Methodenartikel

Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

DOI:

10.3791/62592

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13. Juni 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Zusammenfassung

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Die erfolgreiche biochemische und biophysikalische Charakterisierung von ABC-Transportern hängt stark von der Wahl des heterologen Expressionssystems ab. In den letzten zwei Jahrzehnten haben wir eine Plattform zur Expression von Hefemembranproteinen entwickelt, mit der viele wichtige Pilzmembranproteine untersucht wurden. Der Expressionswirt Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wird in sieben großen endogenen ABC-Transportern gelöscht und enthält den Transkriptionsfaktor Pdr1-3 mit einer Gain-of-Function-Mutation, die die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteingene ermöglicht, die stabil als Einzelkopien am genomischen PDR5-Locus integriert sind. Die Erstellung vielseitiger Plasmidvektoren und die Optimierung einstufiger Klonierungsstrategien ermöglicht das schnelle und genaue Klonen, die Mutagenese und die Expression heterologer ABC-Transporter. Hier beschreiben wir die Entwicklung und Verwendung eines neuartigen proteasespaltenden mGFPHis-Doppel-Tags (d.h. des monomeren hefeverstärkten grün fluoreszierenden Proteins yEGFP3, das mit einem Sechs-Histidin-Affinitätsreinigungs-Tag verschmolzen ist), das entwickelt wurde, um eine mögliche Interferenz des Tags mit dem interessierenden Protein zu vermeiden und die Bindungseffizienz des His-Tags an Nickelaffinitätsharze zu erhöhen. Die Fusion von mGFPHis mit dem Membranprotein ORF (Open Reading Frame) ermöglicht eine einfache Quantifizierung des Proteins durch Inspektion von Polyacrylamidgelen und Nachweis von Abbauprodukten unter Beibehaltung des mGFPHis-Tags. Wir zeigen, wie diese Funktion das Waschmittel-Screening auf Membranprotein-Solubilisierung erleichtert. Ein Protokoll zur effizienten, schnellen und zuverlässigen Isolierung der kleinräumigen Plasmamembranpräparate des C-terminal markierten Candida albicans Multidrug-Efflux-Transporters Cdr1, überexprimiert in S. cerevisiae ADΔΔ, wird vorgestellt. Dieses kleine Plasmamembran-Isolationsprotokoll erzeugt innerhalb eines einzigen Arbeitstages hochwertige Plasmamembranen. Die Plasmamembranpräparate können verwendet werden, um die Enzymaktivitäten von Cdr1- und Cdr1-Mutantenvarianten zu bestimmen.

Einleitung

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Die Extraktion integraler Membranproteine aus ihrer nativen Lipidumgebung kann ihre Struktur und Funktion dramatisch beeinflussen1,2,3,4. Die komplexe Lipidzusammensetzung biologischer Membranen5 sorgt dafür, dass kritisch wichtige Protein-Lipid-Interaktionen auftreten können6. Lipide erhalten die strukturelle Integrität von Membranproteinen und ermöglichen es ihnen so, in ihrem Membrankompartiment-Ziel(e) korrekt zu funktionieren7,8. Daher ist ein kritischer erster Schritt bei der Reinigung des Membranproteins die Extraktion des Proteins aus seiner nativen Umgebung, ohne seine Struktur und / oder Funktion zu beeinträchtigen.

Es gibt viele Hindernisse für die Charakterisierung der Struktur von Membranproteinen, von denen die meisten mit ihrer hydrophoben Natur zusammenhängen, und die Schwierigkeiten, richtig gefaltete und funktionelle Membranproteine in den Mengen zu exprimieren, die für die Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erforderlich sind9,10,11,12. Es gibt drei Arten von Membranproteinexpressionssystemen: homologe9, heterologe13,14,15und in vitro Expressionssysteme 16,17. Die oft niedrigen Expressionsniveaus oder die unerschwinglichen Kosten vieler Expressionssysteme lassen nur wenige Wirte als bevorzugte Option zur Herstellung von Membranproteinen. Dazu gehören der bakterielle Wirt Escherichia coli,die Hefen S. cerevisiae und Pichia pastorissowie höhere Eukaryoten wie Sf9-Insektenzellen oder Säugetierzelllinien18. Alle Membranproteinexpressionstechnologien haben Vor- und Nachteile; S. cerevisiae ist jedoch vielleicht der am besten untersuchte eukaryotische Modellorganismus, der für die Membranproteinproduktion geeignet ist. Es ist sehr vielseitig mit Anwendungen in der Gentechnik, Wirkstoffforschung, synthetischen Biologie und der Expression von eukaryotischen Membranproteinen14,19,20,21.

In dieser Studie wurde eine patentierte S. cerevisiae Membranproteinexpressionstechnologie21 verwendet, mit S. cerevisiae ADΔ14 und ADΔΔ22 als bevorzugte Wirte (Abbildung 1A), um die Haupt-C. albicans Multidrug-Effluxpumpe Cdr1 zu überexprimieren und zu untersuchen. Beide S. cerevisiae-Stämme sind Derivate von AD1-8u-23, bei denen entweder das ura3 (ADΔ) oder sowohl das ura3- als auch das his1-Gen (ADΔΔ) gelöscht wurden, um falsch positive Uracil- oder Histidin-Prototroph-Transformanten zu eliminieren, die durch die unerwünschte Integration an den genomischen Loci URA3 oder HIS1 entstehen. Die In Abbildung 1Adargestellte Löschung der 7 wichtigsten Multidrug-Effluxpumpen23macht ADΔΔ exquisit empfindlich gegenüber den meisten Xenobiotika. Der Gain-of-Function-Mutanten-Transkriptionsfaktor Pdr1-3 bewirkt die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteine wie Cdr1 (rote Achtecke in Abbildung 1A)nach Integration der heterolog-ORF-haltigen Transformationskassette (Abbildung 1A) am genomischen PDR5-Locus (blaues Rechteck in Abbildung 1A)über zwei homologe Rekombinationsereignisse. Die korrekte Plasmamembranlokalisierung von C-terminal mGFPHis markierten Proteinen kann durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden (Abbildung 1A), und das His-Tag kann zur Nickelaffinitätsreinigung des markierten Proteins verwendet werden. Das Klonen einiger Pilz-ABC-Transporter (z.B. Candida krusei ABC1)in pABC3-abgeleitete Plasmide war jedoch nicht möglich, da sie aufgrund der Zelltoxizität nicht in Escherichia coli vermehrt werden konnten. Dies führte zur Entwicklung des einstufigen Klonens von Membranproteinen14,24, die entweder an ihrem N- oder C-Terminus mit verschiedenen Affinitäts-, Epitop- oder Reporter-Tags direkt in S. cerevisiae ADΔΔ markiert sind (Abbildung 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-Stämme, die verschiedene CDR1-Mutanten überexprimieren, können auf diese Weise auch effizient erzeugt werden, indem bis zu fünf einzelne PCR-Fragmente verwendet werden, die sich um 25 bp überlappen (Abbildung 1C). Mit diesem Protokoll können viele ORFs von Interesse zu niedrigen Kosten und mit hoher Effizienz innerhalb kürzester Zeit geklont, ausgedrückt und charakterisiert werden. Die Transformationseffizienz reduziert sich mit jedem zusätzlichen PCR-Fragment nur ~2-fach. 

Falls gewünscht, können Ausdrucksebenen auch leicht durch Primer-Design manipuliert werden, um die Ausdruckspegel vorhersehbar auf 0,1% bis 50% der normalerweise hohen, konstitutiven Ausdrucksstufen25zu optimieren. Der optimierte, multifunktionale, pABC314 derivative Klonierungsvektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Abbildung 1B) enthält eine HRV-3C-Protease-Spaltungsstelle (X; LEVLFQ| GP), eine Protease, die bei 4 °C besser abschneidet als die häufig verwendete Tabakätzvirus (TEV) Protease27. L ist ein Linker mit fünf Aminosäuren (GSGGS), mGFP ist eine monomere Mutante (A206K)28,29 Version der hefeverstärkten Grünfluoreszenzproteinvariante yEGFP330, und His ist ein Drei-Aminosäure-Linker (GGS), gefolgt von der Sechs-Histidin (HHHHHH) Nickelaffinität Proteinreinigungsmarkierung.

Diese Expressionstechnologie wurde erfolgreich in der Wirkstoffforschung und der Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt. Die erste Struktur für ein Pilzazol-Wirkstoffziel, S. cerevisiae Erg1131, wurde mit dieser Technologie gelöst. Es ermöglichte auch die detaillierte Charakterisierung von C. albicans Cdr132,33,34 und die Schaffung eines Cystein-defizienten Cdr1-Moleküls35, das für Cystein-Vernetzungsstudien geeignet ist, um jede zukünftige hochauflösende Struktur zu verifizieren. Viele andere ABC-Transporter von wichtigen menschlichen Pilzerregern (z. B. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei und der Fusarium solani-Artenkomplex) wurden ebenfalls ausführlich mit dieser Expressionsplattform24,36,37,38,39untersucht. Dies hat die Erzeugung eines Panels von S. cerevisiae-Stämmen ermöglicht, die Überflusspumpen überexprimieren, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen verwendetwurden,um das neuartige fluoreszierende Effluxpumpensubstrat Nilrot40 und spezifische41 und Breitbandpumpeninhibitoren14,33,42, 43,44 zu entdecken. Die Verwendung dieses Systems ermöglichte auch die Entdeckung von Clorgylin als erstem seiner Art Breitband-Pilz-Multidrug-Effluxpumpen-Inhibitor42.

Die vollständige Solubilisierung von Membranproteinen und die Schaffung einer homogenen Membranprotein-Mizellen-Zubereitung ohne endogene Lipide erfordert hohe Waschmittelkonzentrationen45. Leider inaktiviert dadurch aber auch oft das Membranprotein5,8,45,46. Die Eigenschaften von Waschmittelmonomeren und ihre Aggregation in Lösung werden durch die physikalischen Eigenschaften des hydrophoben Schwanzes, die Länge und Verzweigung der Alkylkette, das Vorhandensein eines aromatischen Kerns oder einer Fluoralkylseitenkette oder die Anzahl der Polyoxyethyleneinheiten beeinflusst. Daher ist das Waschmittel-Screening ein wichtiger erster Schritt, um das am besten geeignete Reinigungsmittel für die Membranprotein-Solubilisierung und -reinigung zu bestimmen.

C. albicans ist ein wichtiger menschlicher Pilzerreger immungeschwächter Personen, der schwere, lebensbedrohliche invasive Infektionen verursachen kann47, und es kann resistent gegen Azol-Antimykotika werden48,49. Einer der Hauptmechanismen der Multidrug-Resistenz von C. albicans ist die Überexpression von Cdr150, einem Typ II ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC)51 der ABCG-Unterfamilie, der sich in der Plasmamembran befindet. ABCG-Pilztransporter in voller Größe (bestehend aus zwei Nukleotidbindungsdomänen [NBDs] und zwei Transmembrandomänen [TMDs]) sind häufiger als pleiotrope Arzneimittelresistenztransporter (PDR) bekannt und zeichnen sich durch ihre einzigartige invertierte Domänentopologie [NBD-TMD]2 aus. PDR-Transporter kommen nur in Pflanzen52,53 und Pilzen54 vor. Trotz ihrer Bedeutung gibt es keine Strukturen für PDR-Transporter, obwohl Strukturen für menschliche ABCG-Transporter mittlerer Größe kürzlich gelöst wurden, was dazu beigetragen hat, das erste vorläufige Modell für Cdr133zu erstellen. Unsere jüngsten experimentellen Beweise deuten jedoch darauf hin, dass dieses Modell fehlerhaft ist, möglicherweise weil Pilz-PDR-Transporter charakteristische asymmetrische NBDs haben, was möglicherweise zu einem einzigartigen Transportmechanismus führt. Eine hochauflösende Struktur von Cdr1 ist daher sowohl für das rationale Design neuartiger Effluxpumpeninhibitoren erforderlich, die helfen können, effluxvermittelte Arzneimittelresistenzen zu überwinden, als auch um Einblicke in den Wirkmechanismus dieser wichtigen ABC-Transporterfamilie zu geben.

Ziel dieser Studie war es, zuverlässige Protokolle für die Expression, Solubilisierung und Reinigung von Cdr1 im genetisch veränderten Expressionswirt S. cerevisiae zu entwickeln, mit dem ultimativen Ziel, eine hochauflösende Struktur für Cdr1 zu erhalten. Im Rahmen dieses Prozesses wurde ein proteasespalter mGFPHis-Doppel-Tag (Abbildung 1B) mit einem 16-Rückstands-Linker entwickelt, der den Tag vom C-Terminus von Cdr1 trennt, was die Bindung des angehängten 6x His-Affinitäts-Tags an das Nickelaffinitätsharz verbesserte und die Überwachung der Cdr1-Expressionsniveaus in lebenden Zellen und während des gesamten Reinigungsprozesses ermöglichte. Es wurde auch ein reproduzierbares Protokoll für kleine Hefeplasmamembranproteinpräparate mit etwa 10% C. albicans Cdr1 (wie von Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE geschätzt) entwickelt, das für die biochemische Charakterisierung von Cdr1 verwendet werden könnte.

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Protokoll

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1. Herstellung von frischen oder gefrorenen Umwandlungsbeständen kompetenter ADΔ- und ADΔΔ-Zellen

  1. 25 ml 2x YPCD [d.h. 2x YPD; 2% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 4% (w/v) Dextrose, 0,079% (w/v) CSM (komplette Ergänzungsmischung)]35 Medium mit einer einzigen Hefekolonie bei impfen und über Nacht (o/n) für 16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren.
  2. Impfen Sie 225 ml 2x YPCD-Medium mit der 25 mL o/n-Kultur und überprüfen Sie die optische Zelldichte bei 600 nm (OD600); der OD600 ist normalerweise ~ 0.5-1.0.
    HINWEIS: Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass alle Materialien, die für das folgende Transformationsexperiment benötigt werden, leicht verfügbar sind.
  3. Züchten Sie die Kultur bei 30 °C für weitere ~6-8 h mit Schütteln bei 200 U/min, bis die Zelldichte einen OD600 von ~6-8 erreicht.
    HINWEIS: Die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
  4. Ernten Sie diese logarithmischen Phasenzellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min.
  5. Die Zellen wieder aufwischen und zweimal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser (ddH2O; d.h. 200 ml und dann 20 ml) waschen.
  6. Ernten Sie die Zellen bei 3.000 x g für 3 min.
  7. Langsam (d.h. 30 gleiche Aliquoten gefrorener kompetenter Zelllösung (FCC) jede Minute für 30 min hinzufügen) das Zellpellet in X ml FCC [5% (w/v) Glycerin, 10% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO)] auf Eis resuspendieren (wobei X = OD600;z.B. wenn OD600 = 6 Resuspend in 6 ml oder wenn OD600 = 3 Resuspend in 3 ml).
    HINWEIS: Die korrekte FCC-Zusammensetzung ist entscheidend für den Transformationserfolg.
  8. Halten Sie die Zellen vor der Umwandlung 2 h auf Eis oder lagern Sie Aliquoten bei -80 °C, bis dies erforderlich ist.
    HINWEIS: ADΔ- und ADΔΔ-Zellen sind sehr empfindlich gegen Einfrieren. Daher müssen die Zellen langsam auf -80 °C abgekühlt werden: Eiskalte Mikrozentrifugenröhrchen mit 50-600 μL Zellaliquoten in eine Kunststoff-Aufbewahrungsbox (RT) legen. Legen Sie die Box in einen größeren Polystyrolbehälter (RT) und verschließen Sie den Behälter mit einem passenden Polystyroldeckel. Anschließend den Behälter in den -80 °C Gefrierfach geben.
    VORSICHT: Langsames Einfrieren ist entscheidend für das Überleben der Zellen.

2. Transformation von ADΔ und ADΔΔ mit CaCDR1-XLmGFPHis und Bestätigung korrekter Transformanten durch Kolonie-PCR und DNA-Sequenzierung

HINWEIS: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis wurde unter Verwendung herkömmlicher Klonierungsstrategien erstellt, die ausführlich in Lamping et al., 201055 beschrieben und in Abbildung 1Bdargestellt sind. Wildtyp C. albicans CDR1 wurde als PacI/NotI Fragment aus Plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 isoliert und in pABC3-XLmGFPHis26geklont.

  1. PCR amplifizieren die gesamte CDR1-Transformationskassette mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase und einem Primerpaar PDR5-pro/PDR5-ter35 unter Verwendung von 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis als DNA-Vorlage oder verdauen alternativ 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis bis zur Fertigstellung mit 10 U Restriktionsenzym AscI bei 37 °C (Abbildung 1A,B).
    HINWEIS: Die CDR1-Transformationskassette (Abbildung 1A) umfasst den PDR5-Promotor - CaCDR1-mGFPHis - PGK1-Terminator - URA3-Auswahlmarker - PDR5-Downstream-Bereich.
  2. Führen Sie eine Agarosegelelektrophorese durch und extrahieren Sie die ~ 8 kb Transformationskassette.
    HINWEIS: Die Gelreinigung der ~8 kb CaCDR1-Transformationskassette entfernt jede mögliche unverdaute Plasmid-DNA, die zu falschen Transformanten führen könnte, bei denen das gesamte Plasmid anstelle der linearen Transformationskassette am genomischen PDR5-Locus integriert ist.
  3. Denaturieren Sie die erforderliche Menge an Lachsspermaträger-DNA (2 mg / ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) für 10 min in einem kochenden Wasserbad und halten Sie es auf Eis. Verwenden Sie schraubverschlusse Röhrchen zum Kochen von Lachssperma-DNA, um ein Öffnen des Deckels zu vermeiden.
  4. Mischen Sie 50 μL denaturierte Lachssperma-DNA mit 14 μL der Transformationskassette (500-2.000 ng) und halten Sie die 64 μL DNA-Mischung bis zur weiteren Verwendung auf Eis.
    HINWEIS: Verwenden Sie 10 ng eines E. coli-Hefe-Shuttle-Plasmids (z. B. pYES2) als positive Transformationskontrolle (Abbildung 2B).
  5. Frische oder gefrorene kompetente Zellen schnell für 5 min in einem 30 °C Wasserbad auftauen und in 50 μL Aliquoten in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen teilen.
  6. Ernten Sie Zellen durch Zentrifugation für 1 min in einer Mikrofuge mit maximaler Geschwindigkeit (18.000 x g).
  7. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Zellpellet bei RT.
  8. Mischen Sie für jede Transformation 296 μL-Kombinationen (RT) von 260 μL von 50% (w/v) Polyethylenglykol (PEG 3350) und 36 μL von 1 M Lithiumacetat (LiAc) durch wiederholtes Pipettieren mit den entsprechenden 64 μL eiskalten DNA-Mischungen.
  9. Die entsprechende Mischung sofort in ein 50 μL kompetentes Zellpellet aliquot geben.
  10. Das Zellpellet in der 360 μL PEG-LiAc-DNA-Mischung durch gründliches Vortexen für etwa 30 s wieder aufwirbeln.
  11. Inkubieren Sie die Zellmischung in einem 30 °C Wasserbad für 1 h.
    HINWEIS: ADΔ- und ADΔΔ-Zellen transformieren sich bei 30 °C besser als bei 42 °C35.
  12. Ernten Sie die Zellen bei 18.000 x g für 10 s. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dasZellpellet in 80 μL ddH2 O.
  13. Verteilen Sie die Zellen auf einer CSM-URA-Agarplatte35 [d.h. 0,67% (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 0,077% (w/v) CSM minus Uracil, 2% (w/v) Glukose und 2% (w/v) Agar].
  14. Inkubieren Sie die Platten für 2-3 Tage bei 30 °C, bis Uracil Prototroph-Transformanten deutlich sichtbar sind.
    HINWEIS: Erwarten Sie ~100 Transformanten pro μg der linearen ~8 kb CaCDR1 Transformationskassette und ~4 x 104 Transformanten pro μg pYES2.
  15. Wählen Sie fünf unabhängige Transformanten aus und verteilen Sie sie auf einer frischen CSM-URA-Platte, um die Uracil-Prototroph-Transformanten von Resten nicht transformierter Wirtszellen zu trennen.
  16. Entfernen Sie mögliche zierliche Mutanten, indem Sie die Transformantien auf YPG-Agarplatten züchten [1% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 2% (v/v) Glycerin und 2% (w/v) Agar] (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Zierliche Mutanten haben defekte Mitochondrien und können daher nicht auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wachsen. Sie sind in S. cerevisiae56recht häufig. S. cerevisiae ADΔ und ADΔΔ sind besonders anfällig für den Erwerb des zierlichen Phänotyps.
  17. Führen Sie eine Hefekolonie-PCR durch und bestätigen Sie, dass mindestens drei unabhängige Transformationsmittel korrekt in den genomischen PDR5-Locus integriert sind (Abbildung 1C), indem Sie die gesamte ~ 8 kb CaCDR1-Transformationskassette mit einer spezifischen DNA-Polymerase amplifizieren, die für die Amplifizierung von PCR-Produkten aus unreinen DNA-Vorlagenquellen optimiert ist. Verwenden Sie einen Satz von Primern, die direkt außerhalb der Integrationsstelle binden, und 1 μL Aliquoten von Zellsuspensionen (in ddH2O), die von einzelnen Kolonien als DNA-Vorlagen abgeleitet werden.
    HINWEIS: Diese spezielle DNA-Polymerase amplifiziert zuverlässig ~ 8 kb PCR-Fragmente aus intakten Hefezellen. Für eine zuverlässige Amplifikation sind jedoch 45 PCR-Zyklen erforderlich, und die Hefezellen müssen bei OD600 1-10 in ddH2O resuspendiert werden.
  18. Bestätigen Sie das korrekte ~8 kb PCR-Amplifikationsprodukt durch DNA-Agarosegelelektrophorese eines 1 μL-Teils der PCR-Reaktion.
  19. Überschüssige Amplifikationsprimer aus einem 10 μL-Teil der PCR-Reaktion mit einer Enzymmischung aus einer Einzelstrang-DNA-Exonuklease und einer Phosphatase gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernen, bevor der gesamte ORF mit Teilen der behandelten DNA-Probe mit geeigneten Primern sequenziert wird.

3. Isolationsprotokoll für Hefeplasmamembranen in kleinem Maßstab

  1. Wachsende Hefezellen
    1. Vorkulturiert eine einzelne Hefekolonie in 10 ml YPD bei 30 °C für ~7-8 h mit Schütteln bei 200 U/min.
    2. Impfen Sie 40 ml YPD-Medium mit der 10-ml-Vorkultur und inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C o/n (~16 h) mit Schütteln bei 200 U/min, bis die Zelldichte einen OD600 von 1-3 erreicht.
  2. Ernte von Hefezellen
    1. Ernten Sie 40 OD-Einheiten (ODU; z. B. 1 ml bei einem OD600 von 1 = 1 ODU) logarithmischer Phasenzellen bei 4.200 x g für 5 min bei 4 °C.
    2. Zellen zweimal mit eiskaltem sterilem ddH2O (d.h. 40 ml und dann 1 ml; Erntezellen dazwischen durch Zentrifugation bei 4.200 x g für 5 min bei 4 °C) resuspendieren und waschen.
    3. Das Pellet in 1 ml eiskaltem sterilem ddH2O resuspendieren und die Zellsuspension in ein vorgekühltes (auf Eis) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    4. Erntezellen bei 3.300 x g für 3 min bei 4 °C.
    5. Saugen Sie den Überstand an.
    6. Das Zellpellet wird in 0,5 mL Homogenisierungspuffer [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) Glycerin; pH 7,5] frisch ergänzt mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert.
      HINWEIS: Fügen Sie PMSF immer frisch hinzu, da PMSF bei Wassereinwirkung schnell inaktiviert wird.
      VORSICHT: PMSF ist ein Serinproteasehemmer, der extrem korrosiv und zerstörerisch für Gewebe ist. Es kann irreversible Augenschäden verursachen.
    7. Lagern Sie die Zellsuspension bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort.
  3. Isolierung von Plasmamembranen
    1. Wenn sie gefroren sind, tauen Sie die Zellen auf Eis für ~ 1 h auf.
    2. Der 0,5 mL Zellsuspension werden eiskalte Kieselsäureperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen.
    3. Brechen Sie Zellen mit 6 Wirbelzyklen bei maximaler Schüttelintensität für 1 min, durchsetzt mit 3 min Abkühlperioden auf Eis.
    4. Machen Sie ein dünnes Loch am Boden des Röhrchens mit einer beheizten Skalpellklinge.
    5. Sammeln Sie das gebrochene Zellhomogenat durch den Boden des Rohrs, das in ein anderes eiskaltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr mit einem 10-s-Spin mit niedriger Geschwindigkeit (~ 200 U / min) eingebaut ist.
      HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass die Kieselsäureperlen im Originalröhrchen verbleiben.
    6. Zentrifugieren Sie die Zelle homogenisieren Sie bei 5.156 x g für 5 min bei 4 °C, um Zellreste, ungebrochene Zellen und Kerne zu entfernen.
    7. 450 μL Überstand in ein eiskaltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und zusätzlich 1 ml eiskaltes HB mit frischem PMSF (1 mM) hinzufügen.
      HINWEIS: Dieser Verdünnungsschritt ist entscheidend für die hochwertige Plasmamembranproteinrückgewinnung.
    8. Plasmamembranen bei 17.968 x g für 1 h bei 4 °C ernten und das Plasmamembranpellet durch wiederholtes Pipettieren in 100 μL HB frisch ergänzt mit 1 mM PMSF resuspendieren. Lösen Sie das Zellpellet für eine ordnungsgemäße Plasmamembranhomogenisierung, indem Sie das Zellpellet mit der 100 μL-Pipettenspitze rühren, bevor Sie die 100 μL HB freisetzen und pipettieren.
    9. Messen Sie die Proteinkonzentration der Plasmamembranzubereitung mit einem Protein-Assay-Kit, das mit Puffern kompatibel ist, die Reduktionsmittel und Reinigungsmittel enthalten.
    10. Lagern Sie die Plasmamembranen bei -80 °C oder halten Sie sie zur sofortigen Verwendung auf Eis.

4. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

  1. Montieren Sie die Vorrichtung zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
  2. Für zwei Trenngele (7% Polyacrylamid) mischen Sie 2,1 mL 40% Acrylamid/Bisacrylamid, 3 mL 4x Trennpuffer (1,5 M Tris, 0,4% Natriumdodecylsulfat [SDS] (w/v); pH 8,8) und 6,9 mLddH2O.Fügen Sie 8 μL Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 60 μL 10% Ammoniumpersulfat (APS) hinzu, um die Polymerisation von Acrylamid zu initiieren.
    ACHTUNG: Acrylamid/Bis-Acrylamid ist sehr giftig. Es verursacht Hautreizungen, periphere Neuropathie und ist krebserregend. TEMED ist schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird. APS ist schädlich, wenn es verschluckt wird. Es verursacht schwere Augen- und Hautirritationen.
  3. Gießen Sie ~ 4-5 ml dieser Mischung in die zusammengesetzte Gelvorrichtung, bis zu ~ 2 cm von der Oberseite entfernt.
  4. Schichten Sie vorsichtig ~ 1-2 ml 0,1% SDS darauf, um einen planaren Meniskus zu erzeugen.
  5. Lassen Sie das Polyacrylamid bei RT auf ~60 min einstellen.
  6. Bereiten Sie eine Stapelgelmischung für zwei Gele vor, indem Sie 0,5 mL 40% Acrylamid/ Bis-Acrylamid, 1 mL 4x Stapelpuffer (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v); pH 6,8) und 6,9 mL ddH2O mischen. Fügen Sie 2 μL TEMED und 30 μL 10% APS hinzu, um die Polymerisation von Acrylamid zu initiieren.
  7. Entfernen Sie die 0,1% SDS-Schicht aus dem polymerisierten Trenngel und spülen Sie mit ddH2O ab, um Spuren von SDS zu entfernen.
  8. Gießen Sie die Stapelgelmischung auf das Trenngel.
  9. Legen Sie einen Kamm in das Stapelgel und entfernen Sie alle Luftblasen um den Kamm herum.
  10. Lassen Sie das Stapelgel auf ~ 60 minuten bei RT einstellen.
  11. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie die Gelschlitze mit Wasser ab. Legen Sie das Gel in den Geltank und füllen Sie den Geltank nach oben mit 1x Laufpuffer (24,8 mM Tris, 190 mM Glycin, 0,1% SDS).
    HINWEIS: Bereiten Sie 1x Laufpuffer aus einem 10x Pufferlager (248 mM Tris, 1,9 M Glycin, 1% SDS (w/v) in ddH 2 O) vor, das bei RTgelagertwird.
  12. Mischen Sie 5-10 μL Plasmamembranproben (d.h. 10-20 μg Protein) mit gleichen Mengen an 2x Proteinbeladungsfarbstoff [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% Glycerin, 0,02% Bromphenolblau, 4% SDS, 200 mM Dithiothreitol (DTT)] und laden Sie sie sofort in einzelne Gelschlitze, die in Laufpuffer getaumpft sind.
    ACHTUNG: DTT ist schädlich, wenn es verschluckt wird. Es verursacht schwere Augen- und Hautirritationen.
    HINWEIS: Machen Sie einen 10 ml Vorrat von 2x Proteinladungsfarbstoff, aliquot und lagern Sie bei -20 °C. Erhitzen Sie die gemischten Proben nicht, sondern laden Sie sie sofort in einzelne Gelschlitze, damit der GFP-Tag nicht denaturiert wird und die In-Gel-Fluoreszenzsignale detektiert werden können.
  13. Laden Sie Proteinmolekulargewichtsmarker (10-245 kDa-Bereich) in einen separaten Slot, um die Größenschätzung einzelner Proteinfragmente zu ermöglichen.
  14. Führen Sie eine Gelelektrophorese bei 200 V durch, bis der blaue Ladefarbstoff den Boden des Gels erreicht (normalerweise 45-55 min).
  15. Untersuchen Sie das Gel auf In-Gel-GFP-Fluoreszenz mit einem Gel-Bildgebungssystem (Anregungs- und Emissionswellenlängen sind 475-485 nm bzw. 520 nm).
  16. Nach der In-Gel-Fluoreszenzbildgebung fixieren Sie Proteine durch sanftes Rühren des Gels in ~ 10-20 ml Protein Gel Fixing Solution (40% Ethanol, 10% Essigsäure) für 15 min bei RT.
  17. Spülen Sie das Gel zweimal für 10 min mit 10 ml ddH2O und visualisieren Sie Proteinbänder, indem Sie das Gel in 10 ml kolloidale Coomassie-Fleckenlösung mit sanftem Schütteln für ~ 1 h bei RT legen.
  18. Für eine verbesserte Visualisierung von Proteinbändern entfärben Sie das Gel ein- oder zweimal in ~ 20 ml ddH2O für ~ 1 h, bevor Sie Bilder mit dem Gel-Bildgebungssystem aufnehmen.

5. Bestimmung der Cdr1-ATPase-Aktivitäten 57

  1. Verdünnte Plasmamembranproben >2,2 mg/ml bis 1-2 mg/ml in HB.
  2. Den ATPase-Assay-Cocktail (75 mM MES-Tris, 75 mM Kaliumnitrat, 0,3 mM Ammoniummolybdat, 7,5 mM Natriumazid; pH 7,5) und Mg-ATP (28,8mM ATP-Natriumsalz, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) wird in einem 30 °C-Inkubator auf 30 °C ausgeglichen.
    ACHTUNG: Natriumazid ist hochgiftig.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Puffervorräte und Flaschen phosphatfrei sind. d.h. Glaswaren mit 1% (vol/vol) HCl waschen und mehrfach mit ddH2O abspülen. Halten Sie es auch getrennt von anderen Glaswaren, die wahrscheinlich Spuren von Phosphat enthalten, die üblicherweise in Reinigungsmitteln zum Waschen von Glaswaren vorhanden sind.
  3. 90 μL Assay-Cocktail mit oder ohne Cdr1-ATPase-Inhibitor (20 μM Oligomycin) in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geben.
    HINWEIS: Der Assay wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
  4. Fügen Sie 5 μL der isolierten Plasmamembranen (~ 5-10 μg Protein) oder Phosphatstandards (0-100 nmole Pi) in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte hinzu.
    HINWEIS: Behalten Sie die erste und letzte Spalte für zwei separate Sätze von Phosphatstandards bei.
  5. Beginnen Sie den Assay, indem Sie 25 μL vorgewarnte 28,8 mM Mg-ATP (6 mM Endkonzentration) mit einer Mehrkanalpipette in einzelne Vertiefungen geben und bei 30 °C für 30 min inkubieren.
  6. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 130 μL Entwicklungsreagenz (1,6% Natrium-L-Ascorbat, 1% SDS, 12% Ammoniummolybdat in 6 M Schwefelsäure).
    ACHTUNG: Konzentrierte Schwefelsäure reagiert heftig mit Wasser. Es ist ätzend und kann Haut- und Lungenschäden verursachen.
  7. Bei RT für 10 min inkubieren.
  8. Lesen Sie die Absorption der Mikrotiterplattenschächte bei 750 nm mit einem Mikrotiterplattenleser ab.
    HINWEIS: Die Einhaltung der 10-minütigen Inkubationszeit für die Entwicklung blauer Farbstoffe (d. H. Ein reduzierter Phosphor-Molybdän-Komplex) ist entscheidend für die Assay-Genauigkeit, da die Entwicklung des blauen Farbstoffs mit der Zeit fortgesetzt wird.
  9. Erhalten Sie die Cdr1-spezifische ATPase-Aktivität (d. h. die Oligomycin-sensitive ATPase-Aktivität), indem Sie die ATPase-Aktivität in Gegenwart von Oligomycin von der gesamten ATPase-Aktivität in Abwesenheit von Oligomycin subtrahieren.

6. Kleines Reinigungsmittelsieb

  1. Kombinieren Sie die Plasmamembranpräparate (d. h. 2,5 mg Plasmamembranprotein) von Zellen, die Cdr1-mGFPHis überexprimieren, mit GTED-20-Puffer [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) Glycerin; pH 7,5; frisch ergänzt mit 1 mM PMSF] mit 5 mg des Testwaschmittels, um ein Gesamtvolumen von 0,5 ml zu erreichen, das mit 1% (w/v) Reinigungsmittel ergänzt wird.
  2. Drehen Sie die Mischung bei 4-8 °C für 2 h mit einer Rotationsvorrichtung.
  3. Zentrifuge das Gemisch bei 141.000 x g bei 4 °C für 1 h.
  4. Den Überstand, der solubilisiertes Material enthält, in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
  5. 0,5 ml GTED-20-Puffer mit 2% (w/v) SDS in die unlösliche Pelletfraktion geben und bei 30 °C o/n in einem Schüttelinkubator inkubieren, um das gesamte waschmittelunlösliche Membranprotein zu extrahieren.
  6. Analysieren und vergleichen Sie die überstandenden und gelösten Pelletfraktionen mit SDS-PAGE.
  7. Fotografieren Sie Gele, die GFP-markierte Proteine für die GFP-Fluoreszenz im Gel enthalten, bevor Sie sich mit Coomassie färben, und quantifizieren Sie die Expressionsniveaus mit dem Bildgebungssystem.
  8. Verwenden Sie die lösliche Membranproteinfraktion für nachgelagerte Anwendungen wie die Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie (FSEC)58, um geeignete Reinigungsmittel zu identifizieren.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine hohe Transformationsfrequenz von S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 Transformanten/μg) wurde mit pYES2 erreicht (Abbildung 2B). Wie erwartet, ergab die No-DNA-Kontrolle (d.h. nur ddH2O) keine Transformanten, und 1 μg der linearen CDR1-mGFPHis Transformationskassette (Abbildung 1A) ergab ~ 50 Transformanten (Abbildung 2C) mit dem optimierten ADΔΔ-Transformationsprotokoll. Die CDR1

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Strukturanalyse von Membranproteinen ist derzeit keine 3D-Struktur für Cdr1 oder einen anderen PDR-Transporter verfügbar. Daher ist es wichtig, Kenntnisse über die Cdr1-Struktur und ihre biochemischen Eigenschaften zu gewinnen, da dies nicht nur Einblicke in das rationale Design neuartiger Medikamente zur Überwindung von effluxvermittelter Arzneimittelresistenz geben wird, sondern auch in den Funktionsmechanismus einer wichtigen Unterfamilie von ABC-Proteinen.

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Finanzierung durch den New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) und einem Blockzuschuss der Medizinischen Fakultät der Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Sie danken der University of Otago für die Bereitstellung eines Promotionsstipendiums für G. Madani. Die Autoren danken auch Professor Stefan Raunser und seinen Kollegen Dr. Amir Apelbaum und Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam für ihre Unterstützung und Betreuung während eines 6-monatigen Besuchs von G. Madani am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie (MPIMP), Dortmund, Deutschland. Die Autoren danken auch dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) für die Bereitstellung eines Forschungsstipendiums (57381332) für den Besuch des MPIMP durch G. Madani.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-(N-Morpholino)ethan-sulfonsäure (MES)Sigma-AldrichM3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Trisbase; hochrein)Merck77-86-1
2,2-Didecylpropan-1,3-bis-β-D-MaltopyranosidAnatraceNG310SLMNG
2,2-Dihexylpropan-1,3-bis-β-D-GlucopyranosidAnatraceNG311SOGNG (MNG-OG
)2,2-Dioctylpropan-1,3-bis-β-D-MaltopyranosidAnatraceNG322SDMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-MaltopyranosidGlycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% Acrylamid/Bis-acrylamid (37,5:1)Bio-Rad1610148
Essigsäure (glazial)Merck64-19-7
AgarFormedium  009002-18-0
AmmoniummolybdatSigma-Aldrich13106-76-8
Ammoniumpersulfat (APS)Bio-Rad1610700
ATP-Dinatriumsalzsigma-AldrichA-6419
BromphenolblauSERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM minus UracilFormediumDCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceC324SCYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceC327SCYMAL-7
Cyclohexylmethyl-β- D-MaltopyranosidAnatraceC321SCYMAL-1
DigitoninSigma-Aldrich11024-24-1
Dithiothreitol (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
EthanolMerck459836
Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR-Produkt AufreinigungsreagenzAngewandte Biosysteme78205Eine Mischung aus Exonuklease und
Phosphatase GlucoseFormedium50-99-7
GlycerinMerck56-81-5
GlycinMerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
SalzsäureMerck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201Verwendung für zuverlässige Kolonie-PCR
Lithiumacetat (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
Magnesiumchlorid-Hexahydratsigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamidAnatraceH110SHEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamidAnatraceM320SMEGA-10
n-Decyl-phosphocholinAnatraceF304SFos-cholin-10
n-Decyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceD322SDM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonatAnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamin-N-oxidAnatraceD360SLDAO
n-Dodecyl-α-D-MaltopyranosidAnatraceD310HAα-DDM
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceD310Sβ-DDM
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosidAnatraceN324SNG
n-Nonyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceN330SNM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonatAnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonatAnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-OctylphosphocholinAnatraceF300SFos-cholin-8
n-Octyl-β-D-GlucopyranosidAnatraceO311SOG
n-Tetradecyl-phosphocholinAnatraceF312SFos-cholin-14
n-Tetradecyl-β-D-MaltopyranosidAnatraceT315STDM
n-TridecylphosphocholinAnatraceF310SFos-cholin-13
n-Tridecyl-β- D-MaltopyranosidAnatraceT323S-n-Undecyl
-β-D-MaltopyranosidAnatraceU300SUM (UDM
)n,n,n',n'-Tetramethyl-ethylendiamin (TEMED)Sigma-AldrichT9281
OctylphenoxypolyethoxyethanolSigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PeptonFormedium3049-73-7
phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion  Hot Start Flex DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0535SHigh-Fidelity DNA-Polymerase
Polyethylenglykol (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
PolyoxyethylenesorbitanmonooleatSigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
KaliumnitratSigma-AldrichP8394
Protein Assay KitBio-Rad5000122RC DC Protein Assay Kit II
QC Kolloidale Coomassie StainBio-Rad1610803
Prism Ultra Protein Leiter (10-245 kDa)AbcamAB116028
NatriumazidSigma-Aldrich71289
NatriumdodecylsulfatSigma-Aldrich151-21-3SDS
Natrium-L-Ascorbat BioXtraSigma-Aldrich11140
Saccharose MonododecanoatAnatraceS350SDDS
SchwefelsäureSigma-Aldrich339741
HefeextraktFormedium008013-01-2
Hefestickstoffbase ohne AminosäurenFormediumCYN0402
  Ausrüstung (Typ)
Zentrifuge  (Eppendorf 5804)
(Beckman Ultra)
(Sorvall RC6)Sorvall
FSEC-Gerät (NGC-Chromatographie-Mitteldrucksystem mit einem Fluoreszenzdetektor, einem Autosampler, einem Fraktionator)Bio-Rad
Gel-Bildgebung (GelDoc EZ Imager)Bio-Rad
Mikroplatten-Reader (Synergy 2 Multi-Detection)BioTek Instruments
PCR-Thermocycler (C1000 Touch)Bio-Rad
Netzteil (PowerPac)Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
Shaking Inkubator (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Erhöhung 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
UV/sichtbares Spektralphotometer (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd
Eppendorf-Zentrifuge Beckman-Zentrifuge

Referenzen

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