Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der für die Internalisierung einer großen Menge extrazellulärer Flüssigkeit und ihres Gehalts durch die Bildung von dynamischen und aktingetriebenen Plasmamembranvorsprüngen, den sogenannten Membranrüschen,^{verantwortlich ist 1}. Viele dieser Membranrüschen bilden Tassen, die sich schließen und wieder mit der Zelle verschmelzen und sich von der Plasmamembran als große, heterogene intrazelluläre Endosomen^, auch Makropinosomen 1 genannt, trennen. Obwohl die Makropinozytose durch Wachstumsfaktoren wie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in einer Vielzahl von Zelltypen induziert wird, wurde ein weiterer einzigartiger, kalziumabhängiger Prozess, der als konstitutive Makropinozytose bekannt ist, auch in angeborenen Immunzellen^beobachtet 2,3,4,5,6,7,8.

Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit von Zellen, extrazelluläres Material durch Makropinozytose zu internalisieren, eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen spielt, die von der Nährstoffaufnahme über den Erregerfang bis hin zur Antigenpräsentation^reichen 9,10,11. Da dieser Prozess jedoch nicht selektiv und induzierbar ist, wurde er auch mit einer Reihe von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Tatsächlich deuteten frühere Studien darauf hin, dass die Makropinozytose eine wichtige Rolle bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, Krebs, Nephrolithiasis und Atherosklerose^spielt 12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben bestimmte Bakterien und Viren gezeigt, dass sie Makropinozytose nutzen, um in Wirtszellen einzudringen und eine Infektion zu induzieren^17,18. Interessanterweise kann die Stimulation der Makropinozytose auch für die gezielte Abgabe von Therapeutika bei verschiedenen Krankheitszuständen genutzt werden^19,20.

Frühere Studien haben die Makropinozytose untersucht, indem internalisierte fluoreszenzmarkierte Fluidphasenmarker in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologischen Wirkstoffen, die die Makropinozytose hemmen, mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Bildgebung^{quantifiziert wurden 21,22}. Derzeit verfügbare pharmakologische Werkzeuge, die die Makropinozytose hemmen, sind beschränkt auf und umfassen 1) Aktinpolymerisationsinhibitoren (Cytochalasin D und Latrunculine), 2) PI3K-Blocker (LY-290042 und Wortmannin) und 3) Inhibitoren von Natrium-Wasserstoff-Austauschern (NHE) (Amilorid und EIPA)5,14,15,23,24,25 . Da diese Inhibitoren jedoch endozytoseunabhängige Wirkungen haben, ist es schwierig, den Beitrag der Makropinozytose zur Aufnahme von gelösten Stoffen und zur Krankheitspathogenese selektiv zu bestimmen, insbesondere in vivo²¹.

Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist eine Art Elektronenmikroskop, das ultrahochauflösende Bilder von Zellen mit einem fokussierten Elektronenstrahl²⁶ erzeugt. In der Makropinozytoseforschung gilt die REM-Bildgebung als die Goldstandardtechnik, um topographische und morphologische Eigenschaften der Plasmamembran zu visualisieren, die Bildung von Membranrüschen zu quantifizieren und ihr Fortschreiten zur Makropinosomenverinnerlichung zu untersuchen. Darüber hinaus bietet die Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der Quantifizierung der Aufnahme gelöster Stoffe in Gegenwart und Abwesenheit von Makropinozytoseblockern eine zuverlässige Strategie zur Untersuchung der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe in vitro. Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll, wie Zellen auf REM vorbereitet, die Zelloberfläche visualisiert, die Rüschenbildung quantifiziert und ihr Fortschritt in Richtung Cup-Verschluss und Makropinosom-Internalisierung untersucht werden.

HINWEIS: Das Folgende ist ein allgemeines Protokoll zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in RAW 264.7-Makrophagen mittels REM-Mikroskopie. Für verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung erforderlich sein.

1. Zelllinie und Zellkultur

1. Züchten Sie RAW 264,7 Makrophagen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂. Ersetzen Sie Wachstumsmedien jeden zweiten Tag.
2. Wenn die Zellen zu 80% konfluieren, waschen Sie die Platte zweimal mit sterilem PBS.
3. Die Zellen werden durch Zugabe von 1.000 μL 0,5% Trypsin-EDTA abgelöst und die Zellkulturplatte für 3-5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert.
4. Untersuchen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Zelldissoziation zu bestätigen. Fügen Sie 10 ml Wachstumsmedien hinzu, die 10% FBS enthalten, um Trypsin zu inaktivieren.
5. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Zellen sanft im gesamten Zellkulturmedium und bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Trypan Blue (0,4%) Färbung.
   HINWEIS: Die empfohlene Mindestzelllebensfähigkeit für dieses Experiment beträgt >90%.
6. Platzieren Sie sterile Glasabdeckungen in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit autoklavierten Pinzetten. Samen Sie Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/ml und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂.
7. Wechseln Sie das Medium jeder Vertiefung vor der Behandlung mit frischen 500 μL Vollmedien. Vorbehandlung von Makrophagen mit Vehikel (DMSO oder anderen Lösungsmitteln zur Auflösung von EIPA) oder dem Makropinozytoseinhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amilorid (EIPA, 25 μM²¹) für 30 min.
8. Behandeln Sie Zellen mit Vehikel und Stimulatoren der Makropinozytose, um das Membran-Ruffling zu fördern: Phorbol 12-Myrisat 13-Acetat (PMA, 1 μM, 30 min²¹) und Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min³).
   HINWEIS: Alternative Inhibitoren [z. B. Latrunculin A (1 μM, 30 min) oder Cytochalasin D (1 μM, 30 min)] und Stimulatoren [z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) oder von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] der Makropinozytose können auch zur Charakterisierung der Makropinozytose bei Makrophagen und anderen Zelltypen^{verwendet werden 16,27, 28,29} Zellen können vor der Behandlung mit physiologischen Stimulatoren der Makropinozytose über Nacht Serumhunger erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass die effektivsten Konzentrationen und Inkubationszeiten bestimmt werden müssen, um die Makropinozytose in anderen Zelltypen zu stimulieren.

2. SEM-Fixierung

1. Nach der Behandlung die Medien aus den Vertiefungen absaugen und Deckgläser zweimal mit eiskaltem PBS waschen.
2. Fixieren Sie Zellen (4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat) für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht im Fixiermittel bei 4 ° C.
3. Deckgläser mit 500 μL Folgereagenzien schonend waschen und inkubieren, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
   1. Einmal in 0,1 M Natriumcacodylat waschen und 15 min inkubieren.
   2. Zweimal mit dH₂O waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
   3. Zweimal mit 25% Ethanol mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche waschen.
   4. Zweimal mit 50% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
   5. Zweimal mit 75% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
   6. Waschen Sie zweimal mit 80% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
   7. Waschen Sie zweimal mit 95% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
   8. Zweimal mit 100% Ethanol waschen. Führen Sie 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche durch.
      HINWEIS: Das Wechseln / Ersetzen von Reagenzien sollte schnell erfolgen, um ein Austrocknen der Zellen an der Luft zu verhindern. Deckgläser können in 100% Ethanol für mehrere Tage bei 4 °C belassen werden. Für die Langzeitlagerung fügen Sie zusätzliches 100% Ethanol hinzu und bedecken Sie die Vertiefungen mit Parafilm, um ein Austrocknen der Probe an der Luft zu verhindern.

3. Kritische Punktetrocknung

1. Legen Sie die Deckgläser in einen Critical Point Dryer und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie die Power-Taste und öffnen Sie den CO_2-Tank .
2. Drücken Sie die Cool-Taste ca. 30 s lang, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt. Drücken Sie die Taste "Füllen", bis im Kammerfenster eine Blase angezeigt wird.
3. Drücken Sie die Löschtaste , bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülauspuff verschwindet. Drücken Sie die Taste Cool erneut, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt.
4. Drücken Sie die Tasten Fill und Purge, um sie auszuschalten und den CO_2-Tank zu schließen. Drücken Sie die Taste Cool, um sie auszuschalten, und drücken Sie die Taste Heat .
5. Stellen Sie die Temperatur auf 42 °C und den Druck auf 1.200 psi ein. Sobald sich der Druck und die Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Bleed-Taste , damit der Druck langsam abnimmt.
6. Sobald der Kammerdruck 150 psi erreicht hat, drücken Sie die Entlüftungstaste und warten Sie, bis der Druck auf 0 psi sinkt. Schalten Sie den kritischen Punkttrockner aus und entfernen Sie die Deckgläser.
7. Montieren Sie Deckgläser auf REM-Aluminiumprobenhalterungen mit Carbon-Klebelaschen und unterliegen einer Sputterbeschichtung mit Gold / Palladium in einem Sputterbeschichter.
8. Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen.
9. Sobald das Vakuum auf 200 mTorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
10. Drücken Sie die Timer-Taste und stellen Sie den Spannungsregler so lange ein, bis das Messgerät 10 mA anzeigt. Entfernen Sie beschichtete Deckgläser aus der Kammer.
    HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um eine kritische Punkttrocknung und Sputterbeschichtung der Probe durchzuführen.

4. Bildgebung und Quantifizierung

1. Probendeckel in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops einführen. Schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste .
2. Öffnen Sie die SEM-Betriebssoftware. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 kV und den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
3. Drücken Sie die Taste Koordinaten und bewegen Sie sich um den Controller herum, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 3.500-fache ein und stellen Sie die Probe ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine höhere Vergrößerungsstufe (8.500x bis 16.000x), um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen.
4. Nehmen Sie Bilder von mindestens 10 zufälligen Stellen auf den Deckgläsern auf und stellen Sie sicher, dass jedes mikroskopische Feld mehrere Zellen enthält. Speichern Sie Bilder als .tif Dateien.
5. Aus den Bildern finden Sie Membranrüschen, definiert als hervorstehende deckenartige Falten der Plasmamembran mit einer Größe von mehr als 500 nm (Abbildung 1). Zählen Sie die Anzahl der Rüschen pro Zelle.
   HINWEIS: C-förmige Rüschen wurden als gekrümmte Membranvorsprünge identifiziert, die an ihren seitlichen Enden nicht verschmolzen [(Abbildung 1 (M-CSF-Behandlung) und Abbildung 2B]. Verschmolzene kreisförmige Membranrüschen wurden vor ihrem Verschluss als makropinozytotische Becher identifiziert (Abbildung 2C).
6. Normalisieren Sie die Anzahl der Membranrüschen auf die Gesamtzahl der Zellen im ausgewerteten mikroskopischen Feld. Wiederholen Sie diese Analyse für die Proben aus jeder Gruppe.

Hier beschreiben wir die Ergebnisse der vorgestellten Technik. Repräsentative REM-Bilder, die in Abbildung 1 gezeigt werden, zeigen die Bildung von Membranrüschen in RAW 264,7-Makrophagen nach der Behandlung mit PMA und M-CSF. Die Bilder wurden zuerst mit einer Vergrößerung von 3.500x zu Quantifizierungszwecken und dann mit höheren Vergrößerungsgraden (8.500x bis 16.000x) aufgenommen, um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropinozytose-Inhibitor EIPA attenuierte Membranrüschenbildung (Abbildung 1). Macropinozytose-assoziierte Plasmamembranaktivitäten können in fünf aufeinanderfolgende Schritte unterteilt werden: 1) Einleitung des Membran-Rüschens, 2) Zirkularisierung, 3) Cup-Formation, 4) Cup-Verschluss und 5) Internalisierung der extrazellulären Flüssigkeit und der damit verbundenen gelösten Stoffe durch Makropinosomenbildung. Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder dieser morphologisch unterschiedlichen Plasmamembranaktivitäten nach M-Liquor Stimulation. Große blattartige Rüschen (Abbildung 2A), kreisförmige C-förmige Rüschen (Abbildung 2B) und makropinozytäre Becher (Abbildung 2C) wurden bei einer Vergrößerung von 6.000x bis 7.000x eingefangen. Die Rasterelektronenmikroskopie kann verwendet werden, um hochauflösende Bilder der Zelloberfläche zu liefern, kann jedoch nicht zur Visualisierung internalisierter Makropinosomen verwendet werden. Die Quantifizierung von Membranrüschen nach PMA- und M-CSF-Behandlung ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Bildung eines Macropinosoms kann durch alternative bildgebende Verfahren, einschließlich konfokaler Mikroskopie, bestätigt werden, wie in Abbildung 4 dargestellt. Schließlich sollte die REM-Quantifizierung des Membran-Rufflings durch die Durchflusszytometrie-Quantifizierung eines fluoreszierenden Fluidphasenmarkers (z. B. FITC- oder Texas-Red-Dextran) ergänzt werden, um die Stimulation der Makropinozytose zu bestätigen (Abbildung 5).

Abbildung 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von RAW 264.7 Makrophagen. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit Vehikel (DMSO-Kontrolle) oder EIPA (25 μM) vorbehandelt und mit PMA (1 μM, 30 min) oder M-CSF (100 ng/ml, 30 min) inkubiert, um das Membran-Ruffling zu stimulieren. Bilder auf der rechten Seite zeigen eine höhere Vergrößerung der Zelloberfläche. Rote Pfeile: Membranrüschen. Grüner Pfeil: C-förmige Rüsche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Morphologische Stadien der Makropinozytose, die durch Rasterelektronenmikroskopie erfasst wurden. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit M-CSF (100 ng/ml) behandelt und Zellen für die REM-Bildgebung verarbeitet. (A ) blattartiger Membranvorsprung, ( B ) C-förmige Membranrüsche und (C) makropinozytäre Tasse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Quantifizierung der Membranrüschenbildung. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit Vehikel (DMSO-Kontrolle) oder EIPA (25 μM) vorbehandelt und mit PMA (1 μM, 30 min) oder M-CSF (100 ng/ml, 30 min) inkubiert, um das Membran-Ruffling zu stimulieren. Das Balkendiagramm zeigt die Anzahl der Membranrüschen, die auf die Gesamtzahl der Zellen normalisiert sind (n = 3). Die Daten stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA; *p < 0,05 vs. Fahrzeug, #p < 0,05 vs. PMA- oder M-CSF-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Macropinosom-Formation. Die Zellen wurden 30 min lang mit PMA vorbehandelt und mit Texas Red-Dextran (25 μg/ml, rot) und FM4-64 (5 μg/ml, grün) für 10 min inkubiert. Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Mikroskop durchgeführt. Blaue Pfeile: Membranrüschen, gelbe Pfeile: Makropinosom mit Texas Red-Dextran, grüne Pfeile: Makropinosomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Quantifizierung der Makropinozytose. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit Vehikel (DMSO-Kontrolle) oder EIPA (25 μM) vorbehandelt und mit PMA (1 μM) und FITC-Dextran (100 μg/ml; 70.000 MW) für 2 h inkubiert. Das Balkendiagramm zeigt die Faltenänderung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) normalisiert auf die Fahrzeugbehandlung (n = 3, durchgeführt in Dreifachpackungen). Die Daten stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA; *p < 0,05 vs. Fahrzeug, #p < 0,05 vs. PMA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.