Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

3.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62658

⸱

27. Mai 2021

 ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Macropinozytose ist ein hochkonservierter endozytischer Prozess, der durch die Bildung von F-Aktin-reichen blattartigen Membranprojektionen, auch bekannt als Membranrüschen, ausgelöst wird. Eine erhöhte Rate der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe wurde mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in vitro mittels Rasterelektronenmikroskopie dar.

Zusammenfassung

Membran-Ruffling ist die Bildung von beweglichen Plasmamembranvorsprüngen, die ein Geflecht aus neu polymerisierten Aktinfilamenten enthalten. Membranrüschen können sich spontan oder als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, entzündliche Zytokine und Phorbolester bilden. Einige der Membranvorsprünge können sich zu kreisförmigen Membranrüschen reorganisieren, die an ihren distalen Rändern verschmelzen und Becher bilden, die sich als große, heterogene Vakuolen, die Makropinosomen genannt werden, schließen und in das Zytoplasma trennen. Während des Prozesses fangen Rüschen extrazelluläre Flüssigkeit und gelöste Stoffe ein, die sich in Makropinosomen verinnerlichen. Die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist ein häufig verwendetes bildgebendes Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und geschlossenen makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche. Das folgende Protokoll beschreibt die Zellkulturbedingungen, die Stimulation der Membranrüschenbildung in vitro und die Fixierung, Dehydrierung und Vorbereitung von Zellen für die Bildgebung mit REM. Die Quantifizierung von Membranrüschen, Datennormalisierung sowie Stimulatoren und Inhibitoren der Membranrüschenbildung werden ebenfalls beschrieben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen über die Rolle der Makropinozytose in physiologischen und pathologischen Prozessen zu beantworten, neue Ziele zu untersuchen, die die Bildung von Membranrüschen regulieren, und noch nicht charakterisierte physiologische Stimulatoren sowie neuartige pharmakologische Inhibitoren der Makropinozytose zu identifizieren.

Einleitung

Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der für die Internalisierung einer großen Menge extrazellulärer Flüssigkeit und ihres Gehalts durch die Bildung von dynamischen und aktingetriebenen Plasmamembranvorsprüngen, den sogenannten Membranrüschen,verantwortlich ist 1. Viele dieser Membranrüschen bilden Tassen, die sich schließen und wieder mit der Zelle verschmelzen und sich von der Plasmamembran als große, heterogene intrazelluläre Endosomen, auch Makropinosomen 1 genannt, trennen. Obwohl die Makropinozytose durch Wachstumsfaktoren wie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in einer Vielzahl von Zelltypen induziert wird, wurde ein weiterer einzigartiger, kalziumabhängiger Prozess, der als konstitutive Makropinozytose bekannt ist, auch in angeborenen Immunzellenbeobachtet 2,3,4,5,6,7,8.

Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit von Zellen, extrazelluläres Material durch Makropinozytose zu internalisieren, eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen spielt, die von der Nährstoffaufnahme über den Erregerfang bis hin zur Antigenpräsentationreichen 9,10,11. Da dieser Prozess jedoch nicht selektiv und induzierbar ist, wurde er auch mit einer Reihe von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Tatsächlich deuteten frühere Studien darauf hin, dass die Makropinozytose eine wichtige Rolle bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, Krebs, Nephrolithiasis und Atherosklerosespielt 12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben bestimmte Bakterien und Viren gezeigt, dass sie Makropinozytose nutzen, um in Wirtszellen einzudringen und eine Infektion zu induzieren17,18. Interessanterweise kann die Stimulation der Makropinozytose auch für die gezielte Abgabe von Therapeutika bei verschiedenen Krankheitszuständen genutzt werden19,20.

Frühere Studien haben die Makropinozytose untersucht, indem internalisierte fluoreszenzmarkierte Fluidphasenmarker in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologischen Wirkstoffen, die die Makropinozytose hemmen, mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Bildgebungquantifiziert wurden 21,22. Derzeit verfügbare pharmakologische Werkzeuge, die die Makropinozytose hemmen, sind beschränkt auf und umfassen 1) Aktinpolymerisationsinhibitoren (Cytochalasin D und Latrunculine), 2) PI3K-Blocker (LY-290042 und Wortmannin) und 3) Inhibitoren von Natrium-Wasserstoff-Austauschern (NHE) (Amilorid und EIPA)5,14,15,23,24,25 . Da diese Inhibitoren jedoch endozytoseunabhängige Wirkungen haben, ist es schwierig, den Beitrag der Makropinozytose zur Aufnahme von gelösten Stoffen und zur Krankheitspathogenese selektiv zu bestimmen, insbesondere in vivo21.

Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist eine Art Elektronenmikroskop, das ultrahochauflösende Bilder von Zellen mit einem fokussierten Elektronenstrahl26 erzeugt. In der Makropinozytoseforschung gilt die REM-Bildgebung als die Goldstandardtechnik, um topographische und morphologische Eigenschaften der Plasmamembran zu visualisieren, die Bildung von Membranrüschen zu quantifizieren und ihr Fortschreiten zur Makropinosomenverinnerlichung zu untersuchen. Darüber hinaus bietet die Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der Quantifizierung der Aufnahme gelöster Stoffe in Gegenwart und Abwesenheit von Makropinozytoseblockern eine zuverlässige Strategie zur Untersuchung der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe in vitro. Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll, wie Zellen auf REM vorbereitet, die Zelloberfläche visualisiert, die Rüschenbildung quantifiziert und ihr Fortschritt in Richtung Cup-Verschluss und Makropinosom-Internalisierung untersucht werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Das Folgende ist ein allgemeines Protokoll zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in RAW 264.7-Makrophagen mittels REM-Mikroskopie. Für verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung erforderlich sein.

1. Zelllinie und Zellkultur

  1. Züchten Sie RAW 264,7 Makrophagen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Ersetzen Sie Wachstumsmedien jeden zweiten Tag.
  2. Wenn die Zellen zu 80% konfluieren, waschen Sie die Platte zweimal mit sterilem PBS.
  3. Die Zellen werden durch Zugabe von 1.000 μL 0,5% Trypsin-EDTA abgelöst und die Zellkulturplatte für 3-5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert.
  4. Untersuchen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Zelldissoziation zu bestätigen. Fügen Sie 10 ml Wachstumsmedien hinzu, die 10% FBS enthalten, um Trypsin zu inaktivieren.
  5. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Zellen sanft im gesamten Zellkulturmedium und bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Trypan Blue (0,4%) Färbung.
    HINWEIS: Die empfohlene Mindestzelllebensfähigkeit für dieses Experiment beträgt >90%.
  6. Platzieren Sie sterile Glasabdeckungen in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit autoklavierten Pinzetten. Samen Sie Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
  7. Wechseln Sie das Medium jeder Vertiefung vor der Behandlung mit frischen 500 μL Vollmedien. Vorbehandlung von Makrophagen mit Vehikel (DMSO oder anderen Lösungsmitteln zur Auflösung von EIPA) oder dem Makropinozytoseinhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amilorid (EIPA, 25 μM21) für 30 min.
  8. Behandeln Sie Zellen mit Vehikel und Stimulatoren der Makropinozytose, um das Membran-Ruffling zu fördern: Phorbol 12-Myrisat 13-Acetat (PMA, 1 μM, 30 min21) und Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min3).
    HINWEIS: Alternative Inhibitoren [z. B. Latrunculin A (1 μM, 30 min) oder Cytochalasin D (1 μM, 30 min)] und Stimulatoren [z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) oder von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] der Makropinozytose können auch zur Charakterisierung der Makropinozytose bei Makrophagen und anderen Zelltypenverwendet werden 16,27, 28,29 Zellen können vor der Behandlung mit physiologischen Stimulatoren der Makropinozytose über Nacht Serumhunger erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass die effektivsten Konzentrationen und Inkubationszeiten bestimmt werden müssen, um die Makropinozytose in anderen Zelltypen zu stimulieren.

2. SEM-Fixierung

  1. Nach der Behandlung die Medien aus den Vertiefungen absaugen und Deckgläser zweimal mit eiskaltem PBS waschen.
  2. Fixieren Sie Zellen (4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat) für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht im Fixiermittel bei 4 ° C.
  3. Deckgläser mit 500 μL Folgereagenzien schonend waschen und inkubieren, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
    1. Einmal in 0,1 M Natriumcacodylat waschen und 15 min inkubieren.
    2. Zweimal mit dH2O waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
    3. Zweimal mit 25% Ethanol mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche waschen.
    4. Zweimal mit 50% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
    5. Zweimal mit 75% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
    6. Waschen Sie zweimal mit 80% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
    7. Waschen Sie zweimal mit 95% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
    8. Zweimal mit 100% Ethanol waschen. Führen Sie 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche durch.
      HINWEIS: Das Wechseln / Ersetzen von Reagenzien sollte schnell erfolgen, um ein Austrocknen der Zellen an der Luft zu verhindern. Deckgläser können in 100% Ethanol für mehrere Tage bei 4 °C belassen werden. Für die Langzeitlagerung fügen Sie zusätzliches 100% Ethanol hinzu und bedecken Sie die Vertiefungen mit Parafilm, um ein Austrocknen der Probe an der Luft zu verhindern.

3. Kritische Punktetrocknung

  1. Legen Sie die Deckgläser in einen Critical Point Dryer und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie die Power-Taste und öffnen Sie den CO2-Tank .
  2. Drücken Sie die Cool-Taste ca. 30 s lang, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt. Drücken Sie die Taste "Füllen", bis im Kammerfenster eine Blase angezeigt wird.
  3. Drücken Sie die Löschtaste , bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülauspuff verschwindet. Drücken Sie die Taste Cool erneut, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt.
  4. Drücken Sie die Tasten Fill und Purge, um sie auszuschalten und den CO2-Tank zu schließen. Drücken Sie die Taste Cool, um sie auszuschalten, und drücken Sie die Taste Heat .
  5. Stellen Sie die Temperatur auf 42 °C und den Druck auf 1.200 psi ein. Sobald sich der Druck und die Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Bleed-Taste , damit der Druck langsam abnimmt.
  6. Sobald der Kammerdruck 150 psi erreicht hat, drücken Sie die Entlüftungstaste und warten Sie, bis der Druck auf 0 psi sinkt. Schalten Sie den kritischen Punkttrockner aus und entfernen Sie die Deckgläser.
  7. Montieren Sie Deckgläser auf REM-Aluminiumprobenhalterungen mit Carbon-Klebelaschen und unterliegen einer Sputterbeschichtung mit Gold / Palladium in einem Sputterbeschichter.
  8. Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen.
  9. Sobald das Vakuum auf 200 mTorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
  10. Drücken Sie die Timer-Taste und stellen Sie den Spannungsregler so lange ein, bis das Messgerät 10 mA anzeigt. Entfernen Sie beschichtete Deckgläser aus der Kammer.
    HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um eine kritische Punkttrocknung und Sputterbeschichtung der Probe durchzuführen.

4. Bildgebung und Quantifizierung

  1. Probendeckel in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops einführen. Schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste .
  2. Öffnen Sie die SEM-Betriebssoftware. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 kV und den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
  3. Drücken Sie die Taste Koordinaten und bewegen Sie sich um den Controller herum, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 3.500-fache ein und stellen Sie die Probe ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine höhere Vergrößerungsstufe (8.500x bis 16.000x), um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen.
  4. Nehmen Sie Bilder von mindestens 10 zufälligen Stellen auf den Deckgläsern auf und stellen Sie sicher, dass jedes mikroskopische Feld mehrere Zellen enthält. Speichern Sie Bilder als .tif Dateien.
  5. Aus den Bildern finden Sie Membranrüschen, definiert als hervorstehende deckenartige Falten der Plasmamembran mit einer Größe von mehr als 500 nm (Abbildung 1). Zählen Sie die Anzahl der Rüschen pro Zelle.
    HINWEIS: C-förmige Rüschen wurden als gekrümmte Membranvorsprünge identifiziert, die an ihren seitlichen Enden nicht verschmolzen [(Abbildung 1 (M-CSF-Behandlung) und Abbildung 2B]. Verschmolzene kreisförmige Membranrüschen wurden vor ihrem Verschluss als makropinozytotische Becher identifiziert (Abbildung 2C).
  6. Normalisieren Sie die Anzahl der Membranrüschen auf die Gesamtzahl der Zellen im ausgewerteten mikroskopischen Feld. Wiederholen Sie diese Analyse für die Proben aus jeder Gruppe.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Hier beschreiben wir die Ergebnisse der vorgestellten Technik. Repräsentative REM-Bilder, die in Abbildung 1 gezeigt werden, zeigen die Bildung von Membranrüschen in RAW 264,7-Makrophagen nach der Behandlung mit PMA und M-CSF. Die Bilder wurden zuerst mit einer Vergrößerung von 3.500x zu Quantifizierungszwecken und dann mit höheren Vergrößerungsgraden (8.500x bis 16.000x) aufgenommen, um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropinozytose-In...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. Obwohl sich das aktuelle Protokoll auf Makrophagen konzentriert, haben Studien gezeigt, dass die Bildung von Membranrüschen auch bei verschiedenen anderen Zelltypen auftritt, darunterdendritische Zellen, Fibroblasten, Neuronen und Krebszellen 11,12,14,21,30.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken Libby Perry (Augusta University) für ihre Hilfe bei der SEM-Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) und K99HL146954 (B.S.)] und der American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)] unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 % Trypsin-EDTAGibco15400-054
2 % GlutaraldehydElektronenmikroskopie Sciences16320
4 % ParaformaldehydSanta Cruz Biotechnologie281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-AmiloridSigma Life ScienceA3085
Accuri C6 Durchflusszytometer
Kohlenstoff-KlebetablettenElektronenmikroskopie Sciences77825-09
DimethylsulfoxidCorning25-950-CQC
Dulbeccos modifiziertes Eagle MediumCytiva Life SciencesSH30022.01
Falcon 24-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem flachem Boden TC-behandelte Multiwell-ZellkulturplatteFalcon353047
fötales RinderserumGemini Bio900-108
FitC-dextranThermo Fisher ScientificD1823
FM 4-64Thermo Fisher ScientificT13320
HERAcell 150i CO2-InkubatorThermo Fisher Scientific51026282
Hummer Modell 6.2 Sputter CoaterAnatech USA58565
JSM-IT500HR Rasterelektronenmikroskop
Mikroskop Abdeckung GlasThermo Fisher Scientific12-545-82
Pen StrepGibco15140-122
Phorbol 12-Myristat 13-acetatMillipore Sigma524400
RAW 264.7 MakrophagenATCCATCC TIB-71
Rekombinant Human M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790 Kritischer PunkttrocknerTousimis Research Corporation8778B
REM Aluminium-ProbenhalterungenElektronenmikroskopieSciences 75220
NatriumkacodylatElektronenmikroskopie Sciences12300
Texas red-dextraThermo Fisher ScientificD1864
Trypanblau LösungThermo Fisher Scientific15250061
Zeiss LSM 780 Konfokalmikroskop

Referenzen

  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286(2018).
  3. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
  4. Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8(2015).
  5. Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
  6. Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
  7. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  8. Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  10. Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879(2014).
  11. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).
  12. Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277(2015).
  13. Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
  14. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121(2020).
  15. Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
  16. Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
  17. Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
  18. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
  19. Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156(2019).
  21. Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
  22. Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537(2018).
  23. Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
  24. Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
  25. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  26. Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
  27. Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
  28. Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300(2015).
  29. Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360(2010).
  30. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
  31. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  32. Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

MakropinozytosePlasmamembran-ProtrusionenAktinpolymerisationmakropinozytische CupsDurchflusszytometriekonfokale MikroskopieZelloberflächen-ImagingMakrophagenstimulation
Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.