Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Die Extraktion integraler Membranproteine aus ihrer nativen Lipidumgebung kann ihre Struktur und Funktion dramatisch beeinflussen^1,2,3,4. Die komplexe Lipidzusammensetzung biologischer Membranen⁵ sorgt dafür, dass kritisch wichtige Protein-Lipid-Interaktionen auftreten können⁶. Lipide erhalten die strukturelle Integrität von Membranproteinen und ermöglichen es ihnen so, in ihrem Membrankompartiment-Ziel(e) korrekt zu funktionieren^7,8. Daher ist ein kritischer erster Schritt bei der Reinigung des Membranproteins die Extraktion des Proteins aus seiner nativen Umgebung, ohne seine Struktur und / oder Funktion zu beeinträchtigen.

Es gibt viele Hindernisse für die Charakterisierung der Struktur von Membranproteinen, von denen die meisten mit ihrer hydrophoben Natur zusammenhängen, und die Schwierigkeiten, richtig gefaltete und funktionelle Membranproteine in den Mengen zu exprimieren, die für die Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erforderlich sind^9,10,11,12. Es gibt drei Arten von Membranproteinexpressionssystemen: homologe⁹, heterologe^13,14,15und in vitro Expressionssysteme ^16,17. Die oft niedrigen Expressionsniveaus oder die unerschwinglichen Kosten vieler Expressionssysteme lassen nur wenige Wirte als bevorzugte Option zur Herstellung von Membranproteinen. Dazu gehören der bakterielle Wirt Escherichia coli,die Hefen S. cerevisiae und Pichia pastorissowie höhere Eukaryoten wie Sf9-Insektenzellen oder Säugetierzelllinien^18. Alle Membranproteinexpressionstechnologien haben Vor- und Nachteile; S. cerevisiae ist jedoch vielleicht der am besten untersuchte eukaryotische Modellorganismus, der für die Membranproteinproduktion geeignet ist. Es ist sehr vielseitig mit Anwendungen in der Gentechnik, Wirkstoffforschung, synthetischen Biologie und der Expression von eukaryotischen Membranproteinen^14,19,20,21.

In dieser Studie wurde eine patentierte S. cerevisiae Membranproteinexpressionstechnologie²¹ verwendet, mit S. cerevisiae ADΔ¹⁴ und ADΔΔ²² als bevorzugte Wirte (Abbildung 1A), um die Haupt-C. albicans Multidrug-Effluxpumpe Cdr1 zu überexprimieren und zu untersuchen. Beide S. cerevisiae-Stämme sind Derivate von AD1-8u^-23, bei denen entweder das ura3 (ADΔ) oder sowohl das ura3- als auch das his1-Gen (ADΔΔ) gelöscht wurden, um falsch positive Uracil- oder Histidin-Prototroph-Transformanten zu eliminieren, die durch die unerwünschte Integration an den genomischen Loci URA3 oder HIS1 entstehen. Die In Abbildung 1Adargestellte Löschung der 7 wichtigsten Multidrug-Effluxpumpen²³macht ADΔΔ exquisit empfindlich gegenüber den meisten Xenobiotika. Der Gain-of-Function-Mutanten-Transkriptionsfaktor Pdr1-3 bewirkt die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteine wie Cdr1 (rote Achtecke in Abbildung 1A)nach Integration der heterolog-ORF-haltigen Transformationskassette (Abbildung 1A) am genomischen PDR5-Locus (blaues Rechteck in Abbildung 1A)über zwei homologe Rekombinationsereignisse. Die korrekte Plasmamembranlokalisierung von C-terminal mGFPHis markierten Proteinen kann durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden (Abbildung 1A), und das His-Tag kann zur Nickelaffinitätsreinigung des markierten Proteins verwendet werden. Das Klonen einiger Pilz-ABC-Transporter (z.B. Candida krusei ABC1)in pABC3-abgeleitete Plasmide war jedoch nicht möglich, da sie aufgrund der Zelltoxizität nicht in Escherichia coli vermehrt werden konnten. Dies führte zur Entwicklung des einstufigen Klonens von Membranproteinen¹⁴,^24, die entweder an ihrem N- oder C-Terminus mit verschiedenen Affinitäts-, Epitop- oder Reporter-Tags direkt in S. cerevisiae ADΔΔ markiert sind (Abbildung 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-Stämme, die verschiedene CDR1-Mutanten überexprimieren, können auf diese Weise auch effizient erzeugt werden, indem bis zu fünf einzelne PCR-Fragmente verwendet werden, die sich um 25 bp überlappen (Abbildung 1C). Mit diesem Protokoll können viele ORFs von Interesse zu niedrigen Kosten und mit hoher Effizienz innerhalb kürzester Zeit geklont, ausgedrückt und charakterisiert werden. Die Transformationseffizienz reduziert sich mit jedem zusätzlichen PCR-Fragment nur ~2-fach. 

Falls gewünscht, können Ausdrucksebenen auch leicht durch Primer-Design manipuliert werden, um die Ausdruckspegel vorhersehbar auf 0,1% bis 50% der normalerweise hohen, konstitutiven Ausdrucksstufen²⁵zu optimieren. Der optimierte, multifunktionale, pABC3¹⁴ derivative Klonierungsvektor, pABC3-XLmGFPHis²⁶ (Abbildung 1B) enthält eine HRV-3C-Protease-Spaltungsstelle (X; LEVLFQ| GP), eine Protease, die bei 4 °C besser abschneidet als die häufig verwendete Tabakätzvirus (TEV) Protease²⁷. L ist ein Linker mit fünf Aminosäuren (GSGGS), mGFP ist eine monomere Mutante (A206K)^28,29 Version der hefeverstärkten Grünfluoreszenzproteinvariante yEGFP3³⁰, und His ist ein Drei-Aminosäure-Linker (GGS), gefolgt von der Sechs-Histidin (HHHHHH) Nickelaffinität Proteinreinigungsmarkierung.

Diese Expressionstechnologie wurde erfolgreich in der Wirkstoffforschung und der Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt. Die erste Struktur für ein Pilzazol-Wirkstoffziel, S. cerevisiae Erg11³¹, wurde mit dieser Technologie gelöst. Es ermöglichte auch die detaillierte Charakterisierung von C. albicans Cdr1^32,33,34 und die Schaffung eines Cystein-defizienten Cdr1-Moleküls^35, das für Cystein-Vernetzungsstudien geeignet ist, um jede zukünftige hochauflösende Struktur zu verifizieren. Viele andere ABC-Transporter von wichtigen menschlichen Pilzerregern (z. B. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei und der Fusarium solani-Artenkomplex) wurden ebenfalls ausführlich mit dieser Expressionsplattform^{24,36,37,38,39}untersucht. Dies hat die Erzeugung eines Panels von S. cerevisiae-Stämmen ermöglicht, die Überflusspumpen überexprimieren, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen verwendet^wurden,um das neuartige fluoreszierende Effluxpumpensubstrat Nilrot⁴⁰ und spezifische⁴¹ und Breitbandpumpeninhibitoren^{14,33,42, 43,44} zu entdecken. Die Verwendung dieses Systems ermöglichte auch die Entdeckung von Clorgylin als erstem seiner Art Breitband-Pilz-Multidrug-Effluxpumpen-Inhibitor⁴².

Die vollständige Solubilisierung von Membranproteinen und die Schaffung einer homogenen Membranprotein-Mizellen-Zubereitung ohne endogene Lipide erfordert hohe Waschmittelkonzentrationen⁴⁵. Leider inaktiviert dadurch aber auch oft das Membranprotein^5,8,45,46. Die Eigenschaften von Waschmittelmonomeren und ihre Aggregation in Lösung werden durch die physikalischen Eigenschaften des hydrophoben Schwanzes, die Länge und Verzweigung der Alkylkette, das Vorhandensein eines aromatischen Kerns oder einer Fluoralkylseitenkette oder die Anzahl der Polyoxyethyleneinheiten beeinflusst. Daher ist das Waschmittel-Screening ein wichtiger erster Schritt, um das am besten geeignete Reinigungsmittel für die Membranprotein-Solubilisierung und -reinigung zu bestimmen.

C. albicans ist ein wichtiger menschlicher Pilzerreger immungeschwächter Personen, der schwere, lebensbedrohliche invasive Infektionen verursachen kann⁴⁷, und es kann resistent gegen Azol-Antimykotika werden^48,49. Einer der Hauptmechanismen der Multidrug-Resistenz von C. albicans ist die Überexpression von Cdr1⁵⁰, einem Typ II ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC)⁵¹ der ABCG-Unterfamilie, der sich in der Plasmamembran befindet. ABCG-Pilztransporter in voller Größe (bestehend aus zwei Nukleotidbindungsdomänen [NBDs] und zwei Transmembrandomänen [TMDs]) sind häufiger als pleiotrope Arzneimittelresistenztransporter (PDR) bekannt und zeichnen sich durch ihre einzigartige invertierte Domänentopologie [NBD-TMD]_{2 aus.} PDR-Transporter kommen nur in Pflanzen^52,53 und Pilzen^{54 vor.} Trotz ihrer Bedeutung gibt es keine Strukturen für PDR-Transporter, obwohl Strukturen für menschliche ABCG-Transporter mittlerer Größe kürzlich gelöst wurden, was dazu beigetragen hat, das erste vorläufige Modell für Cdr1³³zu erstellen. Unsere jüngsten experimentellen Beweise deuten jedoch darauf hin, dass dieses Modell fehlerhaft ist, möglicherweise weil Pilz-PDR-Transporter charakteristische asymmetrische NBDs haben, was möglicherweise zu einem einzigartigen Transportmechanismus führt. Eine hochauflösende Struktur von Cdr1 ist daher sowohl für das rationale Design neuartiger Effluxpumpeninhibitoren erforderlich, die helfen können, effluxvermittelte Arzneimittelresistenzen zu überwinden, als auch um Einblicke in den Wirkmechanismus dieser wichtigen ABC-Transporterfamilie zu geben.

Ziel dieser Studie war es, zuverlässige Protokolle für die Expression, Solubilisierung und Reinigung von Cdr1 im genetisch veränderten Expressionswirt S. cerevisiae zu entwickeln, mit dem ultimativen Ziel, eine hochauflösende Struktur für Cdr1 zu erhalten. Im Rahmen dieses Prozesses wurde ein proteasespalter mGFPHis-Doppel-Tag (Abbildung 1B) mit einem 16-Rückstands-Linker entwickelt, der den Tag vom C-Terminus von Cdr1 trennt, was die Bindung des angehängten 6x His-Affinitäts-Tags an das Nickelaffinitätsharz verbesserte und die Überwachung der Cdr1-Expressionsniveaus in lebenden Zellen und während des gesamten Reinigungsprozesses ermöglichte. Es wurde auch ein reproduzierbares Protokoll für kleine Hefeplasmamembranproteinpräparate mit etwa 10% C. albicans Cdr1 (wie von Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE geschätzt) entwickelt, das für die biochemische Charakterisierung von Cdr1 verwendet werden könnte.

1. Herstellung von frischen oder gefrorenen Umwandlungsbeständen kompetenter ADΔ- und ADΔΔ-Zellen

1. 25 ml 2x YPCD [d.h. 2x YPD; 2% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 4% (w/v) Dextrose, 0,079% (w/v) CSM (komplette Ergänzungsmischung)]³⁵ Medium mit einer einzigen Hefekolonie bei impfen und über Nacht (o/n) für 16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren.
2. Impfen Sie 225 ml 2x YPCD-Medium mit der 25 mL o/n-Kultur und überprüfen Sie die optische Zelldichte bei 600 nm (OD_600); der OD₆₀₀ ist normalerweise ~ 0.5-1.0.
   HINWEIS: Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass alle Materialien, die für das folgende Transformationsexperiment benötigt werden, leicht verfügbar sind.
3. Züchten Sie die Kultur bei 30 °C für weitere ~6-8 h mit Schütteln bei 200 U/min, bis die Zelldichte einen OD₆₀₀ von ~6-8 erreicht.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
4. Ernten Sie diese logarithmischen Phasenzellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min.
5. Die Zellen wieder aufwischen und zweimal mit sterilem doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O; d.h. 200 ml und dann 20 ml) waschen.
6. Ernten Sie die Zellen bei 3.000 x g für 3 min.
7. Langsam (d.h. 30 gleiche Aliquoten gefrorener kompetenter Zelllösung (FCC) jede Minute für 30 min hinzufügen) das Zellpellet in X ml FCC [5% (w/v) Glycerin, 10% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO)] auf Eis resuspendieren (wobei X = OD_600;z.B. wenn OD₆₀₀ = 6 Resuspend in 6 ml oder wenn OD₆₀₀ = 3 Resuspend in 3 ml).
   HINWEIS: Die korrekte FCC-Zusammensetzung ist entscheidend für den Transformationserfolg.
8. Halten Sie die Zellen vor der Umwandlung 2 h auf Eis oder lagern Sie Aliquoten bei -80 °C, bis dies erforderlich ist.
   HINWEIS: ADΔ- und ADΔΔ-Zellen sind sehr empfindlich gegen Einfrieren. Daher müssen die Zellen langsam auf -80 °C abgekühlt werden: Eiskalte Mikrozentrifugenröhrchen mit 50-600 μL Zellaliquoten in eine Kunststoff-Aufbewahrungsbox (RT) legen. Legen Sie die Box in einen größeren Polystyrolbehälter (RT) und verschließen Sie den Behälter mit einem passenden Polystyroldeckel. Anschließend den Behälter in den -80 °C Gefrierfach geben.
   VORSICHT: Langsames Einfrieren ist entscheidend für das Überleben der Zellen.

2. Transformation von ADΔ und ADΔΔ mit CaCDR1-XLmGFPHis und Bestätigung korrekter Transformanten durch Kolonie-PCR und DNA-Sequenzierung

HINWEIS: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis wurde unter Verwendung herkömmlicher Klonierungsstrategien erstellt, die ausführlich in Lamping et al., 2010⁵⁵ beschrieben und in Abbildung 1Bdargestellt sind. Wildtyp C. albicans CDR1 wurde als PacI/NotI Fragment aus Plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP¹⁴ isoliert und in pABC3-XLmGFPHis²⁶geklont.

1. PCR amplifizieren die gesamte CDR1-Transformationskassette mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase und einem Primerpaar PDR5-pro/PDR5-ter³⁵ unter Verwendung von 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis als DNA-Vorlage oder verdauen alternativ 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis bis zur Fertigstellung mit 10 U Restriktionsenzym AscI bei 37 °C (Abbildung 1A,B).
   HINWEIS: Die CDR1-Transformationskassette (Abbildung 1A) umfasst den PDR5-Promotor - CaCDR1-mGFPHis - PGK1-Terminator - URA3-Auswahlmarker - PDR5-Downstream-Bereich.
2. Führen Sie eine Agarosegelelektrophorese durch und extrahieren Sie die ~ 8 kb Transformationskassette.
   HINWEIS: Die Gelreinigung der ~8 kb CaCDR1-Transformationskassette entfernt jede mögliche unverdaute Plasmid-DNA, die zu falschen Transformanten führen könnte, bei denen das gesamte Plasmid anstelle der linearen Transformationskassette am genomischen PDR5-Locus integriert ist.
3. Denaturieren Sie die erforderliche Menge an Lachsspermaträger-DNA (2 mg / ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) für 10 min in einem kochenden Wasserbad und halten Sie es auf Eis. Verwenden Sie schraubverschlusse Röhrchen zum Kochen von Lachssperma-DNA, um ein Öffnen des Deckels zu vermeiden.
4. Mischen Sie 50 μL denaturierte Lachssperma-DNA mit 14 μL der Transformationskassette (500-2.000 ng) und halten Sie die 64 μL DNA-Mischung bis zur weiteren Verwendung auf Eis.
   HINWEIS: Verwenden Sie 10 ng eines E. coli-Hefe-Shuttle-Plasmids (z. B. pYES2) als positive Transformationskontrolle (Abbildung 2B).
5. Frische oder gefrorene kompetente Zellen schnell für 5 min in einem 30 °C Wasserbad auftauen und in 50 μL Aliquoten in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen teilen.
6. Ernten Sie Zellen durch Zentrifugation für 1 min in einer Mikrofuge mit maximaler Geschwindigkeit (18.000 x g).
7. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Zellpellet bei RT.
8. Mischen Sie für jede Transformation 296 μL-Kombinationen (RT) von 260 μL von 50% (w/v) Polyethylenglykol (PEG 3350) und 36 μL von 1 M Lithiumacetat (LiAc) durch wiederholtes Pipettieren mit den entsprechenden 64 μL eiskalten DNA-Mischungen.
9. Die entsprechende Mischung sofort in ein 50 μL kompetentes Zellpellet aliquot geben.
10. Das Zellpellet in der 360 μL PEG-LiAc-DNA-Mischung durch gründliches Vortexen für etwa 30 s wieder aufwirbeln.
11. Inkubieren Sie die Zellmischung in einem 30 °C Wasserbad für 1 h.
    HINWEIS: ADΔ- und ADΔΔ-Zellen transformieren sich bei 30 °C besser als bei 42 °C³⁵.
12. Ernten Sie die Zellen bei 18.000 x g für 10 s. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dasZellpellet in 80 μL ddH2 O.
13. Verteilen Sie die Zellen auf einer CSM-URA-Agarplatte³⁵ [d.h. 0,67% (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 0,077% (w/v) CSM minus Uracil, 2% (w/v) Glukose und 2% (w/v) Agar].
14. Inkubieren Sie die Platten für 2-3 Tage bei 30 °C, bis Uracil Prototroph-Transformanten deutlich sichtbar sind.
    HINWEIS: Erwarten Sie ~100 Transformanten pro μg der linearen ~8 kb CaCDR1 Transformationskassette und ~4 x 10⁴ Transformanten pro μg pYES2.
15. Wählen Sie fünf unabhängige Transformanten aus und verteilen Sie sie auf einer frischen CSM-URA-Platte, um die Uracil-Prototroph-Transformanten von Resten nicht transformierter Wirtszellen zu trennen.
16. Entfernen Sie mögliche zierliche Mutanten, indem Sie die Transformantien auf YPG-Agarplatten züchten [1% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 2% (v/v) Glycerin und 2% (w/v) Agar] (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Zierliche Mutanten haben defekte Mitochondrien und können daher nicht auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wachsen. Sie sind in S. cerevisiae⁵⁶recht häufig. S. cerevisiae ADΔ und ADΔΔ sind besonders anfällig für den Erwerb des zierlichen Phänotyps.
17. Führen Sie eine Hefekolonie-PCR durch und bestätigen Sie, dass mindestens drei unabhängige Transformationsmittel korrekt in den genomischen PDR5-Locus integriert sind (Abbildung 1C), indem Sie die gesamte ~ 8 kb CaCDR1-Transformationskassette mit einer spezifischen DNA-Polymerase amplifizieren, die für die Amplifizierung von PCR-Produkten aus unreinen DNA-Vorlagenquellen optimiert ist. Verwenden Sie einen Satz von Primern, die direkt außerhalb der Integrationsstelle binden, und 1 μL Aliquoten von Zellsuspensionen (in ddH₂O), die von einzelnen Kolonien als DNA-Vorlagen abgeleitet werden.
    HINWEIS: Diese spezielle DNA-Polymerase amplifiziert zuverlässig ~ 8 kb PCR-Fragmente aus intakten Hefezellen. Für eine zuverlässige Amplifikation sind jedoch 45 PCR-Zyklen erforderlich, und die Hefezellen müssen bei OD₆₀₀ 1-10 in ddH₂O resuspendiert werden.
18. Bestätigen Sie das korrekte ~8 kb PCR-Amplifikationsprodukt durch DNA-Agarosegelelektrophorese eines 1 μL-Teils der PCR-Reaktion.
19. Überschüssige Amplifikationsprimer aus einem 10 μL-Teil der PCR-Reaktion mit einer Enzymmischung aus einer Einzelstrang-DNA-Exonuklease und einer Phosphatase gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernen, bevor der gesamte ORF mit Teilen der behandelten DNA-Probe mit geeigneten Primern sequenziert wird.

3. Isolationsprotokoll für Hefeplasmamembranen in kleinem Maßstab

1. Wachsende Hefezellen
   1. Vorkulturiert eine einzelne Hefekolonie in 10 ml YPD bei 30 °C für ~7-8 h mit Schütteln bei 200 U/min.
   2. Impfen Sie 40 ml YPD-Medium mit der 10-ml-Vorkultur und inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C o/n (~16 h) mit Schütteln bei 200 U/min, bis die Zelldichte einen OD₆₀₀ von 1-3 erreicht.
2. Ernte von Hefezellen
   1. Ernten Sie 40 OD-Einheiten (ODU; z. B. 1 ml bei einem OD₆₀₀ von 1 = 1 ODU) logarithmischer Phasenzellen bei 4.200 x g für 5 min bei 4 °C.
   2. Zellen zweimal mit eiskaltem sterilem ddH₂O (d.h. 40 ml und dann 1 ml; Erntezellen dazwischen durch Zentrifugation bei 4.200 x g für 5 min bei 4 °C) resuspendieren und waschen.
   3. Das Pellet in 1 ml eiskaltem sterilem ddH₂O resuspendieren und die Zellsuspension in ein vorgekühltes (auf Eis) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
   4. Erntezellen bei 3.300 x g für 3 min bei 4 °C.
   5. Saugen Sie den Überstand an.
   6. Das Zellpellet wird in 0,5 mL Homogenisierungspuffer [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) Glycerin; pH 7,5] frisch ergänzt mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) resuspendiert.
      HINWEIS: Fügen Sie PMSF immer frisch hinzu, da PMSF bei Wassereinwirkung schnell inaktiviert wird.
      VORSICHT: PMSF ist ein Serinproteasehemmer, der extrem korrosiv und zerstörerisch für Gewebe ist. Es kann irreversible Augenschäden verursachen.
   7. Lagern Sie die Zellsuspension bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort.
3. Isolierung von Plasmamembranen
   1. Wenn sie gefroren sind, tauen Sie die Zellen auf Eis für ~ 1 h auf.
   2. Der 0,5 mL Zellsuspension werden eiskalte Kieselsäureperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen.
   3. Brechen Sie Zellen mit 6 Wirbelzyklen bei maximaler Schüttelintensität für 1 min, durchsetzt mit 3 min Abkühlperioden auf Eis.
   4. Machen Sie ein dünnes Loch am Boden des Röhrchens mit einer beheizten Skalpellklinge.
   5. Sammeln Sie das gebrochene Zellhomogenat durch den Boden des Rohrs, das in ein anderes eiskaltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr mit einem 10-s-Spin mit niedriger Geschwindigkeit (~ 200 U / min) eingebaut ist.
      HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass die Kieselsäureperlen im Originalröhrchen verbleiben.
   6. Zentrifugieren Sie die Zelle homogenisieren Sie bei 5.156 x g für 5 min bei 4 °C, um Zellreste, ungebrochene Zellen und Kerne zu entfernen.
   7. 450 μL Überstand in ein eiskaltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und zusätzlich 1 ml eiskaltes HB mit frischem PMSF (1 mM) hinzufügen.
      HINWEIS: Dieser Verdünnungsschritt ist entscheidend für die hochwertige Plasmamembranproteinrückgewinnung.
   8. Plasmamembranen bei 17.968 x g für 1 h bei 4 °C ernten und das Plasmamembranpellet durch wiederholtes Pipettieren in 100 μL HB frisch ergänzt mit 1 mM PMSF resuspendieren. Lösen Sie das Zellpellet für eine ordnungsgemäße Plasmamembranhomogenisierung, indem Sie das Zellpellet mit der 100 μL-Pipettenspitze rühren, bevor Sie die 100 μL HB freisetzen und pipettieren.
   9. Messen Sie die Proteinkonzentration der Plasmamembranzubereitung mit einem Protein-Assay-Kit, das mit Puffern kompatibel ist, die Reduktionsmittel und Reinigungsmittel enthalten.
   10. Lagern Sie die Plasmamembranen bei -80 °C oder halten Sie sie zur sofortigen Verwendung auf Eis.

4. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

1. Montieren Sie die Vorrichtung zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
2. Für zwei Trenngele (7% Polyacrylamid) mischen Sie 2,1 mL 40% Acrylamid/Bisacrylamid, 3 mL 4x Trennpuffer (1,5 M Tris, 0,4% Natriumdodecylsulfat [SDS] (w/v); pH 8,8) und 6,9 mL_ddH2O.Fügen Sie 8 μL Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 60 μL 10% Ammoniumpersulfat (APS) hinzu, um die Polymerisation von Acrylamid zu initiieren.
   ACHTUNG: Acrylamid/Bis-Acrylamid ist sehr giftig. Es verursacht Hautreizungen, periphere Neuropathie und ist krebserregend. TEMED ist schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird. APS ist schädlich, wenn es verschluckt wird. Es verursacht schwere Augen- und Hautirritationen.
3. Gießen Sie ~ 4-5 ml dieser Mischung in die zusammengesetzte Gelvorrichtung, bis zu ~ 2 cm von der Oberseite entfernt.
4. Schichten Sie vorsichtig ~ 1-2 ml 0,1% SDS darauf, um einen planaren Meniskus zu erzeugen.
5. Lassen Sie das Polyacrylamid bei RT auf ~60 min einstellen.
6. Bereiten Sie eine Stapelgelmischung für zwei Gele vor, indem Sie 0,5 mL 40% Acrylamid/ Bis-Acrylamid, 1 mL 4x Stapelpuffer (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w/v); pH 6,8) und 6,9 mL ddH₂O mischen. Fügen Sie 2 μL TEMED und 30 μL 10% APS hinzu, um die Polymerisation von Acrylamid zu initiieren.
7. Entfernen Sie die 0,1% SDS-Schicht aus dem polymerisierten Trenngel und spülen Sie mit ddH₂O ab, um Spuren von SDS zu entfernen.
8. Gießen Sie die Stapelgelmischung auf das Trenngel.
9. Legen Sie einen Kamm in das Stapelgel und entfernen Sie alle Luftblasen um den Kamm herum.
10. Lassen Sie das Stapelgel auf ~ 60 minuten bei RT einstellen.
11. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie die Gelschlitze mit Wasser ab. Legen Sie das Gel in den Geltank und füllen Sie den Geltank nach oben mit 1x Laufpuffer (24,8 mM Tris, 190 mM Glycin, 0,1% SDS).
    HINWEIS: Bereiten Sie 1x Laufpuffer aus einem 10x Pufferlager (248 mM Tris, 1,9 M Glycin, 1% SDS (w/v) in ddH 2 O) vor, das bei RT_gelagertwird.
12. Mischen Sie 5-10 μL Plasmamembranproben (d.h. 10-20 μg Protein) mit gleichen Mengen an 2x Proteinbeladungsfarbstoff [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% Glycerin, 0,02% Bromphenolblau, 4% SDS, 200 mM Dithiothreitol (DTT)] und laden Sie sie sofort in einzelne Gelschlitze, die in Laufpuffer getaumpft sind.
    ACHTUNG: DTT ist schädlich, wenn es verschluckt wird. Es verursacht schwere Augen- und Hautirritationen.
    HINWEIS: Machen Sie einen 10 ml Vorrat von 2x Proteinladungsfarbstoff, aliquot und lagern Sie bei -20 °C. Erhitzen Sie die gemischten Proben nicht, sondern laden Sie sie sofort in einzelne Gelschlitze, damit der GFP-Tag nicht denaturiert wird und die In-Gel-Fluoreszenzsignale detektiert werden können.
13. Laden Sie Proteinmolekulargewichtsmarker (10-245 kDa-Bereich) in einen separaten Slot, um die Größenschätzung einzelner Proteinfragmente zu ermöglichen.
14. Führen Sie eine Gelelektrophorese bei 200 V durch, bis der blaue Ladefarbstoff den Boden des Gels erreicht (normalerweise 45-55 min).
15. Untersuchen Sie das Gel auf In-Gel-GFP-Fluoreszenz mit einem Gel-Bildgebungssystem (Anregungs- und Emissionswellenlängen sind 475-485 nm bzw. 520 nm).
16. Nach der In-Gel-Fluoreszenzbildgebung fixieren Sie Proteine durch sanftes Rühren des Gels in ~ 10-20 ml Protein Gel Fixing Solution (40% Ethanol, 10% Essigsäure) für 15 min bei RT.
17. Spülen Sie das Gel zweimal für 10 min mit 10 ml ddH₂O und visualisieren Sie Proteinbänder, indem Sie das Gel in 10 ml kolloidale Coomassie-Fleckenlösung mit sanftem Schütteln für ~ 1 h bei RT legen.
18. Für eine verbesserte Visualisierung von Proteinbändern entfärben Sie das Gel ein- oder zweimal in ~ 20 ml ddH₂O für ~ 1 h, bevor Sie Bilder mit dem Gel-Bildgebungssystem aufnehmen.

5. Bestimmung der Cdr1-ATPase-Aktivitäten ⁵⁷

1. Verdünnte Plasmamembranproben >2,2 mg/ml bis 1-2 mg/ml in HB.
2. Den ATPase-Assay-Cocktail (75 mM MES-Tris, 75 mM Kaliumnitrat, 0,3 mM Ammoniummolybdat, 7,5 mM Natriumazid; pH 7,5) und Mg-ATP (28,8mM ATP-Natriumsalz, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) wird in einem 30 °C-Inkubator auf 30 °C ausgeglichen.
   ACHTUNG: Natriumazid ist hochgiftig.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Puffervorräte und Flaschen phosphatfrei sind. d.h. Glaswaren mit 1% (vol/vol) HCl waschen und mehrfach mit ddH₂O abspülen. Halten Sie es auch getrennt von anderen Glaswaren, die wahrscheinlich Spuren von Phosphat enthalten, die üblicherweise in Reinigungsmitteln zum Waschen von Glaswaren vorhanden sind.
3. 90 μL Assay-Cocktail mit oder ohne Cdr1-ATPase-Inhibitor (20 μM Oligomycin) in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte geben.
   HINWEIS: Der Assay wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
4. Fügen Sie 5 μL der isolierten Plasmamembranen (~ 5-10 μg Protein) oder Phosphatstandards (0-100 nmole Pi) in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte hinzu.
   HINWEIS: Behalten Sie die erste und letzte Spalte für zwei separate Sätze von Phosphatstandards bei.
5. Beginnen Sie den Assay, indem Sie 25 μL vorgewarnte 28,8 mM Mg-ATP (6 mM Endkonzentration) mit einer Mehrkanalpipette in einzelne Vertiefungen geben und bei 30 °C für 30 min inkubieren.
6. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 130 μL Entwicklungsreagenz (1,6% Natrium-L-Ascorbat, 1% SDS, 12% Ammoniummolybdat in 6 M Schwefelsäure).
   ACHTUNG: Konzentrierte Schwefelsäure reagiert heftig mit Wasser. Es ist ätzend und kann Haut- und Lungenschäden verursachen.
7. Bei RT für 10 min inkubieren.
8. Lesen Sie die Absorption der Mikrotiterplattenschächte bei 750 nm mit einem Mikrotiterplattenleser ab.
   HINWEIS: Die Einhaltung der 10-minütigen Inkubationszeit für die Entwicklung blauer Farbstoffe (d. H. Ein reduzierter Phosphor-Molybdän-Komplex) ist entscheidend für die Assay-Genauigkeit, da die Entwicklung des blauen Farbstoffs mit der Zeit fortgesetzt wird.
9. Erhalten Sie die Cdr1-spezifische ATPase-Aktivität (d. h. die Oligomycin-sensitive ATPase-Aktivität), indem Sie die ATPase-Aktivität in Gegenwart von Oligomycin von der gesamten ATPase-Aktivität in Abwesenheit von Oligomycin subtrahieren.

6. Kleines Reinigungsmittelsieb

1. Kombinieren Sie die Plasmamembranpräparate (d. h. 2,5 mg Plasmamembranprotein) von Zellen, die Cdr1-mGFPHis überexprimieren, mit GTED-20-Puffer [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) Glycerin; pH 7,5; frisch ergänzt mit 1 mM PMSF] mit 5 mg des Testwaschmittels, um ein Gesamtvolumen von 0,5 ml zu erreichen, das mit 1% (w/v) Reinigungsmittel ergänzt wird.
2. Drehen Sie die Mischung bei 4-8 °C für 2 h mit einer Rotationsvorrichtung.
3. Zentrifuge das Gemisch bei 141.000 x g bei 4 °C für 1 h.
4. Den Überstand, der solubilisiertes Material enthält, in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
5. 0,5 ml GTED-20-Puffer mit 2% (w/v) SDS in die unlösliche Pelletfraktion geben und bei 30 °C o/n in einem Schüttelinkubator inkubieren, um das gesamte waschmittelunlösliche Membranprotein zu extrahieren.
6. Analysieren und vergleichen Sie die überstandenden und gelösten Pelletfraktionen mit SDS-PAGE.
7. Fotografieren Sie Gele, die GFP-markierte Proteine für die GFP-Fluoreszenz im Gel enthalten, bevor Sie sich mit Coomassie färben, und quantifizieren Sie die Expressionsniveaus mit dem Bildgebungssystem.
8. Verwenden Sie die lösliche Membranproteinfraktion für nachgelagerte Anwendungen wie die Fluoreszenzgrößenausschlusschromatographie (FSEC)^58, um geeignete Reinigungsmittel zu identifizieren.

Eine hohe Transformationsfrequenz von S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 Transformanten/μg) wurde mit pYES2 erreicht (Abbildung 2B). Wie erwartet, ergab die No-DNA-Kontrolle (d.h. nur ddH2O) keine Transformanten, und 1 μg der linearen CDR1-mGFPHis Transformationskassette (Abbildung 1A) ergab ~ 50 Transformanten (Abbildung 2C) mit dem optimierten ADΔΔ-Transformationsprotokoll. Die CDR1-mGFPHis-Transformanten wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, auf einer nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle zu wachsen, um mögliche zierliche Mutanten mit defekten Mitochondrien zu eliminieren. Drei (gelbe Kreise; Abbildung 2D) der 25 getesteten Uracil-Prototroph-Transformanten konnten nicht auf YPG-Agarplatten wachsen und wurden aus weiteren Untersuchungen verworfen. Der cdr1-mGFPHis, exprimiert durch den neu erzeugten Stamm ADΔΔ-CDR1-mGFPHis, ist in der Plasmamembran korrekt lokalisiert (Abbildung 1A) und wurde in ausreichenden Mengen für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Cdr1 exprimiert (Abbildung 3). Das Design des optimierten Doppel-Tags (Abbildung 1B) ermöglicht auch die Entfernung des mGFPHis-Doppel-Tags nach nickelaffiner Aufreinigung von Cdr1-mGFPHis, um mögliche Interferenzen des Tags in nachgelagerten Anwendungen zu vermeiden. Vorläufige Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass der 3-Aminosäuren-Linker zwischen Cdr1 und der HRV-3C-Protease-Spaltungsstelle möglicherweise verlängert werden muss, um eine schnellere, effektivere Spaltung zu erreichen. Ähnliche Beobachtungen wurden kürzlich für den N-terminal markierten Nukleosidtransporter Escherichia coli NupC berichtet, der einen 15 statt des ursprünglich entwickelten 3-Aminosäure-Linkers für eine effiziente Spaltung des gelösten NupC des Waschmittels (DDM) benötigte, das an das Nickelaffinitätsharz59gebunden ist. Der 5-Aminosäure-Linker C-Terminal der HRV-3C-Spaltstelle verhindert eine sterische Interferenz des mGFPHis-Doppel-Tags mit dem angehängten Protein von Interesse, das wir zuvor für C. utilis ABC-Transporter Cdr139beobachtet haben. Die yEGFP3-A206K-Mutation wurde geschaffen, um eine künstliche GFP-Dimerisierung bei hohen Proteinkonzentrationen zu verhindern28,und der zusätzliche 3-Aminosäure-Linker zwischen mGFP und dem His Nickel-Affinity-Tag gewährleistet eine ordnungsgemäße Oberflächenexposition des His-Tags, um die Bindungseffizienz des markierten Proteins an das Nickelaffinitätsharz zu maximieren (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 1: Eine Hefemembranproteinexpressionsplattform für das effiziente Klonen und Dieexpression von Pilzplasmamembrantransportern. (A) Eine Transformationskassette, die den PDR5-Promotor (blau), CDR1 (rot) C-terminal markiert mit XLmGFPHis (grün), den PGK1-Terminator (orange), den URA3-Selektionsmarker (hellblau) und ein Stück des PDR5-Downstream-Bereichs (blau) enthält, wird verwendet, um den Expressionswirt S.cer evisiae ADΔΔ durch Integration am genomischen PDR5-Locus. Der Gain-of-Function-Mutanten-Transkriptionsfaktor Pdr1-3 verursacht die konstitutive Überexpression von Cdr1 (rote Achtecke) in der Plasmamembran (siehe konfokale Mikroskopiebild unten). (B) Plasmid pABC3-XLmGFPHis, das in einer traditionellen Klonstrategie oder als PCR-Vorlage zur Erzeugung einer Transformationskassette verwendet werden kann. Verbesserungen von Plasmid pABC3-XLmGFPHis gegenüber pABC3-GFP14 sind unter der Plasmidkarte aufgeführt. (C) Eine alternative, effizientere einstufige Klonierungsstrategie zur Integration der Transformationskassette am genomischen PDR5-Locus von ADΔΔ. Ein ORF (rot) kann mit Primern (Pfeilen) PCR verstärkt werden, die Überlappungen mit dem linken Arm (blau; PDR5-Promotor) und rechter Arm (grün; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 downstream) Fragmente. Mutationen (schwarze Linien) können bei Bedarf durch Primer-Design in den ORF eingebracht werden. Homologe Rekombinationsereignisse, die die korrekte Integration am PDR5-Locus lenken, werden durch die gekreuzten gestrichelten Linien angezeigt. (D) Ganzzellassays, die zur funktionellen Charakterisierung von Pilz-Multidrug-Effluxpumpen verwendet werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Transformation von ADΔΔ mit der CDR1-mGFPHis Transformationskassette und Eliminierung von petiten ADΔΔ-CDR1-mGFPHis Transformanten. Uracil-Prototroph-Transformanten wurden ausgewählt, indem transformierte ADΔΔ-Zellen auf CSM-URA-Platten bei 30 °C für 3 Tage inkubiert wurden. (A) Negativkontrolle (keine DNA). (B) Positivkontrolle (10 ng pYES2). (C) CDR1-mGFPHis-Transformanten (1 μg DNA). (D) Prüfung von ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-Transformanten auf einen zierlichen Phänotyp auf YPG-Agarplatten. Zierliche Transformantien, die aufgrund defekter Mitochondrien nicht auf YPG-Agarplatten wachsen konnten, sind gelb umzingelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die GFP-Fluoreszenz ist ein zuverlässiges Maß für cdr1-Expressionsniveaus, da eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Cdr1-mGFPHis (Schritt 3.3.9) und In-Gel-Fluoreszenzsignalen bestand(Abbildung 3A). In diesem Projekt wurde ein reproduzierbar optimierter Workflow für die schnelle Generierung hochwertiger kleinmaßstäblicher Plasmamembranpräparate zur biochemischen Charakterisierung von Plasmamembranproteinen entwickelt. Es konnten fast 0,5 mg Plasmamembranprotein(Abbildung 3C; linke Grafik) erzeugt werden, die die höchste Cdr1-ATPase-Aktivität ( ̃400 nmol/min/mg; Abbildung 3C; rechte Grafik) beim Brechen von 40 ODU logarithmischer Phasenzellen (OD600nm von 1-3) (resuspendiert in 0,5 ml HB) mit dem gleichen Volumen (dh 0,5 ml) Kieselsäureperlen und 6 Wirbelzyklen für 1 min bei maximaler Schüttelintensität, gefolgt von 3 min Abkühlperioden auf Eis. Eine weitere Erhöhung der Anzahl der Bruchzyklen (Schritt 3.3.3) verringerte die Qualität der isolierten Plasmamembranpräparation (die Cdr1-ATPase-Aktivität sank von 170 nmol/min/mg auf ~60 nmol/min/mg; Daten nicht gezeigt). Obwohl es nur geringe Unterschiede in den SDS-PAGE-Proteinmustern der Plasmamembranproben gab, die aus Zellen isoliert wurden, die mit einer höheren Anzahl von Bruchzyklen gebrochen wurden (Daten nicht gezeigt), ist es wahrscheinlich, dass die fast 3-fach reduzierten Cdr1-ATPase-Aktivitäten nach 10 oder mehr Bruchzyklen entweder durch folgendes verursacht wurden: i) teilweise Denaturierung von Cdr1 aufgrund erhöhter Temperaturexposition; ii) post translationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder Dephosphorylierung; oder durch iii) erhöhte Kreuzkontamination der isolierten Plasmamembranvesikel mit Membranfraktionen anderer Organellen. Das Brechen von 40 ODU von Zellen in 0,5 ml HB ergab die höchste Qualität von Plasmamembranen (d.h. die meisten Cdr1 pro 10 μg Plasmamembranprotein; Abbildung 3B) mit der höchsten Cdr1-ATPase-Aktivität(Abbildung 3C;rechte Grafik). Höhere (> 40 ODU/0,5 ml HB) oder niedrigere (20 ODU/0,5 ml HB) Zelldichten reduzierten die ATPase-Aktivität der isolierten Plasmamembranen(Abbildung 3C;rechte Grafik), obwohl ihre Ausbeute proportional zur Erhöhung der Zelldichte zunahm(Abbildung 3C;linke Grafik). Somit waren 40 ODU/0,5 mL HB die optimale Zelldichte für die Isolierung höchster Qualität von Plasmamembranen. Die Verwendung des optimierten Protokolls für die isolierung von Plasmamembranpräparaten im kleinen Maßstab führte zu 2-3 mal höheren Cdr1-spezifischen ATPase-Aktivitäten (~ 300 nmol / min / mg; Abbildung 3C; rechte Grafik) im Vergleich zu den cdr1-spezifischen ATPase-Aktivitäten, die ursprünglich erhalten wurden (~ 100 nmol / min / mg; Daten nicht gezeigt). Diese ATPase-Aktivitäten waren auch signifikant höher35 als alle zuvor berichteten Cdr1-ATPase-Aktivitäten (100-200 nmol / min / mg), die mit einem arbeitsintensiveren und zeitaufwendigeren Großplasmamembran-Präparationsprotokoll14,41,60erhalten worden waren.

Die gebräuchlichste Methode, um Membranproteine aus biologischen Membranen zu extrahieren, ist die Lösung mit Reinigungsmittel. Die Herausforderung besteht jedoch darin, ein geeignetes Reinigungsmittel zu finden, das sich am wenigsten nachteilig auf die Proteinstabilität und/oder die Faltungseigenschaften auswirkt. Die Kennzeichnung des Proteins mit mGFPHis erleichtert das Screening, um die besten Reinigungsmittel für die Proteinextraktion auszuwählen. Insgesamt wurden 31 in der Materialtabelleaufgeführte Reinigungsmittel mit verschiedenen Eigenschaften auf ihre Fähigkeit getestet, Cdr1 aus rohen Plasmamembranen von S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-Zellen zu solösibilisieren. Die Ergebnisse für einen repräsentativen Satz von 16 Testwaschmitteln (A-Q) sind in Abbildung 3D dargestellt. Die Bahnen T, P und S enthalten 10 μL Aliquoten des gesamten (T) Plasmamembranproteins unmittelbar nach der Lösung des Waschmittels (Schritt 6.2) und des unlöslichen Pellets (P; gelöst o/n in 0,5 ml GTED-20, 2% SDS; Schritt 6.5) und des waschmittellöslichen Überstands (S; Schritt 6.4) Fraktionen nach der Trennung durch Ultrazentrifugation bei 141.000 x g. Das gewünschte Reinigungsmittel sollte so viel Cdr1-mGFPHis wie möglich so gut wie möglich löslich machen, ohne seine Struktur und/oder Funktion zu verändern. Die rohen Plasmamembranproteine (5 mg/ml) wurden für 2 h mit 1% (w/v) Waschmittel (T) gelöst und Aliquoten der löslichen (S) und unlöslichen (P) Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE (Abbildung 3D) und später auch mittels Fluoreszenzdetektionsgrößenausschlusschromatographie (FSEC)analysiert (Abbildung 4). Wir stellten fest, dass für eine effiziente Solubilisierung von Cdr1 ein Mindestverhältnis von Waschmittel zu Protein von 2:1 (w/w) erforderlich war. Um die optimale Waschmittelkonzentration (DDM) zu bestimmen, die für die Lösung von Cdr1-mGFPHis erforderlich ist, wurden die kritische Mizellenkonzentration des Waschmittels (x CMC) und das Waschmittel/Membranprotein-Verhältnis (w/w) untersucht. Große Unterschiede in den Löslichkeitswirkungsgraden von Cdr1-mGFPHis wurden beobachtet, wenn feste Konzentrationen von 10x oder 80x CMC von DDM verwendet wurden. Die Solubilisierungswirkungsgrade variierten zwischen 40% und 80% oder 60% und 90%, abhängig von den Mengen an rohen Plasmamembranen, die in den verschiedenen Solubilisierungsexperimenten verwendet wurden. Die Wahl von Waschmittel-Protein-Verhältnissen von ≥2 (w/w) lieferte jedoch reproduzierbar gute Ergebnisse, wobei >85% der Cdr1-mGFPHis solubilisiert wurden, unabhängig von der Menge des verwendeten Plasmamembranproteins. Wenn Sie also den gebräuchlicheren Ansatz verwenden, einfach 1% oder 2% (w / v) Waschmittel für die Lösung von Membranproteinen wie Cdr1-mGFPHis zu wählen, ist es wichtig, das Waschmittel-Protein-Verhältnis über 2 (w / w) zu halten [dh halten Sie die Plasmamembranproteinkonzentration unter 5 mg / ml bei Verwendung von 1% (dh 10 mg / ml) Waschmittel].

Abbildung 3: Quantifizierung der Expressionsniveaus von Cdr1-mGFPHis, Optimierung eines kleinen Plasmamembranisolationsprotokolls und eines Reinigungsmittelsiebs für Cdr1-mGFPHis. (A) Quantifizierung von Cdr1-mGFPHis mit In-Gel-Fluoreszenz; Links sind die Coomassie gefärbten und in-gel fluoreszierenden SDS-PAGE-Bilder des gleichen 0,7% Polyacrylamidgels dargestellt. Die Bahnen 1 bis 6 wurden mit 0,75, 1,5, 3, 6, 12 und 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis Plasmamembranprotein beladen. Cdr1-mGFPHis ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. M = Precision Plus Protein Marker. Die mGFP-Fluoreszenzdicken (rechts abgebildet) waren über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich linear und es gab eine minimale Hintergrundfluoreszenz. (B) Einfluss der Zelldichte beim Bruch auf die Qualität isolierter Plasmamembranen. Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel (7%) von Plasmamembranproteinproben (10 μg) und grüne Fluoreszenzsignale von Cdr1-mGFPHis desselben Gels vor der Coomassie-Färbung. M = Precision Plus Protein Marker. Die Bahnen 1, 3, 5 und 7 sind Plasmamembranproteine von ADΔΔ und die Bahnen 2, 4, 6 und 8 sind Plasmamembranproteine von ADΔΔ-CDR1-mGFPHis, die aus 20, 40, 60 bzw. 80 ODU von Zellen isoliert sind. Cdr1-mGFPHis ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. Die relativen Prozentsätze der grün fluoreszierenden Signale sind unten aufgeführt. (C) Einfluss der Zelldichte beim Bruch auf die Ausbeute isolierter Plasmamembranen und die ATPase-Aktivität von Cdr1-mGFPHis. Links die Wirkung der Zelldichte (ODU/0,5 mL HB) auf die Menge an Plasmamembranprotein, das aus ADΔΔ- und ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-Zellen (Cdr1) isoliert wurde. Rechts Der Einfluss der Zelldichte auf die Cdr1-ATPase-Aktivität der aus ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-Zellen isolierten Plasmamembranen. (D) Beispielhafte SDS-PAGE von 10 μL Aliquoten des Solubilisierungsgemisches (T; 0,5 mL), des Pellets nach der Solubilisierung (P; 0,5 ml) und der solubilisierten (überstehenden) Fraktionen (S; 0,5 ml) von waschmittellöslich gelösten Rohplasmamembranproteinen von ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (oben) und In-Gel-Fluoreszenz von Cdr1-mGFPHis vor Coomassie-Färbung desselben Gels (unten). M = breite MW vorgefärbte Proteinleiter (245, 180, 135, 100, 75, 63 und 48 kDa-Band; die 180 kDa- und 75 kDa-Bänder sind mit roten bzw. grünen Pfeilen gekennzeichnet). Die Bahnen A bis L und N bis Q sind die T-, S- und P-Fraktionen für DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-Cholin-13 (P) bzw. SDS (Q). Abkürzungen sind in der Materialtabelledefiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Basierend auf den Ergebnissen des Waschmittel-Screenings (Abbildung 3D) schienen DDM (B und C) und Fos-Cholin-13 (P) die besten Reinigungsmittel für die Solubilisierung von Cdr1-mGFPHis zu sein. Die Verwendung von Fos-Cholin-13 schien jedoch eine partielle Proteolyse von Cdr1-mGFPHis zu verursachen (P in Abbildung 3D). LMNG (E), PCC-α-M (nicht gezeigt) und möglicherweise auch DM (A) waren die nächstbesten Reinigungsmittel. Das Waschmittel-Screening zeigte auch, dass die Glucoside OGNG (F) und OG (G), CHAPS (L), NM (N) und Anzergents (nicht gezeigt) eine schlechte Wahl für die Lösung von Cdr1-mGFPHis waren, da signifikante Mengen des Proteins in den unlöslichen Pelletfraktionen gefunden wurden (Abbildung 3D). SDS denaturiert Cdr1-XLmGFPHis, weshalb in den Q-Lanes keine grünen Fluoreszenzsignale sichtbar sind (Abbildung 3D).

Die Eignung eines Waschmittels für die Solubilisierung von richtig gefalteten nativen Cdr1-mGFPHis-Partikeln wurde ebenfalls von FSEC des waschmittellöslichen Plasmamembranproteins (Schritt 6.4 Überstand) bewertet. Beispiele für Chromatogramme, die für 100 μL rohes Plasmamembranprotein aus ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/ml) erhalten wurden, die mit 1% Reinigungsmittel löslich sind, sind in Abbildung 4 dargestellt. Der Peak bei 9 mL Elutionsvolumen stellt meist aggregierte Cdr1-mGFPHis dar, die im Hohlraumvolumen eluiert, während richtig gelöste und korrekt gefaltete Cdr1-mGFPHis-Partikel durch den Gauß-förmigen Peak bei 15,5 mL Elutionsvolumen dargestellt werden. Die breite Schulter zwischen 12 und 14 mL Elutionsvolumen enthält möglicherweise weniger gut definierte Cdr1-mGFPHis Mizellenpartikel und/oder deuten auf partielle Fehlfaltung oder Proteinaggregate hin. Chromatogramme von Maltosiden und LMNG-extrahierten Proteinen zeigten, dass der größte Teil von Cdr1-mGFPHis als schön geformter Gauß-Peak bei 15,5 ml eluiert, wobei eine kleine Schulter etwas früher bei 14 ml eluierte (Abbildung 4A). Diese Proben hatten keine Cdr1-mGFPHis, die im Hohlraumvolumen eluierten. Die leere Probe ist der Puffer plus DDM-Steuerung, die kein mGFP-Signal gab. Die Chromatogramme in Abbildung 4B unterstreichen die Bedeutung der Art der Zuckerkopfgruppe für die Qualität der löslichen Cdr1-mGFPHis-Partikel. Glukosehaltige Detergenzien (OG, NG, OGNG) schnitten schlechter ab als saccharosehaltige Detergenzien (DDS), die wiederum schlechter abschnitten als maltosehaltige Detergenzien (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis mit glukosehaltigen Reinigungsmitteln gelöst, die als aggregierter (OG) oder breiter aggregierter Peak (NG, OGNG) eluiert wurden, was von dem hohen Anteil an Cdr1-mGFPHis Niederschlag in den in Abbildung 3Dbeobachteten Pelletfraktionen für OGNG (F) und OG (G) zu erwarten war. Obwohl das DMNG-Chromatogramm (grün; Abbildung 4B) war qualitativ dem DDM-Chromatogramm (blau; Abbildung 4B), deuten die höheren Peaks für DDM darauf hin, dass ein großer Teil der DMNG-gelösten Cdr1-mGFPHis tatsächlich denaturiert sein kann. Abbildung 4C zeigt die FSEC-Chromatogramme für die zwitterionischen Fos-Choline (Fos-Cholin-8, Fos-Cholin-10, Fos-Cholin-13) und zwei nichtionische Reinigungsmittel (Digitonin, Triton-X100), und Abbildung 4D zeigt, wie die Belastung von doppelt so viel (200 μL) gelöstem Waschmittel-Solubilisiertes Protein keinen spürbaren Einfluss auf die Qualität des Chromatogramms für Fos-Cholin-8, -10 und -13 und DDM hatte. Nur Digitonin (orange; Abbildung 4C) gab ein ähnliches Chromatogramm wie DDM (blau; Abbildung 4C) und obwohl Fos-Cholin-13 einen symmetrischen, scharf geformten Peak ergab, eluierte es erneut mit einem deutlich geringeren Elutionsvolumen (14 ml) als das für DDM (15,5 ml). Insgesamt gab es einen klaren Trend zur besseren Lösung durch Reinigungsmittel mit längeren aliphatischen Seitenketten von 12 oder 13 Kohlenstoffrückständen; DDM > Z. B. DM > NM (12, 10 oder 9 Kohlenstoffe), Fos-Cholin-13 > 10 > 8 (13, 10 oder 8 Kohlenstoffe) und LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 oder 8 Kohlenstoffe). So waren Detergenzien mit hydrophoben Tails von weniger als 12 Kohlenstoffen weit weniger geeignete Detergenzien für die Lösung von Cdr1-mGFPHis als Waschmittel mit längeren hydrophoben Tails von 12 oder 13 Kohlenstoffen, und nichtionische Detergenzien (DDM, LMNG) schienen im Allgemeinen besser für die Solubilisierung von Cdr1-mGFPHis geeignet zu sein als zwitterionische Reinigungsmittel (Abbildung 3D, Abbildung 4).

Abbildung 4: Waschmittel-Screening für cdr1-mGFPHis Solubilisierung mit FSEC. Chromatogramme von 100 μL solubilisierter ADΔΔ-CDR1-mGFPHis roher Plasmamembran (2 mg/ml) mit 1% der angezeigten Reinigungsmittel und getrennt mit einer Superose 6-Increase 10/300 GL Größenausschlusssäule. Die Chromatogramme zeigen die relativen mGFP-Fluoreszenzeinheiten (FU) eines Säulenvolumens (CV; 25 ml) des gesammelten Elutionspuffers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.