste alle kandidatmål gener i deres oprindelige kromatin sammenhæng samtidigt, en transskriptomisk tilgang er mere tilbøjelige til at identificere konstruktioner med delvis funktion.
Den iboende styrke ved at bruge en sygdomsrelevant cellebaggrund er måske den største begrænsning af denne teknik. En af de vigtigste faktorer er at vælge det relevante cellesystem til disse eksperimenter. Mange cellelinjer afledt af maligniteter med patognomoniske transskription faktorer ikke let tolerere knockdown af denne transskription faktor, og i mange tilfælde, især for pædiatriske kræftformer, den sande celle af oprindelse er stadig kontroversielt og udtryk for onkogen i andre celle baggrunde er uoverkommeligt giftige31,32 . I disse tilfælde kan det være nyttigt at udføre eksperimenter i en anden cellebaggrund, så længe forskeren udviser forsigtighed i fortolkningen af resultater og validerer passende alle relevante fund i en mere sygdomsrelevant celletype.
Det er af afgørende betydning omhyggeligt at validere stabiliteten og de fænotypiske konsekvenser af onkogenes udtryk og kun indsende prøver til sekventering, der opfylder strenge kriterier. Her omfattede dette western blot for at bekræfte knockdown og redning og qRT-PCR af et lille antal kendte målgener for at validere den positive kontrol (Figur 2). Det er ligeledes afgørende at reducere så meget batchvariation som muligt ved omhyggeligt at udføre cellen og RNA præparater så samme som muligt gennem hvert parti.
Den metode, der er beskrevet her, bliver særlig kraftfuld, når den kombineres med andre typer genomdata, der taler til genomom-dækkende funktion af transskription faktor under undersøgelse. Fremtidige retninger for denne type strukturfunktionsanalyse vil udvides til at omfatte ChIP-seq og ATAC-seq for at bestemme bindingen af transskriptionsfaktoren og eventuelle inducerede ændringer i kromatinstilgængeligheden. Som en suite kan denne type data pege på, hvor forskellige strukturelle komponenter i en onogen transskription faktor bidrager til forskellige aspekter af funktion (dvs. DNA-binding vs chromatin modifikation vs. co-regulator rekruttering). Samlet set kan brug af NGS-baserede tilgange til at kortlægge strukturfunktionsrelationerne mellem fusionstransskriptionsfaktorer afsløre ny indsigt i de biokemiske determinanter for disse proteiners onogene funktion. Dette er vigtigt for at fremme vores forståelse af de sygdomme, de forårsager, og for at muliggøre udviklingen af nye terapeutiske strategier.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af High Performance Computing Facility på Abigail Wexner Research Institute på Nationwide Children’s Hospital. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health National Cancer Institute [U54 CA231641 til SLL, R01 CA183776 til SLL]; Alex’s Lemonade Stand Foundation [Young Investigator Award til ERT]; Pelotonia [Fællesskab til ERT]; og National Health and Medical Research Council CJ Martin Overseas Biomedical Fellowship [APP1111032 til KIP].
Wet Lab Reagents | |||
anti-FLI rabbit pAb | Abcam | ab15289 | 1:500 |
anti-lamin B1 rabbit pAb | Abcam | ab16048 | 1:2000 |
Cell-based system for introduction of mutant constructs | Determined by cell system used | ||
Cryotubes | For viral aliquots | ||
DMEM | Corning Cellgro | 10-013-CV | For viral production |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | For viral production |
G418 | ThermoFisher | 10131027 | For viral production |
HEK293-EBNAs | ATCC | CRL-10852 | For viral production |
HEPES | Gibco | 15630106 | |
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
M2 anti-FLAG mouse mAb | Sigma | F3165 | 1:2000 |
Near IR-secondary antibodies | Li-Cor | ||
Optimem | Gibco | 31985062 | For viral production |
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | For viral production |
Polybrene | Sigma | TR-1003-G | For viral transduction |
Puromycin | Sigma | P8833 | Stored at 2 mg/mL stock |
RNeasy Plus kit | Qiagen | 74136 | Has gDNA removal columns |
Selection reagents | As dictated by cell system used | ||
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | For viral production |
Tissue culture media | Determined by cell system used | ||
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2304 | For viral production |
Software | |||
Access to HPC environment | |||
AnnotationDbi | 1.38.2 | ||
Cairo | 1.5-10 | ||
DESeq2 | 1.16.1 | ||
genefilter | 1.58.1 | ||
ggbiplot | 0.55 | ||
ggplot2 | 3.1.1 | ||
org.Hs.eg.db | 3.4.1 | ||
pheatmap | 1.0.12 | ||
PuTTY | |||
R | 3.4.0 | ||
RColorBrewer | 1.1-2 | ||
reshape2 | 1.4.3 | ||
rgl | 0.100.19 | ||
R-studio | |||
STAR | Version 2.6 or later | ||
sva | 3.24.4 | ||
TrimGalore! | |||
WinSCP |