Ein In-vitro-System zur Messung der thrombolytischen Wirksamkeit von Histotripsie und einem lytischen Medikament

Zusammenfassung

Zur Behandlung einer tiefen Venenthrombose befindet sich eine histotripsiegestützte lytische Abgabe oder Lysotripsie in der Entwicklung. Hier wird ein In-vitro-Verfahren vorgestellt, um die Wirksamkeit dieser Kombinationstherapie zu beurteilen. Schlüsselprotokolle für das Gerinnselmodell, die Bildführung und die Bewertung der Behandlungswirksamkeit werden diskutiert.

Zusammenfassung

Tiefe Venenthrombose (DVT) ist ein globales Gesundheitsproblem. Der primäre Ansatz zur Gefäßrekanalisation bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT). Um ätzende Nebenwirkungen und die lange Behandlungszeit im Zusammenhang mit CDT zu mildern, werden adjuvante und alternative Ansätze entwickelt. Ein solcher Ansatz ist die Histotripsie, eine fokussierte Ultraschalltherapie zur Ablate von Gewebe durch Blasenwolkenkeimbildung. Präklinische Studien haben eine starke Synergie zwischen Histotripsie und Thrombolytika für den Gerinnselabbau gezeigt. Dieser Bericht beschreibt eine Benchtop-Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit der histotripsiegestützten thrombolytischen Therapie oder Lysotripsie.

Gerinnsel, die aus frischem menschlichem Venenblut hergestellt wurden, wurden in einen Strömungskanal eingeführt, dessen Abmessungen und akustomechanische Eigenschaften eine iliofemorale Vene nachahmen. Der Kanal wurde mit Plasma und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp Plasminogenaktivator durchblutet. Blasenwolken wurden im Gerinnsel mit einer fokussierten Ultraschallquelle erzeugt, die für die Behandlung von femoralvenösen Gerinnseln entwickelt wurde. Motorisierte Positionierer wurden verwendet, um den Quellfokus entlang der Gerinnsellänge zu übersetzen. An jedem Insonationsort wurden akustische Emissionen aus der Blasenwolke passiv aufgezeichnet und beamgeformt, um passive Kavitationsbilder zu erzeugen. Metriken zur Messung der Behandlungswirksamkeit umfassten den Verlust der Gerinnselmasse (Gesamtwirksamkeit der Behandlung) und die Konzentrationen von D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) im Perfusat. Es gibt Einschränkungen für dieses In-vitro-Design, einschließlich des Fehlens von Mitteln zur Beurteilung von In-vivo-Nebenwirkungen oder dynamischen Änderungen der Durchflussrate, wenn das Gerinnsel lysiert. Insgesamt bietet das Setup eine effektive Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Histotripsie-basierten Strategien zur Behandlung von TVT.

Einleitung

Thrombose ist der Zustand der Gerinnselbildung in einem ansonsten gesunden Blutgefäß, das die Durchblutung behindert^1,2. Venöse Thromboembolien haben jährliche Gesundheitskosten von 7-10 Milliarden US-Dollar, mit 375.000-425.000 Fällen in den Vereinigten Staaten³. Lungenembolie ist die Obstruktion der Lungenarterie und ist die schwerwiegendste Folge der venösen Thromboembolie. Die primäre Quelle der Lungenobstruktion sind tiefe Venenthrombolien, hauptsächlich aus iliofemoralen venenösen Segmenten^4,5,....

Protokoll

Für die hier vorgestellten Ergebnisse wurde venöses menschliches Blut entnommen, um Gerinnsel zu bilden, nachdem das lokale interne Überprüfungsgremium (IRB # 19-1300) genehmigt und die schriftliche Einwilligung freiwilliger Spender²⁴erteilt wurde. In diesem Abschnitt wird ein Entwurfsprotokoll zur Beurteilung der Wirksamkeit der Lysotripsie beschrieben. Das Protokoll basiert auf einer früheren Arbeit von Bollen et al.²⁴.

1. Gerinnselmodellierung

HINWEIS: Bereiten Sie die Gerinnsel innerhalb von 2 Wochen, aber mehr als 3 Tage vor dem Tag des Experiments vor, um die Ge....

Ergebnisse

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll hebt die Details der venösen Gerinnselmodellierung, der Lysotripsie bei Gerinnselstörungen und der Ultraschallbildgebung in einem In-vitro-Setup der TVT hervor. Das gewählte Verfahren zeigt die Schritte, die zur Beurteilung der Gerinnselstörung aufgrund der kombinierten Effekte von rt-PA und histotripsy Bubble Cloud-Aktivität erforderlich sind. Das Benchtop-Setup wurde entwickelt, um die Eigenschaften einer venösen Iliofemoralvene nachzuahmen. Abbildung 1A<.......

Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll stellt ein Modell zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit von Lysotripsie dar. Während die wichtigsten Details diskutiert wurden, gibt es bestimmte kritische Aspekte, die für den Erfolg dieses Protokolls zu berücksichtigen sind. Die enzymatische Aktivität von rt-PA hat eine Arrhenius-Temperaturabhängigkeit³⁰. Die Temperatur ist auch ein Faktor für die Schallgeschwindigkeit in Wasser und Gewebe, und Temperaturschwankungen können geringfügige Veränderungen der Geo.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Absorbierende Platten	Präzisionsakustik	F28-SMALL-M	300 mm x 300 mm x 10 mm
Borosilikat-Pasteur-Pippetten	Fisher Scientific	1367820A	14,6 cm Länge, 2 mL Kapazität
Zentrifugenröhrchen	Eppendorf	22364111	1,5 mL Kapazität
Drabkin's Assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Ziehspritze	Cole-Parmer	EW-07945-43	Filterbeutel mit einem Fassungsvermögen von 60 ml
	McMaster-Carr	5162K111	Entfernen einer Partikelgröße von bis zu 1 Mikrometer
Durchflusskanalschlauch	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylen ausgekleideter EVA-Kunststoffschlauch (Außendurchmesser: 3/8", Innendurchmesser: 1/4"
Heizelemente	Won Brothers	HT 300 Titan	Titanstäbe am Boden des Tanks platziert
Imaging Array	Verasonics	L11-5v	128 Element mit Empfindlichkeit von -55 bis -49 dB
Agarose mit geringer Gelierung	Millipore Sigma	A9414
Modellgefäß	McMaster-Carr	5234K98	6,6 cm Länge, 0,6 cm Innendurchmesser, 1 mm Dicke
Nanoreines Wasser	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM Typ I, 18 Mohm-cm spezifischer Widerstand
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma innerhalb von 24 Stunden eingefroren
Platten-Reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	Für die Hämoglobin-Quantifizierung
Sondenabdeckung	Civco	610-362
Programmierplattform	MATLAB (Mathworks, Natick, MA, USA)
Rekombinanter Gewebe-Plasminogen-Aktivator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	einem Fassungsvermögen von 60 mL
	Cole-Parmer	EW-74900-20	Pumpe, die an der Spritze befestigt ist, um den Durchfluss in den Strömungskanal mit einer vorher festgelegten Geschwindigkeit zu saugen
Schallkopf	Hauseigener kundenspezifischer		elliptisch fokussierter Schallkopf mit acht Elementen (9 cm Hauptachse, 7 cm Nebenachse und 6 cm Brennweite), angetrieben von einer speziell entwickelten und gebauten Klasse D Verstärker und passendes Netzwerk
Ultraschall-Scansystem	Verasonics		Vantage Research Ultraschallsystem
Wassertank	Advanced Acryl	C133	14 x 14 x 12, 1/2"

Mit Spritzenpumpe mit