본질적으로 무질서한 도메인은 온코겐융합 전사 인자 기능에 중요합니다. 이러한 단백질을 치료적으로 표적으로 하기 위해서는 이러한 도메인에 의해 사용되는 규제 메커니즘에 대한 보다 상세한 이해가 필요합니다. 여기서는 전사학을 사용하여 유잉 육종에서 본질적으로 무질서한 EWS 도메인의 중요한 구조적 특징을 매핑합니다.
많은 암은 종양 발생 융합 전사 인자의 발현을 초래하는 염색체 전좌를 특징으로합니다. 전형적으로, 이들 단백질은 다른 단백질의 DNA 결합 도메인(DBD)과 융합된 본질적으로 무질서한 도메인(IDD)을 포함하고 악성종양을 촉진하기 위해 광범위한 전사 변화를 조율한다. 이 융합은 수시로 그(것)들이 일으키는 원인이 되는 암에 있는 유일한 반복하는 게놈 수차, 그(것)들을 매력적인 치료 표적을 만드는. 그러나 종양 유발 전사 요인을 대상으로하려면 복잡성이 낮고 IDD가 함수에서 재생하는 기계론적 역할에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. EWSR1의 N 단말 도메인은 EWS/FLI, EWS/ATF 및 EWS/WT1을 포함한 다양한 온코겐 융합 전사 인자에 관여하는 IDD입니다. 여기서, 우리는 유잉 육종에서 EWS/FLI의 전사 기능에 중요한 EWS 도메인의 구조적 특징을 조사하기 위해 RNA-시퀀싱을 사용합니다. 다양한 EWS 돌연변이 구조의 자궁 발현과 결합된 유잉 육종 세포로부터내생 융합의 첫 번째 shRNA 매개 고갈이 수행된다. 그런 다음 RNA-시퀀싱은 EWS 도메인내의 돌연변이와 관련된 기능적 적자를 특성화하기 위해 이러한 구조를 발현하는 세포의 전사를 분석하는 데 사용된다. 전사 분석을 EWS/FLI DNA 결합 모티프 및 게놈 국소화에 대한 이전에 발표된 정보와 통합하여, 기능적 특성화를 위한 기능적 분석뿐만 아니라, 온우주발생에 중요한 EWS/FLI의 구조적 특징을 파악하고 유동 육종에 중요한 EWS/FLI 표적 유전자의 새로운 세트를 정의할 수 있었습니다. 본 논문은 RNA-시퀀싱을 본질적으로 무질서한 온코겐 전사 인자의 구조 기능 관계를 매핑하는 방법으로 서열화하는 방법을 보여줍니다.
유년기와 사춘기의 많은 악성을 포함하는 암의 하위 집합은 새로운 융합 온코진1,2,3,4,5,6을생성하는 염색체 전좌를 특징으로 합니다. 결과 융합 단백질은 종양발생7,8을촉진하기 위해 전사 조절의 광범위한 변화를 조율하면서 종양 발생 요인으로 자주기능한다. 이러한 전좌를 가진 암은 일반적으로 병상 융합4,9를제외하고 몇몇 반복되는 게놈 수차와 함께, 그렇지 않으면 조용한 돌연변이 풍경을 가지고 있습니다. 따라서 융합 단백질을 직접 표적으로 하는 것은 이러한 질환에서 매력적인 치료 전략이다. 그러나, 이러한 온코인성 전사 인자는 일반적으로 낮은 복잡성, 본질적으로 무질서한, DNA 결합 도메인(DBD)과 융합된 전사활성 도메인(DBD)10,11,12,13,14로구성된다. 이 단백질의 본질적으로 무질서한 도메인 (IDDs) 및 DBDs 는 전통적인 약리학적 접근을 표적으로 하기 어려운 입증되었습니다. 새로운 치료 접근법의 개발은, 그러므로, 유전자 발현을 비정상적으로 조절하기 위하여 이 융합에 의해 채택된 기계장치의 더 상세한 분자 이해가 필요합니다.
EWSR1의 N-말단 IDD 부분은 일반적으로 유잉 육종의 EWS/FLI, 확산 소둥근 세포 종양의 EWS/WT1, 그리고 소프트파트(10)의명확한 세포 육종에서 EWS/ATF1을 포함한 암에서 DBD에 일반적으로 융합된다. 이러한 융합의 각각에서 EWS IDD의 기계적인 역할은 불완전하게 이해된다. EWS/ETS 융합 제품군, 특히 EWS/FLI는 현재까지 가장 기능적으로 특징적입니다. EWS/FLI는 게놈 전체 후생유전학 및 전사적 변화를 조정하여 수천 개의유전자7,11,15,16의활성화 및 억압으로 이어진다. 연구 결과에 따르면 IDD는 전사 공동 활성화제(예: p300, WDR5 및 BAF 단지)와 공동 억압자(예: NuRD 복합체)11,15, 17의모집에중요하다는 것을보여주었습니다. FLI1의 C-말단 부분에 EWS IDD의 융합은 FLI1의 ETS DBD에 새로운 DNA 결합 특이성을 부여하며, 융합 온코단백질(EWS/FLI)은 합의 ETS 모티프18,19,20에추가하여 게놈의 반복적인 GGAA-마이크로위성 영역에 결합한다. 공동 활성화자 모집 기능과 결합, EWS/FLI의 이러한 새로운 DNA 결합 활동은 GGAA-마이크로위성에서 드 노보 증강을 촉진하여 전사 시작 사이트(TSS)(TSS)(“증강제 유사” 마이크로위성)에 불경하게 작용하고, RNA 폴리머라제 II를 모집하여 GGAA-마이크로위성에서 TSS(“프로모터와 같은”11,111)마이크로위성에서 전사를 촉진합니다.
종합하면, 이러한 데이터는 EWS 도메인 내의 개별 요소가 EWS/FLI 바인딩 사이트의 다른 유형에 대한 고유한 공동 규제 기관의 모집에 기여한다는 가설을 주도했습니다. 그러나 EWS/FLI의 EWS 부분 내에서 이러한 요소를 분별하고 어떻게 작동하는지 파악하는 것은 도메인의 매우 반복적이고 무질서한 특성에 의해 방해되었습니다. 여기서 우리는 EwS IDD에서 이러한 요소를 기능적으로 매핑하기 위해 Ewing 육종 세포에서 이전에 출판 된 녹다운 구조 시스템을 활용합니다. 본 시스템에서 EWS/FLI는 FLI1 유전자의 3’UTR을 표적으로 하는 shRNA를 이용하여 고갈되고, 발현은 3’UTR7,17,22가부족한 다양한 EWS/FLI 돌연변이 cDNA 구조로 구출된다. 이러한 실험은 GGAA-마이크로위성 기자 구성, 식민지 형성 분석, EWS/FLI 활성화 및 억압유전자7,17,22의 표적 검증을 포함하여 EWS IDD와 중요한 종양발생 표현형 사이의 구조 기능 관계를 매핑하는 다양한 삭제를 가진 구조에 초점을 맞춘실험입니다. . 그러나 이러한 연구는 EWS/FLI의 EWS IDD 내에서 이산 하위 도메인을 찾지 못해 활성화 또는 억압에 매우 중요합니다. 모든 시험된 구조물은 특정 표적 유전자를 활성화하고 억압할 수 있었고, 효율적인 식민지 형성으로 이어지거나, EWS/FLI 표적 유전자중 하나를 조절할 수 없었으며, 식민지 형성7,17,22의손실로 이어졌다.
차세대 시퀀싱의 광범위한 채택에 의해 활성화된 전사 분석은 일반적으로 스크리닝 또는 설명 연구의 맥락에서, 두 가지 조건에서 유전자 발현 서명을 비교하는 데 사용됩니다. 대신 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 게놈 전체 발현 데이터를 캡처하여 전사 인자 기능에 IDD의 기여를 특성화하고자 했습니다. 이 경우 RNA-seq는 녹다운 구조 시스템과 결합되어 EWS 도메인의 구조 기능 관계를 탐구합니다. 이 접근법은 다른 EWS 융합 또는 제대로 이해되지 않은 기능을 가진 야생 형 전사 인자를 포함한 다른 융합 전사 인자에 적용되며 기자 소사 또는 표적 qRT-PCR과 같은 기능 매핑 연구에 사용되는 다른 저술보다 여러 가지 장점이 있습니다. 여기에는 관련 크로마틴 컨텍스트에서 함수의 구조적 결정요인 테스트, 하나의 분석법(예: 활성화 및 억압, GGAA-마이크로위성 및 비마이크로위성 등)에서 여러 유형의 반응 요소를 테스트하는 기능, 부분 기능을 더 잘 검출할 수 있는 능력이 포함됩니다.
이 접근법의 성공적인 구현은 관심표현형을 포착하는 세포 기반 시스템(이 경우 shRNA 매개 EWS/FLI 고갈을 가진 A673 세포) 및 세포 기반 시스템에 적합한 발현 벡터에서 돌연변이 구조패널(이 경우, 다양한 3x-FLAG 태그-EWS/FLI 돌연변이를 가진 pMSCV-hygro)에 의존한다. CRISPR 기반 고갈 구문, shRNA 기반 고갈 구조 및 안정적인 세포주를 생성하는 적절한 선택으로 cDNA 발현 구문 중 하나의 바이러스 성 변환은 과도 의 과도 연산에 권장됩니다. 전사 데이터의 다운스트림 해석은 전사 계수및 사용 가능한 다른 현상제 판독기의 국소화와 관련된 다른 데이터와 결합될 수 있을 때 강화됩니다.
이 문서에서는 EWS/FLI14의DAF 돌연변이의 활성을 특성화하기 위해 이 방법을 적용합니다. DAF 돌연변이체는 EWS/FLI14의EWS IDD의 반복적인 영역에서 알라닌 돌연변이에 17개의 티로신을 갖는다. 이러한 특정 EWS 돌연변이는 이전에 보고되었으며 ATF1 DBD14에융합될 때 기자 유전자 발현을 활성화할 수 없다. 그러나, 예비 qRT-PCR 데이터는 이 돌연변이가 EWS/FLI 표적 NR0B123의전사를 활성화할 수 있었다는 것을 건의했다. 여기에 설명된 전사적 접근 법은 DAF 돌연변이의 부분 기능을 성공적으로 검출할 수 있게 해 주었다. 이러한 전사 데이터를 EWS/FLI 바인딩 및 인식 모티프에 대한 정보와 페어링함으로써 DAF 돌연변이가 GGAA 마이크로위성 반복에서 기능을 유지한다는 것을 더욱 보여줍니다. 이러한 결과는 DAF를 첫 번째 부분 기능 EWS/FLI 돌연변이체로 식별하고 비마이크로위성 유전자에서 의 기능을 종양 발생에 중요하게 식별합니다(보고된23). 이것은 온코겐 전사 요인의 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해이 전사 구조 기능 매핑 접근 방식의 힘을 보여줍니다.
온코겐 전사 요인의 생화학 적 메커니즘을 연구하는 것은 그들이 일으키는 질병을 이해하고 새로운 치료 전략을 설계하는 데 매우 중요합니다. 이것은 융합 전사 인자 결과로 염색체 전좌를 특징으로 하는 악성에서 특히 사실이다. 이러한 키메라 단백질에 포함된 도메인은 야생형 단백질에 존재하는 조절 도메인과 의미 있는 상호 작용이 부족할 수 있으며,융합(26,27,28)의맥락에서 구조 기능 정보를 해석하는 능력을 복잡하게 만든다. 더욱이, 이러한 온코겐성 융합의 대부분은 본질적으로 무질서한 도메인10,13,29,30의낮은 복잡성을 특징으로 한다.
EWS 도메인은 다양한 온코겐성융합(10)에관여하는 본질적으로 무질서한 도메인의 예입니다. 본질적으로 무질서하고 반복적인 성격은 EWS 도메인에 의해 채택된 분자 기계장치를 이해하는 노력을 방해했습니다. 구조 기능을 조사하기 위한 사전 노력은 주로 관련 세포 맥락을 재구성하지 못하는 기자 유전자 해석의 맥락이나 세포 배경에서 상이한 돌연변이를 사용하거나 의미 있는 부분기능(11,17,25)을생성하는 구조적 변이가 결여되어 있다. 여기에 제시된 메서드는 이러한 문제를 해결합니다. 구조 기능 매핑은 질병 관련 세포 컨텍스트에서 수행되며 차세대 시퀀싱을 통해 전사 프로파일링을 통해 네이티브 크로마틴 설정에서 전사 인자 기능을 평가할 수 있습니다. EWS/FLI의 DAF 돌연변이의 특정 사례에서, DAF는 분리된 반응 요소를 사용하여 리포터 분석에서 거의 활성을 보여주지 만, 기자 분석또는 네이티브 크로마틴에서 전체 유전자 프로모터의 맥락에서 활성을 나타내기 위해 흥미로운표현형(23)을시사한다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 게놈 전반에 걸쳐 어떤 유형의 조절 요소가 질병 환경에서 가장 반응성이 있는지에 대한 질문을 보다 직접적으로 해결합니다. 네이티브 크로마틴 컨텍스트에서 모든 후보 대상 유전자를 동시에 테스트함으로써 전사적 접근법은 부분 기능을 가진 구조를 식별할 가능성이 더 높습니다.
질병 관련 세포 배경을 사용하는 내재된 강점은 아마도 이 기술의 가장 큰 한계일 것입니다. 가장 중요한 요인 중 하나는 이러한 실험에 적합한 세포 시스템을 선택하는 것입니다. 병상 전사 인자를 가진 악성에서 파생된 많은 세포주는 그 전사 인자의 녹다운을 쉽게 용납하지 않으며, 많은 경우에, 특히 소아암의 경우, 기원의 진정한 세포는 논란의 여지가 있으며 다른 세포 배경에서 종양유전자의 발현은 엄청나게독성이 31,32입니다. . 이러한 경우에, 연구원이 결과의 해석에 주의를 기울이고 보다 질병 관련 세포 모형에 있는 어떤 관련 사실 인정든지 적절하게 유효성을 검사하는 한, 다른 세포 배경에서 실험을 수행하는 것이 유용할 수 있습니다.
종양 유전자의 발현의 안정성과 표현성 결과를 신중하게 검증하고 엄격한 기준을 충족하는 시퀀싱을 위한 시료만 제출하는 것이 매우 중요합니다. 여기서, 여기에는 소수의 알려진 표적 유전자의 녹다운 및 구조, qRT-PCR을 확인하기 위해 서체 블롯을 포함하여 양성 대조군(도2)을검증하였다. 각 배치를 통해 가능한 한 세포 및 RNA 제제를 가능한 한 유사하게 수행함으로써 가능한 한 많은 배치 가변성을 감소하는 것이 중요합니다.
여기에서 기술된 방법은 연구 중인 전사 인자의 게놈 전체 기능에 말하는 다른 유형의 게놈 데이터와 결합될 때 특히 강력해집니다. 이러한 유형의 구조 기능 분석에 대한 향후 방향은 ChIP-seq 및 ATAC-seq를 포함하도록 확장되어 전사 계수의 결합과 크로마틴 접근성의 유도된 변화를 결정할 것입니다. 제품군으로서 이러한 유형의 데이터는 온코겐 전사 요인의 다른 구조 구성 요소가 기능의 다양한 측면(즉, DNA 바인딩 대 크로마틴 수정 대 공동 레귤레이터 모집)에 기여하는 위치를 가리킬 수 있습니다. 전반적으로, NGS 기반 접근법을 사용하여 융합 전사 인자의 구조 기능 관계를 매핑하면 이러한 단백질의 온코겐 성 기능의 생화학 적 결정요인에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이것은 그들이 일으키는 질병에 대한 우리의 이해를 높이고 새로운 치료 전략의 개발을 가능하게하는 데 중요합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 전국 아동 병원의 아비가일 벡스너 연구소의 고성능 컴퓨팅 시설에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 건강 국립 암 연구소의 국립 연구소 [U54 CA231641 SLL, R01 CA183776에]에 의해 지원되었다; 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 [ERT에 젊은 조사관 상]; 펠로토니아 [ERT에 대한 펠로우십]; 및 국민건강의학연구위원회 CJ마틴 해외생물의학펠로우십[APP1111032 to KIP].
Wet Lab Reagents | |||
anti-FLI rabbit pAb | Abcam | ab15289 | 1:500 |
anti-lamin B1 rabbit pAb | Abcam | ab16048 | 1:2000 |
Cell-based system for introduction of mutant constructs | Determined by cell system used | ||
Cryotubes | For viral aliquots | ||
DMEM | Corning Cellgro | 10-013-CV | For viral production |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | For viral production |
G418 | ThermoFisher | 10131027 | For viral production |
HEK293-EBNAs | ATCC | CRL-10852 | For viral production |
HEPES | Gibco | 15630106 | |
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
M2 anti-FLAG mouse mAb | Sigma | F3165 | 1:2000 |
Near IR-secondary antibodies | Li-Cor | ||
Optimem | Gibco | 31985062 | For viral production |
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | For viral production |
Polybrene | Sigma | TR-1003-G | For viral transduction |
Puromycin | Sigma | P8833 | Stored at 2 mg/mL stock |
RNeasy Plus kit | Qiagen | 74136 | Has gDNA removal columns |
Selection reagents | As dictated by cell system used | ||
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | For viral production |
Tissue culture media | Determined by cell system used | ||
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2304 | For viral production |
Software | |||
Access to HPC environment | |||
AnnotationDbi | 1.38.2 | ||
Cairo | 1.5-10 | ||
DESeq2 | 1.16.1 | ||
genefilter | 1.58.1 | ||
ggbiplot | 0.55 | ||
ggplot2 | 3.1.1 | ||
org.Hs.eg.db | 3.4.1 | ||
pheatmap | 1.0.12 | ||
PuTTY | |||
R | 3.4.0 | ||
RColorBrewer | 1.1-2 | ||
reshape2 | 1.4.3 | ||
rgl | 0.100.19 | ||
R-studio | |||
STAR | Version 2.6 or later | ||
sva | 3.24.4 | ||
TrimGalore! | |||
WinSCP |