Transposon-Insertionssequenzierung als Werkzeug zur Aufklärung bakterieller Besiedlungsfaktoren in einem Burkholderia gladioli Symbionten von Lagria villosa Käfern

Burkholderia gladioli kann eine symbiotische Assoziation mit Lagria villosa-Käfern eingehen und eine wichtige Rolle bei der Abwehr mikrobieller Antagonisten des Insektenwirts^{spielen 4,5,6}. Weibliche Käfer beherbergen mehrere Stämme von B. gladioli in spezialisierten Drüsen, die dem Fortpflanzungssystem beiwohnen. Bei der Eiablage schmieren Weibchen B. gladioli-Zellen auf die Eioberfläche, wo antimikrobielle Verbindungen, die von B. gladioli produziert werden, Infektionen durch entomopathogene Pilze hemmen^4,6. Während der späten Embryonalentwicklung oder früh nach dem Schlüpfen der Larven besiedeln die Bakterien kutikuläre Invaginationen auf der dorsalen Oberfläche der Larven. Trotz dieser spezialisierten Lokalisierung und vertikalen Übertragungsroute der Symbionten kann L. villosa vermutlich auch B. gladioli horizontal aus der Umgebung erwerben⁴. Weiterhin wurden mindestens drei Stämme von B. gladioli in Verbindung mit L. villosa^4,6gefunden. Unter diesen ist B. gladioli Lv-StA der einzige, der in vitrokultiviert werden kann.

B. gladioli Lv-StA hat eine Genomgröße von 8,56 Mb⁶ und enthält 7.468 Gene. Welche dieser Gene sind wichtig für B. gladioli-Bakterien, um den Käferwirt zu besiedeln? Um diese Frage zu beantworten, verwendeten wir transposon-insertion sequencing (Tn-seq), eine explorative Methode zur Identifizierung bedingt essentieller mikrobieller Gene^1,2,3. Eine mutantenBibliothek von B. gladioli Lv-StA wurde mit einem Tn5-Transposon erstellt. Durch Konjugation von Escherichia coli-Spenderzellen zu B. gladioli Lv-StA wurde ein pRL27-Plasmid mit dem Tn5-Transposon und eine Antibiotikaresistenzkassette, flankiert von invertierten Wiederholungen, übertragen (Abbildung 1). Dabei wurde eine Reihe von Mutanten erzeugt, die einzeln Störungen von 3.736 Symbiontengenen tragen (Abbildung 2).

Der Mutantenpool wurde auf Käfereiern infiziert, um die Besiedlungsfaktoren zu identifizieren, und als Kontrolle wurde er auch in vitro in King's B (KB) Medium gezüchtet. Nachdem genügend Zeit für die Besiedlung eingerafft wurde, wurden geschlüpfte Larven gesammelt und für die DNA-Extraktion gebündelt. DNA-Fragmente, die den Transposon-Insert und die flankierende genomische Region von B. gladioli Lv-StA enthalten, wurden mit einem modifizierten DNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die Sequenzierung ausgewählt. Die Verarbeitung der Lesequalität gefolgt von einer Analyse mit DESeq2 wurde durchgeführt, um spezifische Gene zu identifizieren, die für B. gladioli Lv-StA entscheidend sind, um L. villosa-Larven zu besiedeln, wenn sie über die Eioberfläche übertragen werden.

1. Medien- und Puffervorbereitung

1. KB- und LB-Medien und Agarplatten gemäß Tabelle 1vorbereiten und Autoklaven bei 121 °C, 15 psi, 20 min.
   1. 50 μg/ml filtersterilisiertes Kanamycin und 300 μM filtersterilisierte 2,6-Diaminopimelsäure (DAP) werden vor der Kultivierung von E.coli WM3064 + pRL27 in das autoklavierte LB-Medium gegeben.
   2. Fügen Sie dem autoklavierten KB-Agar 50 μg/ml filtersterilisiertes Kanamycin hinzu, um Platten zu gießen, die für die Auswahl erfolgreicher B. gladioli Lv-StA-Transkonjugantien erforderlich sind.
2. 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Mischen der folgenden Komponenten herstellen: NaCl 8 g/L, KCl 0,201 g/L,_Na2HPO₄ 1,42 g/L und_KH2PO₄ 0,272 g/L. Die Salze in destilliertem Wasser auflösen und das Gemisch bei 121 °C, 15 psi, 20 min vor Gebrauch autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern.
3. Bereiten Sie einen 2x Bind-and-Wash-Puffer vor, indem Sie die folgenden Komponenten auflösen: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 2 M NaCl in destilliertem Wasser. Filter-sterilisieren Sie die Mischung vor dem Gebrauch. Bei Raumtemperatur lagern.
4. Bereiten Sie 1x Low-TE vor, indem Sie 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 0,1 mM EDTA in doppelt destilliertem Wasser auflösen. Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 °C, 15 psi, 20 min. Bei Raumtemperatur lagern.

2. Konjugation zur Erzeugung der Transposon-Mutantenbibliothek

Abbildung 1:Schritte desKonjugationsprotokolls. Der Konjugationsempfänger Burkholderia gladioli Lv-StA (rot) und der Spender Escherichia coli, die das pRL27-Plasmid (rosa) enthalten, werden in KB-Agar bzw. LB gezüchtet, ergänzt mit Kanamycin und DAP. Nach konjugativem Transfer des Plasmids für 12-18 h bei 30 °C werden die transkonjuganten B. gladioli-Zellen auf KB- enthaltend Kanamycin selektiert und zusammengepoolt. Abkürzungen: DAP = 2,6-Diaminopimelsäure; Kan = Kanamycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Unter einer sterilen Haube impfen Sie eine frische Spenderkultur von Escherichia coli WM3064 + pRL27 in 10 ml LB-Medium, ergänzt mit Kanamycin und DAP. Inokulation von Burkholderia gladioli Lv-StA-Empfängerzellen in 5 ml KB-Medium. Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 °C über Nacht auf einem Shaker bei 250 U/min.
2. Nach dem Wachstum über Nacht zentrifugieren Sie 4 ml jeder der Kulturen bei 9.600 × g für 6 min, um die Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand.
3. Waschen Sie unter einer sterilen Haube die pelletierten Zellkulturen in KB-Medium, das DAP enthält, und schließlich werden die Kulturen separat in 4 ml KB + DAP-Medium resuspendiert.
4. In einem frischen 15-ml-Röhrchen werden 250 μL der gewaschenen E. coli-Spenderzellen mit 1 ml der gewaschenen B. gladioli Lv-StA-Empfängerzellen gemischt.
5. Spot 10 μL dieser Konjugationszellmischung auf KB-Agarplatten, die DAP enthalten. Lassen Sie die Platte ungestört in der sterilen Haube bei Raumtemperatur für 1 h ruhen. Anschließend die Platten mit den Konjugationspunkten bei 30 °C für 12-18 h inkubieren.
   HINWEIS: Die Konjugationszeit kann entsprechend der Zielart angepasst werden. Eine lange Konjugationszeit erhöht jedoch das Risiko für doppelte Insertionen oder Plasmidintegration in das Genom. Für langsam wachsende Bakterien längere Konjugationszeiten zulassen.
6. Nach der Inkubation 2-4 ml 1x PBS unter einer sterilen Haube in die Platten geben und mit einem Zellschaber die gewachsenen bakteriellen Konjugationsstellen aus dem Agar freisetzen. Pipetieren Sie das konjugierte Zellgemisch in 2 mL Mikrofugenröhrchen.
7. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 9.600 × g für 2 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal in 1 ml 1x PBS durch Pipettieren nach oben und unten. Das endgültige Pellet in 1200 μL 1x PBS wiedergeben. Vor dem Plattieren Verdünnungen vornehmen, wenn die Anzahl der Zellen in der Mischung über 1 × 10^{4 liegt.}
8. Gut mischen und 200 μL der Zellmischung auf großen KB-Agarplatten (6 oder mehr, falls erforderlich) mit Kanamycin ergänzt verteilen und über Nacht bei 30 °C inkubieren.
   HINWEIS: Zielmutierte Kolonien erscheinen innerhalb von 30 h auf den selektiven Agarplatten. Aufgrund des Antibiotikaresistenzmarkers erscheinen nur mutierte Kolonien auf der selektiven Agarplatte. Daher wird erwartet, dass alle Kolonien erfolgreiche Transkonjuganten sind.
9. Zählen Sie die Gesamtzahl der transkonjuganten Kolonien auf drei Platten und extrapolieren Sie, um die ungefähre Anzahl der Mutanten zu berechnen, die in allen Platten erhalten wurden. Um die Chancen auf eine repräsentative Bibliothek zu erhöhen, stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Kolonien um ein Vielfaches höher ist als die Gesamtzahl der Gene im Genom. Um den Erfolg der Konjugation zu bestätigen, führen Sie eine PCR durch, die auf die Einführkassette mit 10-20 Probenkolonien abzielt, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
   HINWEIS: Ziel ist es, sicherzustellen, dass die Anzahl der Kolonien mindestens das 10-fache der Anzahl der Gene im gesamten Genom beträgt, in diesem Fall >75.000 Mutanten. Es ist jedoch im Allgemeinen schwierig, die Anzahl der Kolonien, die einer vollständig repräsentativen Bibliothek entsprechen würden, genau zu schätzen. Die Anzahl der mutierten eindeutigen Gene ist zu diesem Zeitpunkt nicht ersichtlich, da Störungen in essentiellen Genen nicht erfasst werden, es oft mehrere verschiedene Mutationsstellen für dasselbe Gen gibt und Mutationen, die mit Tn5-Transposons erzeugt werden, nicht ganz zufällig sind.
10. Unter einer sterilen Kapuze kolonien Sie Kolonien von den Platten, indem Sie 1-2 ml 1x PBS auf das Agar geben. Die von den Platten abgekratzte Zellmischung wird in 50-ml-Röhrchen gepoolt. Wirbeln Sie die Bibliothek gründlich durch und teilen Sie dann 4 ml der gepoolten Mutantenbibliothek in mehrere Kryoröhren auf. 1 ml 70% Glycerin in die Röhrchen geben und bei -80 °C lagern.

3. PCR und Gelelektrophorese zur Bestätigung erfolgreicher Insertionen in B. gladioli Lv-StA

1. Um das Vorhandensein der Insertion zu bestätigen, wählen Sie einzelne mutierte Kolonien aus den Selektionsplatten in Schritt 2.9 aus und führen Sie eine PCR durch, die auf die Einführkassette mit den in Tabelle 2aufgeführten Primern abzielt. Bereiten Sie den PCR-Mastermix gemäß Tabelle 3 vor und legen Sie die Bedingungen im Thermocycler wie in Tabelle 4beschrieben fest.
2. Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1,6% igen Agarosegel durch Elektrophorese (250 V, 40 min) aus, um zu überprüfen, ob die amplifizierten DNA-Fragmente die erwartete Länge von 1580 bp haben.

4. Mutantenpoolinfektion auf Käfereiern

1. Waschschritte der Bibliothek
   1. Tauen Sie ein Aliquot der vorbereiteten Mutantenbibliothek auf Eis auf. Zentrifuge bei 2.683 × g für 10 min und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen unter einer sterilen Haube mit 4 ml 1x PBS, um das verbleibende Medium aus den Zellen zu entfernen. Resuspend die Zellen in 4 ml 1x PBS.
   2. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Bibliothek mithilfe einer Zellzählkammer. Verdünnen Sie einen Teil der Bibliothek auf 2 × 10⁶ Zellen/μL in 1x PBS.
   3. Vortex die Bibliothek aliquot gründlich, um die gesamte Bibliothek homogen zu mischen, bevor Sie das erforderliche Volumen nehmen.
2. Ei-Clutch-Sterilisation und In-vivo-Infektion
   1. Wählen Sie ein L. villosa Eierkupplungsgelege. Zählen Sie die Anzahl der Eier und fahren Sie fort, wenn das Gelege mehr als 100 Eier enthält.
   2. Sterilisieren Sie das gesamte Eierkupplungslege.
      1. Fügen Sie 200 μL 70% Ethanol hinzu und waschen Sie die Eier vorsichtig für 5 min. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie die Eier zweimal mit autoklaviertem Wasser.
      2. Fügen Sie 200 μL 12% Bleichmittel (NaOCl) hinzu und waschen Sie die Eier 30 s lang vorsichtig. Entfernen Sie das Bleichmittel sofort und waschen Sie die Eier dreimal mit 200 μL autoklaviertem Wasser.
   3. Infizieren Sie 2 ×^{10 6} Zellen/μL der gewaschenen Mutantenbibliothek auf dem sterilisierten Eigelege (2,5 μL pro Ei).
   4. Zwei Tage nach dem Schlüpfen der infizierten Käferlarven 100 2. Instar-Larven pro 1,5 ml Mikrofugenröhrchen sammeln und bei -80 °C^lagern.
3. In-vitro-Mutantenbibliothekskontrolle
   1. Unter einer sterilen Haube werden 250 μL von 2 × 10^{6 Zellen/μL} der gewaschenen Mutantenbibliothek in 10 ml KB-Medium, das Kanamycin enthält, geimpft.
   2. Inkubieren Sie die in vitro mutierte Kultur bei 30 °C für 20 h.
      HINWEIS: Berechnen Sie die Dauer der Inkubation so, dass sie der ungefähren Anzahl der Generationen von WT B. gladioli Lv-StA in vivo während der Kolonisation entspricht.
   3. Nach der 20 h Inkubation wird ein gleiches Volumen von 70% Glycerin in die in vitro mutierte Kultur geben und bei -80 °C gelagert.

5. Infizierte Käfer und in vitro mutierte Bibliothek DNA-Extraktion

HINWEIS: DNA-Extraktionen wurden mit einem DNA- und RNA-Reinigungskit gemäß dem unten kurz beschriebenen Protokoll des Herstellers durchgeführt.

1. Homogenisieren Sie gepoolte Larven (maximal 4 mg pro Mikrofugenröhrchen), indem Sie 1-2 ml flüssigen Stickstoff hinzufügen und mit einem Stößel zerkleinern.
2. Tauen Sie die in vitro gewachsenen Mutantenkulturen aus Glycerinvorräten auf Eis auf. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 9.600 × g für 10 min vor der Zelllyse.
3. 300 μL Gewebe- und Zelllyselösung werden zu den in vitro und in vivo Proben hinzugefügt. 5 μL 10 mg/ml Proteinase K hinzufügen, die Mischung bei 60 °C für 15 min inkubieren und dann für 3-5 min auf Eis legen.
4. Fügen Sie 150 μL Proteinfällungsreagenz gründlich zu den Lysaten und wirbeln Sie hinzu. Pelletieren Sie die Proteinreste durch Zentrifugieren bei 9.600 × g für 10 min.
5. Den Überstand in ein 1,5 ml Mikrofugenröhrchen überführen. 500 μL Isopropanol in den Überstand geben und die Röhrchen mindestens 40 Mal vorsichtig umkehren, bevor sie bei -20 °C für 1 h oder über Nacht inkubiert werden.
6. Pelletieren Sie die gefällte DNA durch Zentrifugieren bei 9.600 × g für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem DNA-Pellet eiskaltes 70% Ethanol hinzu.
7. Zentrifuge bei ≥10.000 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie die Proben mindestens 1 h an der Luft trocknen.
8. Resuspend die DNA aus den in vitro und in vivo Proben in 100 μL Low-TE-Puffer.
9. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.

6. Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek

HINWEIS: Das Protokoll und die Reagenzien für die DNA-Bibliotheksvorbereitung werden gemäß den Anweisungen des Herstellers des DNA-Bibliotheksvorbereitungskits angepasst und modifiziert.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Vorbereitungsschritte der DNA-Bibliothek. Nach dem Scheren und der Adapterligatur umfasst das modifizierte Protokoll einen Streptavidin-Perlenauswahlschritt, um DNA-Fragmente anzureichern, die die Insertionskassette enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Verdünnen Sie die Proben auf 20 ng/μL Konzentration und Volumen von 100 μL und halten Sie sie auf Eis.
2. Scheren Sie dna in vivo und in vitro mit einem Ultraschallgerät. Stellen Sie den Ultraschall auf 70% Leistung ein. Wirbeln Sie die Proben kurz vor und scheren Sie für 1 min 30 s.
   HINWEIS: Die Einstellungen für den Ultraschallgerät unterscheiden sich zwischen den Instrumenten. In diesem Fall betrug die Fragmentgröße 200-400 bp, was für diesen Sequenzierungsansatz von 150 bp, gepaartes Ende, angemessen ist (siehe Schritt 9.1). Die Scherparameter können entsprechend den Anforderungen des Experimentatores angepasst werden.
3. Überprüfen Sie, ob die DNA auf den gewünschten Größenbereich geschert wurde (in diesem Fall 200-400 bp). Laden Sie 5 μL der ungehörten und gescherten DNA nach dem Mischen mit Gelbeladungsfarbstoff im Verhältnis 1:1 auf einen 1,6% igen Agarosegellauf bei 250 V für 40 min (Abbildung 3A, B).
4. Vorbereitung der für die Adapterligatur erforderlichen Fragmentenden
   1. Zu 50 μL der gescherten DNA werden die im Bibliotheksvorbereitungskit angegebenen Endpräparationsreagenzien hinzugefügt: 3 μL der Enzymmischung und 7 μL Reaktionspuffer und durch Pipettieren gut mischen. Stellen Sie einen Thermocycler mit beheiztem Deckel auf ≥ 75 °C und inkubieren Sie die Proben für 30 min bei 20 °C und 30 min bei 65 °C. Bei 4 °C halten.
5. Adapterligatur
   1. Für die Adapterligatur fügen Sie den Produkten des Endvorbereitungsschritts die folgenden Reagenzien hinzu: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer und 2,5 μL verdünnter Adapter. Durch Pipettieren gründlich mischen und die Probe 15 min bei 20 °C im Thermocycler bei abgezogenem Deckel ausbrüten.
   2. Nach 15 min 3 μL des Enzyms (Uracil DNA Glycosylase + DNA Glycosylase-Lyase Endonuclease VIII) hinzufügen (siehe Materialtabelle). Durch Pipettieren gut mischen und die Probe 15 min bei 37 °C in einem Thermocycler mit ≥47 °C erhitzen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt angehalten werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.
6. Größenauswahl von adapterligierten DNA-Targeting-Fragmenten von 250 bp
   1. Wirbeln Sie die magnetische Perlenlösung vor (siehe Materialtabelle)und legen Sie sie vor Gebrauch 30 Minuten lang auf Raumtemperatur.
   2. 0,3x Perlen zu 96,5 μL der ligierten DNA-Mischung geben und durch gründliches Pipettieren mischen. Inkubieren Sie die Perlenmischung für 5 min.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von Salzen und Polyethylenglykol in der Perlenmischung erleichtert die Ausfällung von DNA-Fragmenten auf den Perlen. Ein geringes Verhältnis von Perlen zu DNA-Molekülen führt dazu, dass nur größere DNA-Fragmente an die Perlen gebunden werden. In diesem Fall werden DNA-Fragmente über 250 bp Länge an die Perlen gebunden.
   3. Legen Sie die Röhrchen auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen herunterzuziehen und DNA-Fragmente unerwünschter Größe zu entfernen. Lassen Sie die Perlen 5 min ruhen und übertragen Sie dann den klaren Überstand in ein neues Mikrofugenröhrchen (behalten Sie den Überstand).
   4. Fügen Sie 0,15x frische Perlen in den Überstand hinzu und mischen Sie durch Pipettieren gut. Inkubieren Sie die Perlenmischung für 5 Minuten und legen Sie die Röhrchen dann auf einen magnetischen Ständer, um die an die Ziel-DNA gebundenen Perlen herunterzuziehen. Warten Sie 5 Minuten und verwerfen Sie dann den Überstand (behalten Sie die Perlen).
      HINWEIS: Dieses Verhältnis von Perlen zu DNA führt zur Bindung von Fragmenten der gewünschten Größe von 250 bp.
   5. Mit den Perlen auf dem Magnetständer 200 μL 80% Ethanol (frisch zubereitet) hinzufügen und 30 s warten. Pipetten Sie die Ethanolwäsche aus und entsorgen Sie sie vorsichtig, ohne die Perlen auf dem Magnetständer zu stören. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   6. Nach dem letzten Waschen Entfernen Sie Spuren von Ethanol von den Perlen und trocknen Sie die Perlen dann für 2 min an der Luft, bis sie glänzend, aber nicht vollständig ausgetrocknet erscheinen. Übertrocknen Sie die Perlen nicht.
   7. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetständer und fügen Sie 17 μL 10 mM Tris-HCl oder 0,1x TE (Low-TE) hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren ~ 10 mal und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 2 min.
   8. Legen Sie die Röhren wieder auf den Magnetständer und warten Sie 5 Minuten. Sobald sich die Perlen niedergelassen haben, übertragen Sie den DNA-Überstand in eine neue Röhre.
7. PCR I zum Hinzufügen von Biotin-Tag zu DNA-Fragmenten, die die Insertionskassette enthalten
   1. Den DNA-Fragmenten, die die Tn5-Insertionskassette enthalten, wird ein biotinylierter Primer-Tag hinzugefügt, indem Sie den Transposon-spezifischen biotinylierten Primer (Tabelle 5) und einen Indexprimer verwenden. Bereiten Sie den PCR-Mastermix gemäß Tabelle 6 vor und befolgen Sie die PCR-Bedingungen für den in Tabelle 7aufgeführten Thermocycler .
8. Bereinigung der PCR I ohne Größenauswahl
   1. Vortex 0,9x Perlen und legen Sie sie vor der Reinigung für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur.
   2. Fügen Sie den PCR-Produkten 0,9-fache Perlen hinzu und mischen Sie sie gründlich.
   3. Legen Sie die Perlen auf einen magnetischen Ständer, um die Perlen herunterzuziehen.
   4. Entfernen Sie den klaren Überstand und waschen Sie die perlengebundene DNA zweimal mit 200 μL frisch zubereitetem 80% Ethanol.
   5. Entfernen Sie das Ethanol nach den Waschschritten und trocknen Sie die Perlen an der Luft, bis sie glänzend, aber nicht zu trocken aussehen.
   6. Fügen Sie 32 μL 10 mM Tris-HCl oder 0,1X TE (Low-TE) hinzu und inkubieren Sie die Perlen für 5 min. Legen Sie die Mischung wieder auf den Magnetständer und übertragen Sie den Überstand in ein frisches Mikrofugenröhrchen.
9. Bindung biotinylierter DNA-Fragmente an Streptavidin-Perlen
   1. 32 μL Streptavidin-Perlen in 1x Bind-and-Wash-Puffer resuspendieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit dem Puffer, während Sie sie auf einen magnetischen Ständer stellen.
   2. Fügen Sie 32 μL 2x Bind-and-Wash-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Perlen. Hinzu kommen 32 μL der gereinigten PCR 1 Produkte. Gründlich mischen und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
   3. Legen Sie die Perlen-DNA-Mischung für 2 min auf einen magnetischen Ständer. Pipette den Überstand als Biotin-markierte DNA, die den Insertionsrand enthält, an Streptavidin auf den Perlen bindet.
   4. Waschen Sie die Perlen mit 500 μL 1x Bind-and-Wash-Puffer und waschen Sie die Perlen dann mit 200 μL Low-TE. Resuspendieren Sie die DNA-gebundenen Perlen in 17 μL Low-TE.
10. PCR II zum Hinzufügen von Adaptern zu den Fragmenten, die die Einfügekassettenkante enthalten
    1. Bereiten Sie einen Mastermix vor, wie in Tabelle 8dargestellt, indem Sie die in Tabelle 5aufgeführten Indexprimer und modifizierten universellen PCR-Primer verwenden. 15 μL der DNA-gebundenen Streptavidin-Perlen aus dem vorherigen Schritt werden in den PCR-Mix geben. Siehe Tabelle 7 für die thermischen Cycler-Bedingungen.
11. Bereinigen Sie die PCR-Produkte ohne Größenauswahl gemäß Schritt 6.8 dieses Protokolls. Eluierten die endgültigen DNA-Produkte in 30 μL molekularem Wasser.
12. Lagern Sie die Proben bei -20 °C und verwenden Sie sie für die Sequenzierung.

7. Sequenzierung und Analyse

1. Sequenzieren Sie die Bibliothek mithilfe der Sequenzierungstechnologie mit hohem Durchsatz. Passen Sie die Sequenzierungstiefe in Abhängigkeit von der Größe der Transposon-Bibliothek an, wie unten angegeben. Bewerten Sie die Lesequalität mit FastQC⁷. Wählen Sie Lesevorgänge mit der Tn5-Einfügekante am 5'-Ende des Leses aus und entfernen Sie die Einfügekantensequenz mit Cutadapt⁸ und/oder Trimmomatic⁹.
   HINWEIS: Hier wurde ein Paired-End-Sequenzierungsansatz verwendet, um 150 bp pro Lesewert und insgesamt 8 Mio Lesevorgänge anzuvisieren. Um einen repräsentativen Datensatz zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der sequenzierten Lesevorgänge die maximal mögliche Anzahl von Mutanten in der Bibliothek überschreitet, d. H. Die geschätzte Gesamtzahl der Kolonien aus Schritt 2.9. Als Referenz zielte dieses Protokoll auf das 40-fache der maximal möglichen Bibliotheksgröße ab. Andere erfolgreiche Studien, die Tn-seq für einen ähnlichen Zweck^verwendeten,sequenzierten eine Gesamtzahl von Lesevorgängen, die fast dem 25-fachen der tatsächlichen Anzahl eindeutiger Insertionen in der entsprechenden Mutantenbibliothek^{nahe 22},^{23 entsprachen.}
2. In Anbetracht der Berücksichtigung der Art und Leistung, dass Mutationen an den Enden von Genen nicht funktionell störend sind, schneiden Sie 5% von beiden Enden der Genannotationen der GFF-Referenzgenomdatei ab. Ordnen Sie die getrimmten Lesevorgänge mit Bowtie2^{10 dem Referenzgenom zu.}
3. Berechnen Sie die Anzahl der Einfügungen aus der Anzahl der eindeutigen 5'-Positionen in der Ausrichtungs-BAM-Datei.
4. Rufen Sie mit FeatureCounts¹¹die Anzahl der Treffergene für jede replizierte Probe ab.
5. Berechnen Sie mit dem DESeq2^12-Paket in RStudio den Unterschied in den Mutantenhäufigkeiten zwischen verschiedenen Bedingungen.

Wirtsassoziierte Bakterien können mehrere Faktoren verwenden, um eine Assoziation herzustellen, einschließlich solcher, die Adhäsion, Motilität, Chemotaxis, Stressreaktionen oder bestimmte Transporter vermitteln. Während für mehrere Bakterien wichtige Faktoren für Pathogen-Wirt-Interaktionen berichtet wurden13,14,15,16,17,18, einschließlich Mitglieder der Gattung Burkholderia19,20, haben weniger Studien die molekularen Mechanismenuntersucht,die von nützlichen Symbionten für die Besiedlung verwendet werden21,22,23 . Ziel war es, mittels Transposon-Insertionssequenzierung molekulare Faktoren zu identifizieren, die es B. gladioli ermöglichen, L. villosa-Käfer zu besiedeln.

Die Transposon-vermittelte Mutagenese wurde mit dem pRL27-Plasmid durchgeführt, das ein Tn5-Transposon und eine Kanamycin-Resistenzkassette trägt, die von invertierten Wiederholungsstellen flankiert wird. Das Plasmid wurde durch Konjugation mit dem Plasmiddonor E. coli WM3064-Stamm in die Zielzellen B. gladioli Lv-StA eingebracht (siehe Abbildung 1). Nach der Konjugation wurde die Konjugationsmischung, die B. gladioli-Empfänger- und E. coli-Spenderzellen enthielt, auf selektiven Agarplatten mit Kanamycin plattiert. Das Fehlen von DAP auf den Platten eliminierte die Spender-E. coli-Zellen und das Vorhandensein von Kanamycin, das für erfolgreiche B. gladioli Lv-StA-Transkonjugantien ausgewählt wurde. Die gepoolte B. gladioli Lv-StA-Mutantenbibliothek, die aus der Ernte der 100.000 transkonjuganten Kolonien gewonnen wurde, wurde mit einem modifizierten DNA-Bibliotheksvorbereitungskit und benutzerdefinierten Primern für die Sequenzierung vorbereitet. Abbildung 2 zeigt die Vorbereitungsschritte der DNA-Bibliothek. Die Sequenzierung ergab 4 Mio gepaarte Lesevorgänge; 3.736 Gene von 7.468 Genen in B. gladioli Lv-StA waren gestört.

Um Mutanten zu identifizieren, die im Wirt besiedelt waren, wurde die B. gladioli Lv-StA Mutantenbibliothek auf den Käfereiern infiziert und in vitro in KB-Medium als Kontrolle gezüchtet. Die In-vivo-Kolonisationsengpassgröße wurde vor dem Experiment berechnet. Eine bekannte Anzahl von B. gladioli Lv-StA-Zellen wurde auf Käfereiern infiziert, und die Anzahl der kolonisierenden Zellen in frisch geschlüpften ersten Instar-Larven wurde durch Plattieren einer Suspension von jeder Larve und Zählen koloniebildender Einheiten pro Individuum erhalten. Diese Berechnungen wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Anzahl der kolonisierenden Zellen ausreicht, um alle oder einen hohen Prozentsatz der Mutanten in der Bibliothek auf ihre Fähigkeit, den Wirt zu besiedeln, zu bewerten. Darüber hinaus wurde die Wachstumszeit zwischen In-vitro- und In-vivo-Bedingungen basierend auf der Anzahl der Bakteriengenerationen normalisiert, um diese Proben vergleichbar zu machen.

Nach dem Schlüpfen der Eier wurden 1.296 Larven in 13 Becken gesammelt. Die entsprechenden in vitro Mutiertenkulturen wurden gezüchtet und als Glycerinvorräte gelagert. DNA der in vivo und in vitro gewachsenen Mutantenbibliotheken wurde extrahiert und in einem Ultraschallgerät fragmentiert. Abbildung 3 zeigt die Größenverteilung der gescherten DNA, wobei die Mehrheit der Fragmente erwartungsgemäß zwischen 100 und 400 bp liegt. Diesem Schritt folgte das modifizierte DNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die Sequenzierung. Bei jedem Schritt des Protokolls wurde die Konzentration der verbleibenden DNA überprüft, um sicherzustellen, dass die Schritte korrekt durchgeführt wurden und um DNA-Verluste zu verfolgen. Eine Qualitätsprüfung (siehe Materialtabelle)vor der Sequenzierung ergab, dass die DNA-Bibliotheken unerwartet große (>800 bp) DNA-Fragmente enthielten, was in den In-vivo-Bibliotheken ausgeprägter war. Angesichts der Schwierigkeit, die Clusterung von Fragmenten in den Sequenzierungsspuren zu optimieren, war es notwendig, die Sequenzierungstiefe in den In-vivo-Bibliotheken auf 10 Mio gepaarte Lesevorgänge zu erhöhen, um die gewünschte Anzahl von Lesevorgängen zu erreichen. Die Analyse der Sequenzierungsergebnisse ergab, dass durchschnittlich 4 Mio. Lesevorgänge in den In-vivo-Bibliotheken und 3,1 Mio. Lesevorgänge in den In-vitro-Bibliotheken die Transposon-Kante am 5'-Ende von Read-1 (Tabelle 9) enthielten, was für dieses Experiment zufriedenstellend war. Die Verteilung der 24.224 eindeutigen Insertionen über das B. gladioli-Genom in der ursprünglichen Bibliothek ist in Abbildung 4 dargestellt. Eine mit DESeq2 durchgeführte Analyse ergab, dass die Häufigkeiten von 271 Mutanten zwischen den In-vivo- und In-vitro-Bedingungen signifikant unterschiedlich waren.

Abbildung 3: Agarosegele einer Mutante und DNA-Bibliotheken. (A) Agarosegel mit unerhörter DNA einer Mutante in Bahn x und einer 1 kbp Leiter für die Skalierung. (B) Gel mit gescherter DNA-Bibliothek. Die Bandgrößen der Leiter in der ersten Spur sind auf der linken Seite angegeben. Die ersten drei Bahnen a, b und c enthalten gescherte DNA-Fragmente der in vivoBibliotheken. Die Bahnen d, e, f und g enthalten gescherte DNA-Fragmente der In-vitro-Bibliotheken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Lage der eindeutigen Insertionsstellen in der ursprünglichen Bibliothek über die vier Replikone im Burkholderia gladioli Lv-StA-Genom. Jeder Balken entlang der x-Achse befindet sich an einer Einfügestelle. Die Höhe eines Balkens entlang der y-Achse entspricht der Anzahl der Lesevorgänge, die dieser Site zugeordnet sind. Beachten Sie, dass die beiden Chromosomen und zwei Plasmide in voller Länge dargestellt sind und somit unterschiedliche Skalen auf der x-Achse aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Medienkomponenten.

Tabelle 2: Primer zur Bestätigung des Konjugationserfolgs.

Tabelle 3: PCR-Master-Mix zur Bestätigung des Konjugationserfolgs. Abkürzungen: HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; dNTPs = Desoxynukleosidtriphosphat.

Tabelle 4: PCR-Bedingungen zur Bestätigung des Konjugationserfolgs.

Tabelle 5: Primer und Adapter für PCR I und II während der DNA-Bibliotheksvorbereitung.

Tabelle 6: DNA-Bibliotheksvorbereitung -PCR I Master-Mix.

Tabelle 7: DNA-Bibliotheksvorbereitung -PCR I und II Bedingungen.

Tabelle 8: DNA-Bibliotheksvorbereitung -PCR II-Master-Mix.

Tabelle 9: Zusammenfassung der Sequenzierungsausgabe und der Transposon-Einfügefrequenz pro Bibliothek. Abkürzung: PE = paired-end.

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Studie haben.