Ein In-vitro-System zur Messung der thrombolytischen Wirksamkeit von Histotripsie und einem lytischen Medikament

Thrombose ist der Zustand der Gerinnselbildung in einem ansonsten gesunden Blutgefäß, das die Durchblutung behindert^1,2. Venöse Thromboembolien haben jährliche Gesundheitskosten von 7-10 Milliarden US-Dollar, mit 375.000-425.000 Fällen in den Vereinigten Staaten³. Lungenembolie ist die Obstruktion der Lungenarterie und ist die schwerwiegendste Folge der venösen Thromboembolie. Die primäre Quelle der Lungenobstruktion sind tiefe Venenthrombolien, hauptsächlich aus iliofemoralen venenösen Segmenten^4,5,6. Tiefe Venenthrombose (DVT) hat inhärente Folgeerscheinungen neben Lungenobstruktionen, mit langfristigen Komplikationen, die zu Schmerzen, Schwellungen, Beingeschwüren und Gliedmaßenamputationen führen^7,8,9. Bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT) der Frontline-Ansatz für die Gefäßrekanalisation¹⁰. Das Ergebnis der CDT hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter Thrombusalter, Ort, Größe, Zusammensetzung, Ätiologie und Patientenrisikokategorie¹¹. Darüber hinaus ist CDT mit Gefäßschäden, Infektionen, Blutungskomplikationen und langer Behandlungszeit verbunden¹⁰. Geräte der nächsten Generation zielen darauf ab, mechanische Thrombektomie mit Thrombolytika (d.h. pharmakomechanischer Thrombektomie) zu kombinieren^12,13. Die Verwendung dieser Geräte senkt die lytische Dosierung, was zu reduzierten Blutungskomplikationen führt, und verkürzt die Behandlungszeit^12,13,14 im Vergleich zu CDT. Diese Geräte behalten immer noch Probleme mit hämorrhagischen Nebenwirkungen und unvollständiger Entfernung chronischer Thromben¹⁵. Es bedarf daher einer adjuvanten Strategie, die den Thrombus mit geringeren Blutungskomplikationen vollständig entfernen kann.

Ein möglicher Ansatz ist die histotripsiegestützte thrombolytische Behandlung, die als Lysotripsie bezeichnet wird. Histotripsie ist eine nicht-invasive Behandlungsmodalität, die fokussierten Ultraschall verwendet, um Blasenwolken in Geweben zu nukleieren¹⁶. Die Blasenaktivität wird nicht über exogene Kerne erzeugt, sondern durch die Anwendung von Ultraschallimpulsen mit ausreichender Spannung, um Gewebekerne zu aktivieren, einschließlich Gerinnsel^17,18. Die mechanische Schwingung der Blasenwolke belastet das Gerinnsel und zerfällt die Struktur in azelluläre Trümmer¹⁹. Die Histotripsie-Blasenaktivität sorgt für einen effektiven Abbau von eingezogenen und nicht retraktierten Blutgerinnseln sowohl in vivo als auch in vitro^20,21,22. Frühere Studien haben^23,24 gezeigt, dass die Kombination von Histotripsie und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp-Plasminogenaktivator (rt-PA) die Behandlungswirksamkeit im Vergleich zu lytischen allein oder Histotripsie allein signifikant erhöht. Es wird angenommen, dass zwei primäre Mechanismen, die mit der Histotripsie-Blasenaktivität verbunden sind, für die verbesserte Wirksamkeit der Behandlung verantwortlich sind: 1) erhöhte Fibrinolyse aufgrund einer verbesserten lytischen Abgabe und 2) Hämolyse der roten Blutkörperchen im Gerinnsel. Der Großteil der Gerinnselmasse besteht aus roten Blutkörperchen²⁴, und daher ist die Verfolgung des Erythrozytenabbaus ein guter Ersatz für die Ablation der Probe. Andere gebildete Gerinnselelemente werden wahrscheinlich auch unter Histotripsie-Blasenaktivität zerfallen, werden aber in diesem Protokoll nicht berücksichtigt.

Hier wird ein Benchtop-Ansatz zur Behandlung von TVT in vitro mit Lysotripsie skizziert. Das Protokoll beschreibt kritische Betriebsparameter der Histotripsiequelle, die Beurteilung der Behandlungswirksamkeit und die Bildführung. Das Protokoll umfasst die Entwicklung eines Strömungskanals zur Nachahmung eines iliofemoralen Venensegments und die Herstellung menschlicher Vollblutgerinnsel. Das experimentelle Verfahren beschreibt die Positionierung der Histotripsiequelle und des Bildgebungsarrays, um eine Histotripsie-Exposition entlang des im Strömungskanal platzierten Gerinnsels zu erreichen. Relevante Insonationsparameter, um gerinnselunterbrechungen zu erreichen und die Blasenaktivität außerhalb des Ziels zu minimieren, werden definiert. Die Verwendung von Ultraschallbildgebung zur Führung und Beurteilung der Blasenaktivität wird veranschaulicht²⁴. Metriken zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit wie Gerinnselmassenverlust, D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) werden^{23,24,25,26,27}beschrieben. Insgesamt bietet die Studie ein wirksames Mittel zur Durchführung und Bewertung der Wirksamkeit von Lysotripsie zur Behandlung von TVT.

Für die hier vorgestellten Ergebnisse wurde venöses menschliches Blut entnommen, um Gerinnsel zu bilden, nachdem das lokale interne Überprüfungsgremium (IRB # 19-1300) genehmigt und die schriftliche Einwilligung freiwilliger Spender²⁴erteilt wurde. In diesem Abschnitt wird ein Entwurfsprotokoll zur Beurteilung der Wirksamkeit der Lysotripsie beschrieben. Das Protokoll basiert auf einer früheren Arbeit von Bollen et al.²⁴.

1. Gerinnselmodellierung

HINWEIS: Bereiten Sie die Gerinnsel innerhalb von 2 Wochen, aber mehr als 3 Tage vor dem Tag des Experiments vor, um die Gerinnselstabilität zu gewährleisten und den Rückzug zu maximieren²⁸. Bereiten Sie das Gerinnsel nach der Genehmigung durch das lokale institutionelle Überprüfungsgremium vor.

1. Bereiten Sie die Borosilikat-Pasteur-Pipette für die Lagerung des Blutes vor (siehe Materialtabelle für Spezifikationen der Pipette). Borosilikatröhrchen werden wegen der hydrophilen Natur des Materials verwendet, die die Thrombozytenaktivierung und den Gerinnselrückzug fördert²⁹. Versiegeln Sie die Spitze der Pipette durch Erhitzen über einem Bunsenbrenner.
2. Ziehen Sie frisches menschliches Venenblut. Aliquot das gesamt entnommene Blut in 2-ml-Schritten pro gewünschtem Gerinnsel. Geben Sie jedes 2 ml Aliquot in eine Pasteur-Pipette.
   HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.2 innerhalb von ca. 3 Minuten nach der Blutentnahme aus, damit kein Blut gerinnt, bevor es in Pipetten überführt wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass der freiwillige Spender keine Medikamente einnimmt, die die Gerinnungskaskade verändern können (z. B. Blutverdünner oder Thrombozytenhemmer).
3. Inkubieren Sie die Blutaliquoten in den Pipetten (entspricht der Anzahl der benötigten Gerinnsel) in einem Wasserbad für 3 h bei 37 °C.
4. Lagern Sie die Pipetten mindestens 3 Tage bei 4 °C, um das Zurückziehen der Gerinnsel zu ermöglichen²⁸. Wenn sich die Gerinnsel zurückziehen, wird beobachtet, dass sich Serum an der Oberseite des Gerinnsels in der Pipette ansammelt. Die rt-PA-Reaktion von Gerinnseln bleibt 2 Wochen nach dem Rückzug stabil²⁸.

2. Vorbereitung des Wassertanks

1. Füllen Sie den Wassertank mit Umkehrosmosewasser. Bekleiden Sie die Unterseite des Tanks mit einem akustisch absorbierenden Material, um die Reflexion der Therapie oder der Ultraschallimpulse zu reduzieren. Verwenden Sie ein Wasseraufbereitungssystem, um das Wasser zu entgasen und zu filtern, um Blasenkerne zu minimieren.
   HINWEIS: Eine Möglichkeit, das Wasser zu filtern, ist die Verwendung eines Inline-Filters. Die Spezifikationen des Beutels, der zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet wird, sind in der Materialtabelle angegeben.
2. Platzieren Sie zwei Heizelemente an der Unterseite des Tanks. Erhitzen Sie das Wasser auf 37,3 °C, um die maximale lytische enzymatische Aktivität³⁰zu erreichen.
3. Richten Sie einen Flusskanal ein, wie in Abbildung 1Adargestellt. Der Strömungskanal besteht aus Schläuchen, einem Modellgefäß mit Material- und geometrischen Eigenschaften, die für eine iliofemorale Vene repräsentativ sind, einem Reservoir für Plasma und einer Spritze am distalsten Ende des Reservoirs (Materialtabelle). Die Spritze wird an eine Pumpe angeschlossen, um während des Experiments einen Durchfluss durch den Kanal zu regulieren.
4. Tauchen Sie den Strömungskanal manuell in den Wassertank ein, um den Kanal während der Entgasungs-/Filter-/Heizstufe auf physiologische Temperatur zu bringen (Schritte 2.1 und 2.2).

3. Herstellung von Plasma und rt-PA-Gemisch

1. Vor dem Experimentiertag
   HINWEIS: Bei Lagerung bei -80 °C ist Plasma mindestens 2,5 Jahre³¹ und rt-PA mindestens 7 Jahre stabil³². Führen Sie daher Schritt 3.1 jederzeit innerhalb dieser Zeiträume aus, um die Stabilität der beiden Komponenten sicherzustellen.
   1. Verdünnen Sie das von einem Hersteller erhaltene rt-PA in pulverförmiger Form auf 1 mg/ml in sterilem Wasser.
   2. Aliquot 100 μL verdünntes rt-PA in 0,5 mL Zentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -80 °C.
   3. Aliquot 35 ml menschliches frisch gefrorenes Plasma vom Typ O in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Röhrchen bei -80 °C.
2. Am Experimenttag
   1. Holen Sie Plasma-Aliquoten aus dem Gefrierschrank. Rufen Sie so viele Aliquoten ab, wie die Anzahl der gerinnsel, die an diesem Tag getestet werden sollen. Tauchen Sie die gefrorenen Aliquoten in ein Wasserbad bei 37 °C, um aufzutauen (~10 min).
   2. Sobald das Plasma aufgetaut ist, gießen Sie es in ein Becherglas, das dreifach mit Reinstwasser gespült wird. Bedecken Sie den Mund des Becherglases leicht mit Aluminiumfolie, um eine Kontamination zu vermeiden, und legen Sie das Becherglas in das Wasserbad. Lassen Sie die Folie locker genug sein, damit Luft mit dem Plasma in Kontakt treten kann.
   3. Plasma wird bei 37 °C mindestens 2 h auf Atmosphärendruck ausgeglichen.
   4. Nehmen Sie die gefrorenen rt-PA-Fläschchen heraus und legen Sie sie auf Eis, bis sie benötigt werden, mit einer Durchstechflasche für jeden Versuchslauf.
   5. Machen Sie Agarose mit niedrigem Gelieren (2%) in einem 50-ml-Kolben, indem Sie Agarose in Reinstwasser auflösen. Wählen Sie die Gesamtmenge an Agaroselösung so, dass für jede zu analysierende Probe etwa 2 ml zur Verfügung stehen. Die Lösung im Kolben in der Mikrowelle erhitzen, bis sie sprudelt. Befestigen Sie den Kolben mit einem wasserdichten Schraubdeckel darauf. Tauchen Sie den Kolben neben dem Plasma in das Wasserbad.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass Agarose verfügbar ist, um exponierte Gerinnselsegmente für die histologische Analyse nach Histotripsiesonation zu sichern.

4. Einrichten der Histotripsiequelle und des Imaging-Arrays

1. Stellen Sie sicher, dass die motorisierten Positionierer von der Laufzeitumgebung einer Programmierplattform aus gesteuert werden können, indem Sie die vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen und Befehle verwenden. Überprüfen Sie, ob die Motoren des Systems an den entsprechenden Port des Computers mit der Laufzeitumgebung angeschlossen sind.
2. Montieren Sie die Histotripsiequelle am motorisierten Positioniersystem, wie in Abbildung 1B dargestellt.
3. Schließen Sie die Histotripsiequelle über die entsprechenden Anschlüsse (z. B. BNC-Kabel) wie vom Hersteller angegeben an ihre Antriebselektronik (z. B. Endstufe und Funktionsgenerator) an.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Antriebselektronik der Histotripsiequelle über die in Schritt 4.1 verwendete Laufzeitumgebung gesteuert werden kann.
4. Decken Sie das Imaging-Array mit einer Sondenabdeckung ab, und befestigen Sie das Array koaxial in der Blende der Histotripsiequelle, wie in Abbildung 2 dargestellt. Achten Sie darauf, die Ausrichtung der Abbildungsebene relativ zur Ausrichtung der Histotripsiequelle zu verstehen.
5. Schließen Sie das Bildgebungsarray an ein Ultraschall-Scansystem an. Stellen Sie sicher, dass dieses System den Betrieb und die Auslösung des Imaging-Arrays steuern und Imaging-Daten gemäß den Befehlen des Herstellers des Scanners sammeln kann.
6. Tauchen Sie die Histotripsiequelle/das Imaging-Array während der Entgasung in den Tank ein, wie in Abbildung 1Adargestellt. Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen mit einer Spritze von der Oberfläche der Histotripsiequelle oder des Imaging-Arrays.
   HINWEIS: Tauchen Sie die Histotripsiequelle und das Imaging-Array vor dem Betrieb vollständig in Wasser. Vermeiden Sie es, die Oberfläche der Histotripsiequelle zu berühren.
7. Erfassen Sie B-Modus-Bilder mit einer Rate von 20 Bildern pro Sekunde mit dem Imaging-Array und den integrierten Befehlen des Scanners. Passen Sie das Bildfenster an, um die Visualisierung des Fokus der Histotripsiequelle in diesen Echtzeitbildern sicherzustellen.
   HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass die Dimensionen der Fokusregion der therapeutischen Quelle bekannt sind.
8. Stellen Sie die Betriebsparameter der Histotripsiequelle ein, einschließlich Grundfrequenz (z. B. 1,5 MHz), Pulswiederholfrequenz (z. B. 20-100 Hz), Pulsdauer (z. B. 1-20 Zyklen pro Impuls) und Gesamtzahl der Impulse pro Ort (z. B. 100-2.000)^18,23,24,33. Ändern Sie diese Parameter, wenn keine ausreichende Gerinnsellyse erreicht wird oder wenn die Blasenaktivität über das Lumen des Modellgefäßes hinausgeht. Um diese Parameter einzustellen, verwenden Sie das vom Hersteller der Quelle bereitgestellte Protokoll oder verwenden Sie eine Programmierplattform, die mit der Quelle kommunizieren kann (Schritt 4.3).
9. Führen Sie die Histotripsiequelle mit dem in Schritt 4.8 verwendeten Protokoll oder der Programmierplattform des Herstellers bei den eingestellten Parametern nur in entgasten Gewässern ohne Behinderung in der Umgebung aus. Erhöhen Sie die spannungsangebrachte Histotripsiequelle, bis sich eine Blasenwolke bildet.
10. Passen Sie mithilfe der Echtzeitabbildung von Schritt 4.7 die Position des Bildgebungsarrays innerhalb der öffnung des konfokalen Wandlers an, bis sich die Blasenwolke ungefähr in der Mitte des Bildfensters befindet. Die Blasenwolke ist der Bereich hyperechoischer Pixel in der Abbildungsebene (Abbildung 3). Ziehen Sie die Schrauben fest, um das Imaging-Array fest in der Wandleröffnung zu halten.
    HINWEIS: Wenn das Array richtig ausgerichtet ist, sollte die azimutale Position der Blasenwolke ungefähr bei 0 mm in der Abbildungsebene liegen. Das bildgebungsfeld kann leicht von der inneren Oberfläche der Therapiequelle projizieren, und daher kann die Bereichsposition der Blasenwolke von der Brennweite der Quelle abweichen.
11. Identifizieren Sie die Position der Blasenwolke in der Abbildungsebene. Weisen Sie den Fokus der Histotripsiequelle als Zentrum der Blasenwolke zu (Abbildung 3).
12. Notieren Sie die erkannte Brennposition (Schritt 4.11) im Bildfenster (Abbildung 3). Eine möglichkeit, die Fokusposition zu markieren, besteht darin, einen Cursor zu platzieren, um die Position im Imaging-Fenster zu notieren, sofern dies mit der Imaging-Plattform verfügbar ist.
13. Beenden Sie die Insonation und stellen Sie die an die Histotripsiequelle angelegte Spannung auf 0 V ein.

5. Gerinnselzubereitung

1. Entfernen Sie das Gerinnsel aus der Pipette, indem Sie das versiegelte Ende mit einer Zange schneiden. Lassen Sie das Gerinnsel zusammen mit dem Serum in eine Petrischale gleiten. Wenn sich das Gerinnsel nicht löst, drücken Sie vorsichtig Druck vom anderen Ende der Pipette durch Kochsalzlösung aus, um das Gerinnsel zu entfernen.
2. Schneiden Sie das Gerinnsel mit einem Skalpell auf 1 cm Länge und zielen Sie auf ein einheitliches Stück von der Mitte aus (dh weg von Abschnitten des Gerinnsels, die oben oder unten in der Pipette gebildet werden).
3. Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um den geschnittenen Abschnitt des Gerinnsels vorsichtig abzutuchen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
4. Legen Sie den Gerinnselabschnitt mit einer Pinzette vorsichtig auf eine Waage und notieren Sie das Gewicht.
5. Heben Sie den Strömungskanal manuell aus dem Wassertank an und entfernen Sie den Modellbehälter aus dem Strömungskanal.
6. Legen Sie das Gerinnsel mit einer Pinzette in das Modellgefäß und befestigen Sie das Modellgefäß wieder am Strömungskanal.
   HINWEIS: Ein Nylonstab kann innerhalb des Modellgefäßes platziert werden, um zu verhindern, dass sich das Gerinnsel aufgrund der Strömung stromabwärts bewegt.
7. Senken Sie den Strömungskanal so in den Tank, dass das proximale Ende der Stufe relativ zum Reservoir im Vergleich zur distalen Seite niedrig ist. Das Angeln der Stufe auf diese Weise verhindert das Einfangen von Blasen im Modellgefäß, wenn in Schritt 6.1 Plasma durch den Strömungskanal gezogen wird.
8. 30 ml Plasma werden mit einer Pipette in das Reservoir geben und die Temperatur überwacht, bis sie mindestens 36 °C erreicht.
9. Verwenden Sie eine Pipette, um das rt-PA (80,4 μg in 30 ml Plasma, 2,68 μg/ml) in das Plasmareservoir zu dosieren. Rühren Sie das Plasma mit der Pipette um, um eine gleichmäßige rt-PA-Verteilung innerhalb des Reservoirs zu gewährleisten.

6. Ansaugen des Strömungskanals

1. Ziehen Sie Plasma aus dem Reservoir über die Spritzenpumpe in den Strömungskanal, bis das Plasma das Modellgefäß füllt.
   HINWEIS: Wenn das Gerinnsel nicht bündig mit dem Nylonstab ist, verwenden Sie kurze Pumpenzuge bei 60 ml / min, um zu versuchen, das Plasma dem Gerinnsel nachgeschaltet zu zwingen oder manuell durch die Spritze zu ziehen. Begrenzen Sie die Menge an Plasma, die bei diesem Prozess entnommen wird, oder füllen Sie das Reservoir mit zusätzlichem Plasma / rt-PA auf, um 30 ml Lösung im Strömungskanal zu gewährleisten.
2. Richten Sie das Imaging-Array mithilfe der motorisierten Positionierer mithilfe des Imaging-Skripts parallel zur Länge des Gerinnsels aus (Schritt 4.7). Die parallele Ausrichtung ermöglicht es dem Benutzer, die korrekte Platzierung des Gerinnsels und das Fehlen von Blasen im Modellgefäß visuell sicherzustellen.
3. Nivellieren Sie das Modellschiff manuell und visuell, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind, indem Sie das Bildfenster verwenden (Schritt 4.7).

7. Ablauf des Experiments

1. Vorbehandlung
   HINWEIS: In diesem Schritt wird ein Pfad für die Histotripsiequelle/das Imaging-Array für eine gleichmäßige Histotripsie-Exposition entlang der Gerinnsellänge geplant.
   1. Richten Sie das Bildgebungsarray mit den motorisierten Positionierern so aus, dass die Abbildungsebene parallel zum Querschnitt des Gerinnsels verläuft (d. h. senkrecht zur in Schritt 6.2 beschriebenen Ausrichtung).
   2. Bewegen Sie unter Anleitung des Bildgebungsfensters (Schritt 4.7) die Histotripsiequelle mit den motorisierten Positionierern zum proximalen Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir. Passen Sie an dieser Stelle die Position der Histotripsiequelle so an, dass der markierte Brennpunkt in Schritt 4.12 mit dem Zentrum des Gerinnsels ausgerichtet ist.
   3. Bestimmen Sie den Resonanzpfad entlang der Gerinnsellänge. Um diesen Pfad zu definieren, legen Sie drei Wegpunkte entlang der Länge des Gerinnsels (d. h. Positionen der Motoren, in denen die histotripsy Blasenaktivität im Gerinnsel enthalten ist) in Schritten von 5 mm fest. Richten Sie die Wegpunkte so aus, dass die Gesamtbewegung der histotripsieartigen Quelle entlang des Pfades antegrad mit der Strömung im System ist (dh der erste Wegpunkt befindet sich am proximalsten Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir und der dritte Wegpunkt befindet sich in der distalen Position relativ zum Reservoir).
   4. Bevor Sie jeden Wegpunkt abschließen, feuern Sie Testimpulse von der Histotripsiequelle mit den gleichen Insonationsparametern wie Schritt 4.8 ab, reduzieren sie jedoch die Gesamtexposition auf 10 Gesamtimpulse. Stellen Sie die Position der Histotripsiequelle bei Bedarf mit den motorisierten Positionierern ein, um die Blasenaktivität im Gerinnsel einzudämmen.
   5. Speichern Sie an jedem Wegpunkt die Motorpositionen mit den vom Hersteller bereitgestellten Befehlen, ähnlich wie in Schritt 4.1.
2. Behandlung
   HINWEIS: Dieser Schritt definiert das Verfahren zur Behandlung des Gerinnsels entlang seiner Länge entsprechend dem im Vorbehandlungsschritt definierten Pfad.
   1. Führen Sie die Spritzenpumpe mit 0,65 ml/min aus und warten Sie, bis sich der Meniskus des Plasmas bewegt hat. Diese Durchflussrate ahmt einen nahezu vollständigen Verschluss des iliofemoralen^{Gefäßes 24,34 nach.}
   2. Interpolieren Sie den in Schritt 7.1.3 angelegten Pfad mit Zwischenschritten zwischen den festgelegten Wegpunkten mit einer festen Schrittgröße (z.B. 0,5 mm). Die Schrittgröße wird so gewählt, dass sie kleiner als die Hälfte der Breite des Fokusbereichs ist, gemessen entlang der Gerinnsellänge (Höhenrichtung des Bildgebungsarrays). Bewegen Sie die Histotripsiequelle mit motorisierten Positionierern an jeder Pfadposition mit den in Schritt 4.8 definierten Insonationsparametern.
   3. Überwachen/Bildblasenaktivität während der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Pfadstelle mithilfe des Bildgebungsfensters (Schritt 4.7). Zentrieren Sie das Bild auf dem Histotripsie-Fokus mit den Bildabmessungen von 15 mm im Azimut und -bereich. Vor der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Stelle erfassen Sie ein B-Modus-Bild, um die Visualisierung des Gerinnsels und des Modellgefäßes zu ermöglichen, indem Sie ein Skript in einer Programmierplattform erstellen. Stellen Sie sicher, dass das Skript die Kommunikation mit dem Scanner mithilfe der Befehle des Herstellers herstellt.
   4. Implementieren Sie während der Anwendung des Histotripsieimpulses die Erfassung der akustischen Emissionen im Skript in Schritt 7.2.3, um passive Kavitationsbilder post hoc³⁵zu bilden. Erfassen Sie ein passives Kavitationsbild nach jeweils 10 Behandlungsimpulsen. Wenden Sie eine flache Zeitverstärkungskompensation von 50 bei 8 inkrementellen Tiefen bis zum Ende der Bildtiefe an. Wählen Sie eine geeignete Erfassungsfenstergröße, so dass das gesamte Signal des Gerinnsels mit minimalem Energieverlust durch Fenster³⁵erfasst wird.
   5. Wenn Off-Target-Blasenwolken vorhanden sind, stellen Sie die Wandlerposition in situ mit den motorisierten Positionierern ein.
      HINWEIS: Überwachen Sie auf verpasste Trigger des Imaging-Arrays. Passen Sie die Anzahl der erfassten Bilddatensätze an, um sicherzustellen, dass die Speicherung der Daten vor dem anschließenden Auslösen abgeschlossen ist.

8. Verfahren nach dem Experiment

1. Heben Sie das Modellgefäß manuell aus dem Wassertank an, um das Parfüm über die Schwerkraft abzulassen. Achten Sie darauf, den Strömungskanal nivelliert zu halten, um zu verhindern, dass sich das Gerinnsel während des Abtropfens stromabwärts und aus dem Modellbehälter bewegt.
2. Sammeln Sie das gesamte Perfusat zur weiteren Analyse in einem kleinen Becherglas (Abbildung 4A), indem Sie Plasmalösung aus dem Strömungskanal durch die Spritzenpumpe mit einer sehr niedrigen Durchflussrate ziehen.
3. Trennen Sie das Modellgefäß, und entfernen Sie das Gerinnsel. Bei Bedarf eine kleine Menge Kochsalzlösung in das Modellgefäß injizieren, um das Gerinnsel sanft zu vertreiben.
4. Wischen Sie das Gerinnsel ähnlich wie in Schritt 1.2.3. Wiegen Sie das Gerinnsel auf der Waage, um den Gerinnselmassenverlust zu beurteilen.
5. Um den D-Dimergehalt zu analysieren, fügen Sie 100 mg Aminocapronsäure in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, gefolgt von 1 ml Perfusat, und mischen Sie es gut mit einer Pipette. Führen Sie einen immun-turbidimetrischen Latex-Assay durch, um das D-Dimer in der Probe zu quantifizieren³⁶.
6. Um die Hämolyse zu beurteilen, fügen Sie 1 ml Perfusat in Zentrifugenröhrchen hinzu und spinnen Sie bei 610 x g (3.500 U / min) für 10 min. Kombinieren Sie 0,5 ml Überstand (Konzentrat) mit 0,5 ml Drabkins-Lösung und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 15 min ruhen. Übertragen Sie 200 μL auf Bohrplatten, wie in Abbildung 4B dargestellt. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 540 nm abzulesen, Abbildung 4C (Drabkins-Assay³⁷).
7. Histologische Beurteilung
   1. Schneiden Sie einen Abschnitt aus der Mitte des Gerinnsels von etwa 2-3 mm Länge mit einem Skalpell.
   2. Fügen Sie den Abschnitt zu einer Kassette hinzu. Halten Sie die Ausrichtung des Abschnitts relativ zur Richtung der Histotripsie-Pulsausbreitung aufrecht.
   3. 2 ml niedriggelnde Agaroselösung, die in Schritt 3.2.5 hergestellt wurde, werden in die Kassette geben, um das Gerinnsel an Ort und Stelle zu fixieren.
   4. Fixieren Sie die Probe in 10% Formalin für 24 h. Legen Sie die Probe nach 24 h in 70% Alkohol und führen Sie eine Standard-Hemotoxylin-Eosin-Färbung³⁸durch.

9. Passive Kavitationsbildanalyse

1. Verarbeiten Sie die Signale, die während der Histotripsie-Anregung (Schritt 7.2.4) vom Bildgebungsarray erfasst wurden, mit einem Algorithmus, der auf dem robusten Capon-Beamformer³⁹ basiert, um ein Bild der akustischen Emissionen zu erstellen, die von der Blasenwolke an jedem Behandlungsort erzeugt werden.
   HINWEIS: Um quantitative Bilder zu generieren, befolgen Sie die in Haworth et al.³⁵beschriebenen Schritte. Andernfalls sollte jeder Pixelwert im Bild die relative akustische Energie der Blasenwolke (Einheiten von V²⁾an jeder entsprechenden Stelle darstellen.
2. Segmentieren Sie das in Schritt 7.2.3 angequirte B-Modus-Bild, um zwischen den Pixeln, die das Gerinnsel darstellen, und dem Modellgefäß zu unterscheiden.
3. Registrieren Sie das passive Kavitationsbild mit dem B-Modus-Bild, wie in Abbildung 5Bdargestellt. Summieren Sie die akustische Energie innerhalb des Gerinnsels über den Expositionszeitraum³⁵.

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll hebt die Details der venösen Gerinnselmodellierung, der Lysotripsie bei Gerinnselstörungen und der Ultraschallbildgebung in einem In-vitro-Setup der TVT hervor. Das gewählte Verfahren zeigt die Schritte, die zur Beurteilung der Gerinnselstörung aufgrund der kombinierten Effekte von rt-PA und histotripsy Bubble Cloud-Aktivität erforderlich sind. Das Benchtop-Setup wurde entwickelt, um die Eigenschaften einer venösen Iliofemoralvene nachzuahmen. Abbildung 1A zeigt ein Modellgefäß, das die akustischen, mechanischen und geometrischen Eigenschaften der iliofemoralen Vene aufweist. Das Gerinnsel wird in das Modellgefäß gelegt, um einen teilweise okklusiven Thrombus nachzuahmen. Das Gerinnsel wird mit Plasma und rt-PA aus einem Reservoir mit einer Geschwindigkeit von 0,65 ml/min durchblutet. Diese Rate stimmt mit der langsamen Durchflussrate in einem stark verschlossenenGefäß überein 34.

Ein elliptisch fokussierter Wandler mit einer Grundfrequenz von 1,5 MHz mit einer Hauptachse von 9 cm, einer 7 cm nebenachse und einer Brennweite von 6 cm (Abbildung 2A) ist auf dem Positioniersystem montiert, wie in Abbildung 1Bangegeben. Ein mit Ultraschallgel und einer Latexabdeckung(Abbildungen 2B,C)bedecktes Bildgebungsarray wird koaxial mit dem Wandler montiert, wie in Abbildung 1A über eine Öffnung in der Mitte der Histotripsiequelle gezeigt. Die motorisierten Positionierer wurden verwendet, um den Therapiewandler / das Bildgebungsarray entlang der Gerinnsellänge innerhalb des Modellgefäßes zu übersetzen (Abbildung 1). Bei Anbringung einer ausreichenden Spannung an der Histotripsiequelle wird im Fokusbereich des Wandlers eine Blasenwolke erzeugt und mittels Ultraschallbildgebung visualisiert, wie in Abbildung 3gezeigt. Die Fokusposition wird mit Hilfe der Abbildungsebene als Zentrum der Blasenwolke definiert (Schritte 4.10-4.11).

Abbildung 4A zeigt Perfusate, die für zwei verschiedene Behandlungsbedingungen gesammelt wurden. Das als Kontrolle gekennzeichnete Becherglas enthält Perfusat eines Gerinnsels, das allein Plasma ausgesetzt ist. Das zweite als behandelt gekennzeichnete Becherglas enthält das Perfusat des mit Lysotripsie behandelten Gerinnsels. Die gesammelten Perfusate werden verwendet, um den Hämoglobingehalt (Metrik der Hämolyse) und den D-Dimergehalt (Metrik der Fibrinolyse) durch Assays gemäß dem Protokoll zu beurteilen. Der Farbunterschied der Perfusate bezeichnet die Variabilität der Hämoglobinkonzentration, die über die optische Absorption quantifiziert werden kann. Der Zusammenhang zwischen Absorptionswert und Hämoglobinkonzentration kann durch eine Kalibrierkurve bestimmt werden. Lösungen mit bekanntem Hämoglobingehalt im Bereich von 0 (Blindmessung) bis 180 mg/ml werden in die Bohrplatte eingelegt und die Absorption wird in dreifacher Ausfertigung mit dem Plattenleser bestimmt (Abbildung 4B,C). Die obere Absorptionsgrenze des Plattenlesers kann variieren und ist möglicherweise nicht von vorndlich bekannt, um die Lösungen in der Bohrplatte herzustellen. Daher werden Hämoglobinkonzentrationen von bis zu 180 mg/ml in der Wellplatte hergestellt, Abbildung 4B. Der hier verwendete Plattenleser kann jedoch die Absorption nur für Konzentrationen bis zu 23 mg/ml ablesen, Abbildung 4C.

Abbildung 5A zeigt die Visualisierung des Gerinnsels innerhalb des Modellgefäßes mittels B-Mode-Bildgebung vor der Histotripsie-Exposition gemäß Schritt 7.2.3. Dieses Bild wird aufgenommen, um die Gerinnselposition für die Segmentierung des passiven Kavitationsbildes zu bestimmen. Abbildung 5B zeigt das passive Kavitationsbild, das mit dem B-Mode-Bild registriert wurde, das vor der Histotripsie-Belichtung aufgenommen wurde. Diese Zahl bestätigt, dass die akustische Energie während der Histotripsie-Exposition hauptsächlich im Gerinnsel enthalten ist.

Typische Gerinnselstörungen aufgrund von Histotripsie und Lytikum sind in Abbildung 6 dargestellt. Abbildung 6A,B zeigt die unbehandelten bzw. lysotripsiebehandelten Gerinnselbilder. Bei Proben, die einer Histotripsie ausgesetzt sind, ist die Störung in erster Linie auf das Gerinnselzentrum beschränkt, im Einklang mit den beobachteten Stellen der Blasenaktivität, die mit passiver Kavitationsbildgebung verfolgt wurden (Abbildung 5B). Bei Zugabe von Lytikum tritt der Massenverlust jedoch auch in Regionen auf, die näher an der Peripherie des Gerinnsels liegen. Es wird angenommen, dass dieser zusätzliche Massenverlust auf eine verstärkte Flüssigkeitsmischung des Lytikums unter Blasenaktivität zurückzuführen ist. Die Flüssigkeitsmischung erhöht die Verteilung und Eindringtiefe des Lytikums in das Gerinnsel. Da der Lytiker für die Fibrinolyse40verantwortlich ist, nimmt der Massenverlust zu. Die Fibrinolyse kann durch Messung des D-Dimergehalts im Perfusat41quantifiziert werden.

Abbildung 1: Versuchsaufbau für die Lysotripsie menschlicher Blutgerinnsel. (A) Die Komponenten des Aufbaus sind (1) fokussierte Histotripsiequelle mit elliptischer Geometrie, (2) latexbedecktes Bildgebungsarray, (3) Modellgefäß, das am Strömungskanal befestigt ist, (4) Strömungskanal, (5) Reservoir, (6) akustisches absorbierendes Material, (7) Heizelement und (8) Wassertank, der mit entgastem und beheiztem Umkehrosmosewasser gefüllt ist. Die Azimutbemaßung der Abbildungsebene steht senkrecht zu den Höhen- und Bereichsdimensionen (in die Seite). (B) Die histotripsy Quelle, die auf dem motorisierten Positioniersystem montiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2:Ultraschallquelle und bildgebungsgebende Komponenten. Individuelle gezoomte Bilder von (A) fokussierter Histotripsiequelle, (B) Bildgebungsarray und (C) Bildgebungsarray mit Ultraschallgel und Latexabdeckung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Histotripsy-Blasenwolke, visualisiert mit einem Imaging-Array. In der Fokuszone der Histotripsiequelle wird eine Blasenwolke erzeugt und mit einem Bildarray abgebildet. Der als Kreuz dargestellte Fokus wird für die Behandlungsplanung gespeichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantifizierung des hämoglobinfreiten Hämoglobins durch Gerinnsellyse. (A) Perfusatproben, die nach Kontrollstudie mit Plasma allein (keine Histotripsie oder Lytik) und Behandlungsarm, Histotripsie (z. B. 35 MPa Peak-Unterdruck, 5-Zyklus-Pulsdauer, 1,5 MHz-Grundfrequenz) und 2,68 μg/ml lytische Exposition entnommen wurden. (B) Well-Platte mit Verdünnungen bekannter Hämoglobinkonzentrationen im Bereich von 180 mg/ml (obere Reihe, linke Ecke) bis 0 mg/ml (untere Reihe, rechte Ecke). Die Pfeilspitze zeigt auf eine abnehmende Hämoglobinkonzentration hin. (C) Diese Proben werden verwendet, um eine Standardkurve zur Quantifizierung von Hämoglobin zu erstellen, das aufgrund einer Histotripsie-Exposition mittels Spektrophotometrie entsteht. Die Absorptionskurve für Hämoglobinkonzentrationen im Bereich von 0 bis 23 mg/ml wird aufgrund der Begrenzung des Plattenlesers bei der Analyse höherer Konzentrationen erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Bilder des Gerinnsels während der Behandlung. (A) B-Mode-Bild, das vor Beginn des Behandlungsimpulses aufgenommen wurde und die Gerinnselposition innerhalb des Modellgefäßes zeigt. (B) Post-hoc-Visualisierung der akustischen Energieemission, berechnet aus passiver Kavitationsbildgebung, die in einer heißen Farbkarte gezeigt wird, die mit dem B-Mode-Bild des Gerinnsels, das vor der Anwendung des Histotripsiepulses aufgenommen wurde, koregistriert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Histologie des abgetragenen Gerinnsels unter verschiedenen Behandlungsbedingungen. (A) Kontrolle des Gerinnsels ohne Behandlung. (B) Gerinnsel, das mit Lysotripsie behandelt wurde (z. B. 35 MPa Spitzennegpressdruck, Einzyklusimpulsdauer, 1,5 MHz Grundfrequenz). Der Histotripsiepuls breitete sich in diesem Bild von oben nach unten aus. Der Pfad für die Histotripsiequelle entlang der Länge des Gerinnsels (d. h. senkrecht zur Ebene des hier gezeigten Bildes) wird in Schritt 7.2.3 definiert. Der Maßstab der Mikroaufnahmen beträgt 2 mm. Beachten Sie, dass der hier erreichte Grad der Gerinnselstörung im Vergleich zu Insonationsschemata mit längerer Pulsdauer reduziert würde24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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