Visualisierung der Membranrüschenbildung mittels Rasterelektronenmikroskopie

Summary

Macropinozytose ist ein hochkonservierter endozytischer Prozess, der durch die Bildung von F-Aktin-reichen blattartigen Membranprojektionen, auch bekannt als Membranrüschen, ausgelöst wird. Eine erhöhte Rate der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe wurde mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in vitro mittels Rasterelektronenmikroskopie dar.

Abstract

Membran-Ruffling ist die Bildung von beweglichen Plasmamembranvorsprüngen, die ein Geflecht aus neu polymerisierten Aktinfilamenten enthalten. Membranrüschen können sich spontan oder als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, entzündliche Zytokine und Phorbolester bilden. Einige der Membranvorsprünge können sich zu kreisförmigen Membranrüschen reorganisieren, die an ihren distalen Rändern verschmelzen und Becher bilden, die sich als große, heterogene Vakuolen, die Makropinosomen genannt werden, schließen und in das Zytoplasma trennen. Während des Prozesses fangen Rüschen extrazelluläre Flüssigkeit und gelöste Stoffe ein, die sich in Makropinosomen verinnerlichen. Die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist ein häufig verwendetes bildgebendes Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und geschlossenen makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche. Das folgende Protokoll beschreibt die Zellkulturbedingungen, die Stimulation der Membranrüschenbildung in vitro und die Fixierung, Dehydrierung und Vorbereitung von Zellen für die Bildgebung mit REM. Die Quantifizierung von Membranrüschen, Datennormalisierung sowie Stimulatoren und Inhibitoren der Membranrüschenbildung werden ebenfalls beschrieben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen über die Rolle der Makropinozytose in physiologischen und pathologischen Prozessen zu beantworten, neue Ziele zu untersuchen, die die Bildung von Membranrüschen regulieren, und noch nicht charakterisierte physiologische Stimulatoren sowie neuartige pharmakologische Inhibitoren der Makropinozytose zu identifizieren.

Introduction

Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der für die Internalisierung einer großen Menge extrazellulärer Flüssigkeit und ihres Gehalts durch die Bildung von dynamischen und aktingetriebenen Plasmamembranvorsprüngen, den sogenannten Membranrüschen,^{verantwortlich ist 1}. Viele dieser Membranrüschen bilden Tassen, die sich schließen und wieder mit der Zelle verschmelzen und sich von der Plasmamembran als große, heterogene intrazelluläre Endosomen^, auch Makropinosomen 1 genannt, trennen. Obwohl die Makropinozytose durch Wachstumsfaktoren wie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und den epidermalen Wachstu....

Protocol

HINWEIS: Das Folgende ist ein allgemeines Protokoll zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in RAW 264.7-Makrophagen mittels REM-Mikroskopie. Für verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung erforderlich sein.

1. Zelllinie und Zellkultur

1. Züchten Sie RAW 264,7 Makrophagen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂. Ersetzen Sie Wachstumsmedien jeden zweiten Tag.
2. Wenn die Zellen zu 80% konfluieren, waschen Sie die Platte zweimal mit s....

Results

Hier beschreiben wir die Ergebnisse der vorgestellten Technik. Repräsentative REM-Bilder, die in Abbildung 1 gezeigt werden, zeigen die Bildung von Membranrüschen in RAW 264,7-Makrophagen nach der Behandlung mit PMA und M-CSF. Die Bilder wurden zuerst mit einer Vergrößerung von 3.500x zu Quantifizierungszwecken und dann mit höheren Vergrößerungsgraden (8.500x bis 16.000x) aufgenommen, um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropinozytose-In.......

Discussion

Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. Obwohl sich das aktuelle Protokoll auf Makrophagen konzentriert, haben Studien gezeigt, dass die Bildung von Membranrüschen auch bei verschiedenen anderen Zelltypen auftritt, darunter^dendritische Zellen, Fibroblasten, Neuronen und Krebszellen 11,12,14,21,30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 % Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2 % Glutaraldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	16320
4 % Paraformaldehyd	Santa Cruz Biotechnologie	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amilorid	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Durchflusszytometer
Kohlenstoff-Klebetabletten	Elektronenmikroskopie Sciences	77825-09
Dimethylsulfoxid	Corning	25-950-CQC
Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem flachem Boden TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte	Falcon	353047
fötales Rinderserum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2-Inkubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Modell 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR Rasterelektronenmikroskop
Mikroskop Abdeckung Glas	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristat 13-acetat	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 Makrophagen	ATCC	ATCC TIB-71
Rekombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Kritischer Punkttrockner	Tousimis Research Corporation	8778B
REM Aluminium-Probenhalterungen	Elektronenmikroskopie	Sciences 75220
Natriumkacodylat	Elektronenmikroskopie Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypanblau Lösung	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 Konfokalmikroskop