Open-Source-Toolkit: Benchtop-Kohlefaser-Mikroelektroden-Array für Nervenaufzeichnung

Ein Großteil der neurowissenschaftlichen Forschung beruht auf der Aufzeichnung neuronaler Signale mittels Elektrophysiologie (ePhys). Diese neuronalen Signale sind entscheidend für das Verständnis der Funktionen neuronaler Netze und neuartiger medizinischer Behandlungen wie Gehirnmaschine und periphere Nervenschnittstellen1,2,3,4,5,6. Die Forschung rund um periphere Nerven erfordert maßgeschneiderte oder kommerziell erhältliche neuronale Aufzeichnungselektroden. Neuronale Aufzeichnungselektroden - einzigartige Werkzeuge mit Mikrometerabmessungen und zerbrechlichen Materialien - erfordern einen speziellen Satz von Fähigkeiten und Geräten für die Herstellung. Eine Vielzahl von spezialisierten Sonden wurde für spezifische Endanwendungen entwickelt; Dies bedeutet jedoch, dass Experimente um derzeit verfügbare kommerzielle Sonden herum entworfen werden müssen, oder ein Labor muss in die Entwicklung einer spezialisierten Sonde investieren, was ein langwieriger Prozess ist. Aufgrund der großen Vielfalt der neuronalen Forschung im peripheren Nerv besteht eine hohe Nachfrage nach einer vielseitigen ePhys-Sonde4,7,8. Eine ideale ePhys-Sonde würde eine kleine Aufnahmestelle, eine niedrige ^Impedanz9 und einen finanziell realistischen Preispunkt für die Implementierung in einem System ^aufweisen3.

Aktuelle kommerzielle Elektroden neigen dazu, entweder extraneurale oder Manschettenelektroden (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11) zu sein, die außerhalb des Nervs sitzen, oder intrafaszikulär, die in den Nerv eindringen und innerhalb des Faszikels von Interesse sitzen. Da manschettenelektroden jedoch weiter von den Fasern entfernt sitzen, nehmen sie mehr Lärm von nahe gelegenen Muskeln und anderen Faszikeln auf, die möglicherweise nicht das Ziel sind. Diese Sonden neigen auch dazu, den Nerv einzuengen, was zu Biofouling - einer Ansammlung von Gliazellen und Narbengewebe - an der Elektrodenschnittstelle führen kann, während das Gewebe heilt. Intrafaszikuläre Elektroden (wie ^LIFE12, ^TIME13 und Utah ^Arrays14) bieten den Vorteil der Faszikelselektivität und haben ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, was bei der Unterscheidung von Signalen für die Maschinenschnittstelle wichtig ist. Diese Sonden haben jedoch Probleme mit der Biokompatibilität, wobei sich die Nerven im Laufe der Zeit verformen3,15,16. Wenn sie kommerziell gekauft werden, haben beide Sonden statische Designs ohne Option für eine experimentspezifische Anpassung und sind für neuere Labore kostspielig.

Als Reaktion auf die hohen Kosten und Biokompatibilitätsprobleme anderer Sonden können Kohlefaserelektroden neurowissenschaftlichen Labors die Möglichkeit bieten, ihre eigenen Sonden zu bauen, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Kohlefasern sind ein alternatives Aufnahmematerial mit einem kleinen Formfaktor, der eine geringe Beschädigung ermöglicht. Kohlefasern bieten eine bessere Biokompatibilität und eine wesentlich geringere Narbenreaktion als Silizium17,18,19 ohne die intensive Reinraumverarbeitung5,13,14. Carbonfasern sind flexibel, langlebig, lassen sich leicht in andere Biomaterialien ^{integrieren19} und können von ^Nerve7,20 durchdringen und aufzeichnen. Trotz der vielen Vorteile von Carbonfasern empfinden viele Labore die manuelle Herstellung dieser Arrays als mühsam. Einige ^Gruppen21 kombinieren Kohlenstofffasern zu Bündeln, die zusammen zu einem größeren Durchmesser (~200 μm) führen; Unseres Wissens wurden diese Bündel jedoch nicht in Nerven verifiziert. Andere haben individuierte Kohlefaser-Elektrodenarrays hergestellt, obwohl ihre Methoden reinraumgefertigte Kohlefaserführungen22,23,24 und Geräte zum Bestücken ihrer Arrays erfordern17,23,24. Um dies zu beheben, schlagen wir eine Methode zur Herstellung eines Kohlefaser-Arrays vor, das auf dem Labortisch durchgeführt werden kann und spontane Modifikationen ermöglicht. Das resultierende Array behält individuierte Elektrodenspitzen ohne spezielle Faserbesiedlungswerkzeuge bei. Zusätzlich werden mehrere Geometrien vorgestellt, um den Anforderungen des Forschungsexperiments gerecht zu werden. Aufbauend auf früheren Arbeiten8,17,22,25 bietet dieses Dokument detaillierte Methoden zum manuellen Erstellen und Ändern verschiedener Array-Stile mit minimalem Reinraumschulungszeit.

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan genehmigt.

1. Auswahl eines Kohlefaser-Arrays

1. Wählen Sie eine Leiterplatte (PCB) aus einem der drei in Abbildung 1 dargestellten Designs aus.
   HINWEIS: Für dieses Protokoll stehen Flex Arrays im Mittelpunkt.
   1. Beziehen Sie sich auf PCB-Designs auf der Website des Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), kostenlos und bereit, an eine PCB-Druckerei gesendet und zum Drucken bestellt zu werden.
   2. In Tabelle 1 finden Sie eine Zusammenfassung der Steckverbinder für jede Platine und deren Spezifikationen, um bei der Auswahl des Steckverbinders zu helfen, der für den spezifischen Versuchsaufbau geeignet ist.

2. Löten des Steckers auf die Leiterplatte

1. Stellen Sie einen Lötkolben auf 315 °C (600 °F) ein.
2. Tragen Sie das Flussmittel auf alle Lötpads auf der Leiterplatte auf.
   HINWEIS: Das Flussmittel in einem Röhrchen kann über die Pads gequetscht werden, während das Flussmittel in einem Topf mit dem Holzende eines Applikators mit Baumwollspitze aufgetragen werden kann, indem der Fluss über alle Pads großzügig verschmiert wird.
3. Bilden Sie kleine Lothügel auf den hinteren Pads des Flex Array (Abbildung 2A).
4. Löten Sie die untere Reihe der Anschlussstifte mit der hinteren Reihe der Lötpads (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Alle vom Chestek-Labor bereitgestellten Platinendesigns wurden so konzipiert, dass die Steckverbinder genau mit der dafür vorgesehenen Platine gekoppelt werden.
   1. Um dies zu tun, löten Sie die Stifte auf beiden Seiten des Steckers mit einfachem Zugang zu den Löthügeln. Sobald sie gesichert sind, drücken Sie die Lötkolbenspitze vorsichtig zwischen die vorderen Stifte, um die verbleibenden Verbindungen auf der Rückseite zu löten.
      HINWEIS: Sobald die hintere Reihe der Stifte gesichert ist, richtet sich der Rest des Steckers an jedem Stift über dem zugewiesenen Lötpad aus.
5. Löten Sie die vordere Reihe der Stifte auf die Platine, indem Sie eine kleine Menge Lot auf jeden Stift auftragen. Tragen Sie eine zusätzliche Flussmittelschicht auf, wenn das Löten nicht schnell erfolgt.
   1. Überschüssiges Flussmittel mit 100% Isopropylalkohol (IPA) und einer kurzen Borstenbürste entfernen.
6. Verkapseln Sie die gelöteten Verbindungen in verzögert eingestelltem Epoxidharz (Abbildung 2 C, D) mit einer 23 G Nadel und einer 1 ml Spritze, die mit der Abgeschrägten Seite nach unten auf den Stiften platziert sind. Drücken Sie Epoxidharz langsam durch die Spritze, so dass es in und entlang der Verbindungen fließt.
   1. Lassen Sie das Board über Nacht stehen, damit das verzögert eingestellte Epoxidharz aushärten kann.
      HINWEIS: Während der Produkteinsatz für das verzögert eingestellte Epoxidharz angibt, dass es in 30 minuten aushärtet, ermöglicht das Verlassen über Nacht eine stabilere Verbindung.
7. Befestigen Sie die Rückseite der Platine an den Seiten des Steckverbinders, indem Sie eine kleine Linie verzögert gesetztem Epoxidharz über die Rückseite der Platine legen und diese auf die Kanten des Steckverbinders ziehen.
   1. Lassen Sie das Brett über Nacht wieder aushärten.
      HINWEIS: Speichern Sie an dieser Stelle entweder die Arrays oder setzen Sie den Build fort. Wenn Sie im Build pausieren, lagern Sie die Arrays in einer sauberen, trockenen Box bei Raumtemperatur.

3. Faserpopulation

1. Schneiden Sie eine gezogene Glaskapillare so aus, dass ihre Spitze zwischen die Spuren des Arrays passt (Abbildung 3A).
   1. Stellen Sie mit einem Glasabzieher und einem Filament Kapillaren mit den folgenden Einstellungen her: Wärme = 900, Zug = 70, Geschwindigkeit = 35, Zeit = 200, Druck = 900.
      HINWEIS: Die Nummern sind einheitslos und spezifisch für dieses Gerät (siehe Materialtabelle).
2. Verwenden Sie die Holzenden von zwei Applikatoren mit Baumwollspitze (einer pro Teil Silberepoxidharz), um ein kleines, ~ 1: 1-Verhältnis von Silberepoxidharz in einer Plastikschale zu schöpfen und mit den gleichen Stöcken zu mischen, die zum Schöpfen verwendet wurden. Entsorgen Sie die Applikatoren nach dem Mischen.
3. Schneiden Sie 2-4 mm vom Ende des Kohlefaserbündels mit einer Rasierklinge auf ein Stück Druckerpapier. Um die Fasern im Bündel, die schwer auseinander zu ziehen sind, leicht zu trennen, ziehen Sie ein laminiertes Stück Papier vorsichtig über die Oberseite des Bündels.
   HINWEIS: Das laminierte Stück Papier überträgt statische Aufladung in die Fasern, die sich von selbst trennen.
4. Tragen Sie Silberepoxidharz zwischen jedem zweiten Leiterbahnpaar auf einer Seite der Platte mit der Glaskapillare auf (Abbildung 3B).
   1. Nehmen Sie einen kleinen Tropfen Epoxidharz auf das Ende einer gezogenen Kapillare. Tragen Sie vorsichtig zwischen jeder anderen Spur auf das Ende der Platine auf und füllen Sie die Lücke.
      HINWEIS: Die Lücke sollte bis zum Oberen der beiden Leiterbahnen gefüllt werden, ohne zu überlaufen, um benachbarte Leiterbahnen zu berühren. Jede Ablaufverfolgung ist mit einem Kanal verbunden. Diese Methode der Epoxidpopulation bedeutet, dass jede Faser zwei Kanäle hat, die mit ihr verbunden sind. Dies liegt daran, dass zwei Leiterbahnen eine bessere Faserausrichtung ermöglichen und Redundanz im Kanal dazu beiträgt, die elektrische Verbindung sicherzustellen.
5. Verwenden Sie eine Teflon-beschichtete Pinzette, um eine Kohlefaser in jede Epoxidspur zu legen (Abbildung 3C).
6. Verwenden Sie eine sauber gezogene Kapillare, um die Kohlefasern so einzustellen, dass sie senkrecht zum Ende der Flex Array-Platine stehen und unter dem Epoxidharz vergraben sind (Abbildung 3D).
7. Platzieren Sie die Arrays auf einem Holzblock mit faserigen Enden, die über die Kante des Blocks hinausragen.
   HINWEIS: Das Gewicht des Back-Ends hält das Array auf dem Block.
8. Den Holzblock und die Arrays bei 140 °C für 20 min backen, um das Silberepoxid zu härten und die Fasern einzurasten.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.8 für die andere Seite der Platine.
   HINWEIS: Arrays können nach jedem Backschritt gespeichert werden. Statische Aus den Aufbewahrungsboxen können jedoch dazu führen, dass sich die Fasern von der Platine entfernen, wenn beim Befüllen der Platine zu wenig Silberepoxidharz aufgetragen wurde.
   1. Erstellen Sie eine erhöhte Klebeplattform innerhalb einer Box, so dass der Großteil der Platte an den Klebstoff geklebt werden kann, so dass die faserigen Enden der Platte in der Box aufgehängt werden können, um Faserbruch zu verhindern. Bei Raumtemperatur lagern.
      HINWEIS: Wenn sich die Fasern während der Lagerung von der Platine lösen, kratzen Sie das Epoxidharz mit einer sauber gezogenen Glaskapillare aus den Leiterbahnen und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8, um die Fasern zu ersetzen. Ab diesem Zeitpunkt müssen Arrays mit den auf diese Weise suspendierten Fasern gelagert werden, um einen Faserbruch zu verhindern.

4. Auftragen von ultraviolettem (UV) Epoxidharz zur Isolierung der Kohlefasern

1. Verwenden Sie eine saubere Kapillare und tragen Sie einen kleinen Tropfen (~ 0,5 mm Durchmesser von UV-Epoxidharz) auf die freiliegenden Spuren auf einer Seite der Platte auf (Abbildung 4A). Fügen Sie weiterhin UV-Epoxidtröpfchen hinzu, bis die Spuren vollständig bedeckt sind.
   HINWEIS: Lassen Sie das UV-Epoxid nicht über das Ende der Leiterplatte hinaus auf die Kohlefasern gelangen, um später ein reibungsloses Einsetzen zu gewährleisten.
2. Härten Sie das UV-Epoxidharz unter UV-Penlicht für 2 min aus (Abbildung 4B).
3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.2 für die andere Seite der Platine.
4. Schneiden Sie die Fasern mit einem Stereoskop-Absehen und einer chirurgischen Schere auf 1 mm.
   HINWEIS: Arrays können an dieser Stelle gespeichert werden, bis Sie mit den nächsten Schritten fortfahren können. Sie sollten in einer Box aufbewahrt werden, die die Kohlefasern von der Box selbst entfernt. Arrays können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden.

5. Überprüfen elektrischer Verbindungen mit 1 kHz Impedanzscans (Abbildung 5)

1. Kohlefasern 1 mm in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) tauchen.
2. Um den Kreislauf zu vervollständigen, verwenden Sie ein Silber-Silber-Chlorid (Ag| AgCl) Referenzelektrode und ein Edelstahlstab (Gegenelektrode).
   1. Hängen Sie die Ag| mit einer Becherklemme auf AgCl-Elektrode in der 1x PBS und verbinden Sie sie mit der Referenz des verwendeten Impedanzsystems.
   2. Hängen Sie mit einer Becherklemme den Edelstahlstab in die 1x PBS und verbinden Sie ihn mit dem Gegenelektrodeneingang des verwendeten Impedanzsystems.
3. Führen Sie einen 1 kHz-Impedanzscan für jede Faser mit einem Potentiostaten durch, der auf eine 1 kHz-Scanfrequenz bei 0,01 _Vrms in einer einzigen Sinuswellenform eingestellt ist. Stellen Sie den Potentiostaten zu Beginn jedes Scans für 5 s auf 0 V, um das aufgezeichnete Signal zu stabilisieren. Zeichnen Sie die Messungen über die potentiostat-zugehörige Software auf.
   HINWEIS: Messungen können an jeder Stelle des Builds durchgeführt werden. Sie sind jedoch nur vor der Isolierung und während der Spitzenvorbereitung notwendig. Tabelle 2 listet typische Impedanzbereiche nach jedem Build-Schritt bei 1 kHz als Referenz des Benutzers auf.
4. Spülen Sie die Fasern in entionisiertem (DI) Wasser ab, indem Sie sie dreimal in ein kleines Becherglas tauchen und bei Raumtemperatur trocknen lassen.
   HINWEIS: Arrays können im Speicher belassen werden, bis der Benutzer mit dem nächsten Schritt fortfahren kann.

6. Parylen c Isolierung

HINWEIS: Parylen c wurde als Isolationsmaterial für die Kohlefasern gewählt, da es bei Raumtemperatur über Chargen von Arrays abgeschieden werden kann und eine hochgradig konforme Beschichtung bietet.

1. Maskieren Sie den Flex Array-Anschluss mit dem Gegenstecker.
2. Legen Sie eine Charge von 8-12 Arrays in eine Aufbewahrungsbox mit einer erhöhten Klebeplattform, so dass sie in einem Durchlauf isoliert werden können. Platzieren Sie die Arrays so, dass sich das Steckerende des Arrays auf der Klebeplattform befindet, wobei das faserige Ende des Arrays überhängt ist (Abbildung 6), um zu verhindern, dass die Fasern am Klebstoff haften bleiben und abziehen, und um eine gleichmäßige Parylene-Beschichtung auf den Fasern zu gewährleisten.
3. Beschichten Sie die Arrays in einem Parylene C-Abscheidungssystem bis zu einer Dicke von 800 nm in einem Reinraum und tragen Sie dabei eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie sie durch den einzelnen verwendeten Reinraum definiert wird.
   HINWEIS: Hier wurde PSA als Reinraumschuhe, Anzug, Kopfbedeckung, Schutzbrille, Maske und Latexhandschuhe definiert. Es ist zu beachten, dass dies eine Standard-PSA für das Betreten eines Reinraums ist. Dieser Schritt kann gegen eine Gebühr an ein Parylene-Beschichtungsunternehmen ausgelagert werden. Ein kommerzieller Dienst kann jedoch in der Lage sein, mehrere Arrays gleichzeitig zu beschichten. Jedes Parylene C-Abscheidungssystem kann unterschiedliche Sicherheitsvorkehrungen haben. Wenden Sie sich vor der Verwendung an den Techniker, um die Sicherheit des Benutzers zu gewährleisten.
4. Entfernen Sie den als Maske verwendeten Gegenstecker aus dem Flex Array.
5. Legen Sie die Arrays zur Aufbewahrung in eine neue Box, bis sie einsatzbereit sind.

7. Methoden zur Zubereitung von Trinkgeldern

HINWEIS: Zwei Spitzenpräparate in diesem Abschnitt verwenden Laser zum Schneiden von Fasern. Die richtige PSA, wie z. B. eine Schutzbrille, die gegen die verwendeten Wellenlängen beständig ist, sollte bei der Verwendung des Lasers immer getragen werden, und andere Laborbenutzer in der Nähe des Lasers sollten sich ebenfalls in PSA befinden. Obwohl die in diesen Schritten aufgeführten Faserlängen empfohlene Längen sind, können Benutzer jede Länge ausprobieren, die ihren Bedürfnissen entspricht. Der Anwender muss eine der folgenden Spitzenvorbereitungsmethoden wählen, da das Scherenschneiden allein nicht ausreicht, um die Elektrode wieder ^{freizulegen25}.

1. Neodym-dotiertes Yttrium-Aluminium-Granat (Nd:YAG) lasergeschnitten
   1. Schneiden Sie die Fasern mit einer chirurgischen Schere auf 550 μm.
   2. Verwenden Sie einen 532nm Nd: YAG gepulsten Laser (5 mJ / Puls, 5 ns Dauer, 900 mW), um 50 μm von der Spitze der Fasern zu schneiden, um den Kohlenstoff unter dem Parylene C wieder freizulegen (normalerweise dauert 2-3 Impulse).
      1. Richten Sie die Faserspitzen mit dem integrierten Stereoskop aus, das mit diesem Lasersystem geliefert wird.
         HINWEIS: Dieses System ermöglicht es dem Benutzer, ein Fenster (hier 50 μm x 20 μm (Höhe x Breite)) auszurichten, das verwendet wurde, um das Ende der Faser zu umfassen.
      2. Fokussieren Sie das Stereoskop mit 500-facher Vergrößerung auf das Ende der Faser für einen genauen und präzisen Schnitt.
         HINWEIS: Parylen C wird leicht (<10 μm) von der Spitze abgetragen und hinterlässt eine stumpfe, zylindrische Spitze.
2. Löhnen schärfen25,26,27
   1. Schneiden Sie die Fasern mit einer chirurgischen Schere auf 300 μm.
   2. Tauchen Sie das Array in eine Schüssel mit entionisiertem Wasser, verbinden Sie es mit der Seite nach unten und befestigen Sie es mit einer kleinen Menge Kitt am Boden der Schüssel.
   3. Verwenden Sie eine Stiftkamera, um die Fasern an der Wasseroberfläche auszurichten, so dass die Fasern nur knapp die Wasseroberfläche berühren.
   4. Stellen Sie eine Butan-Lötlampenflamme auf 3-5 mm ein und lassen Sie sie in einer Hin- und Herbewegung über die Oberseite der Fasern laufen, um die Fasern zu schärfen.
      HINWEIS: Faserspitzen leuchten orange, wenn die Flamme über sie hinweggeht.
   5. Entfernen Sie das Array aus dem Kitt und untersuchen Sie es unter einem Stereoskop auf spitze Spitzen unter 50-facher Vergrößerung.
      HINWEIS: Wenn spitze Spitzen beobachtet werden, ist kein weiteres Löhnen notwendig. Wenn die Spitzen stumpf erscheinen, wiederholen Sie die Schritte 7.2.2-7.2.5.
3. ^{UV-Laserschnitt28}
   HINWEIS: DER UV-Laser kann derzeit nur auf ZIF- (Zero Insertion Force) und Wide Board-Designs verwendet werden, da der große Brennpunkt des verwendeten UV-Lasers größer ist als der Pitch der Flex Array-Kohlefasern.
   1. Schneiden Sie die Kohlefasern mit einer chirurgischen Schere auf 1 mm.
   2. Befestigen Sie einen UV-Laser auf drei orthogonal konfigurierten motorisierten Stufen.
      HINWEIS: Der UV-Laser ist ein Multimode-Indium-Galliumnitrid-Halbleiter (InGaN) mit 1,5 W Ausgangsleistung und 405 nm Wellenlänge.
      1. Stellen Sie sicher, dass der Laser einen kontinuierlichen Strahl für eine schnelle und effektive Ausrichtung und Schneide hat.
   3. Befestigen Sie das Array an Ort und Stelle, um eine ruhige, ebene Ebene der Elektroden zu halten, über die der Laser hinübergehen kann. Stellen Sie sicher, dass das Array in einem angemessenen Abstand vom Laser gehalten wird, damit die Fasern mit dem Brennpunkt des Lasers im Licht sind. Um dies zu tun, stellen Sie dem Laser eine geringere Leistung zur Verfügung und passen Sie den Abstand an, um sich optimal auf die ^fiber28 zu konzentrieren.
   4. Bewegen Sie den UV-Laserfokuspunkt mit einer Geschwindigkeit von 25 μm/s über die Faserebene, um die Fasern auf die gewünschte Länge zu schneiden (hier werden alle Fasern auf 500 μm geschnitten).
      HINWEIS: Fasern emittieren ein helles Licht, bevor sie geschnitten werden. Lagern Sie die Fasern nach der Behandlung, bis sie bereit sind, mit einem leitfähigen Polymer beschichtet zu werden.

8. Poly(3,4-ethylendioxythiophen):p-Toluolsulfonat (PEDOT:pTS) leitfähige Beschichtung zur Senkung der Impedanz

1. Lösungen aus 0,01 M 3,4-Ethylendioxythiophen und 0,1 M Natrium-p-Toluolsulfonat in 50 mL DI-Wasser mischen und über Nacht auf einer Rührplatte (~450 U/min) oder bis keine Partikel mehr in der Lösung beobachtet werden können.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Lösung in einem lichtbeständigen Behälter auf. Kühlen Sie die Lösung nach dem Mischen, um die Lösung bis zu 30 Tage lang nutzbar zu halten.
2. Führen Sie einen 1-kHz-Impedanzscan mit den gleichen Parametern wie zuvor (Schritte 5.2-5.3) in 1x PBS aus. Beachten Sie, welche Fasern eine gute Verbindung haben (<1 MΩ, typischerweise 14-16 von 16 Fasern).
3. Galvanik mit PEDOT:pTS, um die Impedanz der Elektroden zu senken.
   1. Tauchen Sie die Faserspitzen in die PEDOT:pTS-Lösung ein.
   2. Befolgen Sie die schritte in Schritt 5.2, schalten Sie die 1x PBS-Lösung für PEDOT:pTS aus und verkürzen Sie alle Verbindungen zur Platine auf den angelegten Stromkanal.
   3. Tragen Sie 600 pA pro guter Faser für 600 s mit einem Potentiostaten auf.
   4. Schalten Sie die Zelle aus und lassen Sie sie am Ende des Laufs für 5 s ruhen.
4. Entfernen Sie die Fasern aus der Lösung und spülen Sie sie in DI-Wasser ab.
5. Wiederholen Sie die 1-kHz-Impedanzen, um zu überprüfen, ob die Fasern erfolgreich beschichtet wurden (verwenden Sie die gleichen Parameter, die in den Schritten 5.2-5.3 aufgeführt sind).
   HINWEIS: Gute Fasern werden als jede Faser mit einer Impedanz von weniger als 110 kΩ bezeichnet.

9. Verbinden von Masse- und Referenzdrähten

1. Kratzen Sie Parylene C vorsichtig vom Boden ab und verweisen Sie mit einer Pinzette auf das Brett. Kurzieren Sie den Boden und referenzieren Sie vias paarweise auf diesem Board-Design.
   HINWEIS: Masse- und Referenz-Vias befinden sich in der Nähe des Steckverbinders auf dem Flex-Array und sind die vier kleinen goldenen Kreise in der Nähe der Steckverbinder. Benutzer müssen Parylene C nur aus den Vias entfernen, die den Kohlefasern für Messungen am nächsten sind.
2. Schneiden Sie zwei 5 cm lange isolierten Silberdraht mit einer Rasierklinge. Isolieren Sie die Enden der Drähte 2-3 mm von einem Ende, das am Flex Array befestigt werden soll, und ~ 10 mm von den gegenüberliegenden Enden, um eine einfachere Erdung und Referenzierung während der Operation zu ermöglichen.
3. Erhitzen Sie den Lötkolben wieder auf 600 ° F. Tragen Sie eine kleine Menge Flussmittel auf die Vias auf.
4. Stecken Sie einen Draht (2-3 mm freiliegendes Ende) in jedes der ePhys Vias auf der Platine. Tragen Sie die Oberseite der Durchkontaktierungen mit Lot auf (Abbildung 7A). Lassen Sie die Sonde abkühlen, und drehen Sie sie dann um, um eine kleine Menge Lot auf die Rückseite der Via aufzutragen (Abbildung 7A).
5. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere alle freiliegenden Drähte ab, die aus dem hinteren Löthügel herausragen, da dies dazu beiträgt, die bei der Aufnahme beobachteten Geräusche zu reduzieren (Abbildung 7B).
6. Platzieren Sie die Arrays wieder in der Aufbewahrungsbox und biegen Sie die Drähte zurück und weg von der Faser. Befestigen Sie die Drähte auf dem Klebeband, um mögliche Faser-Draht-Wechselwirkungen zu vermeiden (Abbildung 7C).

10. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Rattenkortex wurde verwendet, um die Wirksamkeit der UV-Laser-präparierten Fasern zu testen, da dies zuvor beschrieben ^wurde7,20. Diese Sonden arbeiten aufgrund ihrer ähnlichen Geometrie und Impedanz für Löselampen vorbereitete Fasern im Nerv. Diese Operation wurde mit einer Fülle von Vorsicht durchgeführt, um zu bestätigen, dass der UV-Laser die Reaktion der Elektroden nicht verändert.

1. Betäuben Sie eine erwachsene männliche Long Evans-Ratte mit einer Kombination aus Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Bestätigen Sie die Anästhesie mit einem Zehen-Pinch-Test. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um zu verhindern, dass die Augen der Ratte während der Operation austrocknen.
2. Erstellen Sie eine 2 mm x 2 mm kraniotomie oberhalb des motorischen Kortex der rechten Hemisphäre. Identifizieren Sie die untere linke Ecke der Kraniotomie, indem Sie 1 mm vor dem Bregma und 1 mm lateral der Mittellinie messen.
3. Montieren Sie das Array in ein stereotaktisches Instrument und nullen Sie das stereotaktische Instrument an der Dura, indem Sie die Fasern sanft absenken, bis sie die Oberfläche der Dura berühren. Heben Sie das Array von der Operationsstelle weg und bewegen Sie es zur Seite, bis es zum Einsetzen bereit ist.
4. Resezieren Sie die Dura, indem Sie vorsichtig eine Nadel mit einem Stachelende über die Oberfläche des Gewebes ziehen. Sobald sich ein Teil der Dura zum Gehirn hin öffnet, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Dura weiter wegzuziehen.
5. Führen Sie die Fasern mit einem stereotaktischen Instrument in die Kraniotomie und 1, 2 mm in das Gehirn ein und senken Sie sich langsam von Hand ab.
6. Zeichnen Sie ePhys-Daten für 10 Minuten mit einem ePhys-spezifischen Headstage und Vorverstärker auf.
   1. Stellen Sie den Hochpassfilter des Vorverstärkers so ein, dass er das Signal bei 2,2 Hz, Antialias bei 7,5 kHz und die Probenahme bei 25 kHz verarbeitet.
      HINWEIS: Bei diesen Messungen wird nur spontane Aktivität aufgezeichnet. Es wird kein Stimulus angewendet.
7. Euthanasie
   1. Legen Sie die Ratte unter Isofluran bei 5% unter 1 l/min Sauerstoff, bis die Lebenszeichen aufgehört haben (20-30 min). Bestätigen Sie Euthanasie mit Enthauptung.

11. Spike-Sortierung

1. Verwenden Sie Spike-Sortiersoftware, um die Daten mit zuvor gemeldeten Methoden zu sortieren und zu ^analysieren8.
2. Verwenden Sie einen Hochpassfilter auf allen Kanälen (250 Hz Ecke, Butterworth 4^. Ordnung) und stellen Sie die Wellenformerkennung auf -3,5 × RMS-Schwellenwert.
   1. Verwenden Sie ein Gaußsches Modell, um Cluster und Spitzen mit ähnlichen Eigenschaften zu erstellen. Kombinieren und durchschnittliche Cluster von mindestens 10 Wellenformen, um sie in die weitere Analyse einzubeziehen.
   2. Eliminieren oder löschen Sie alle Wellenformen, die keine Spitzen sind, aus dem Datensatz.
3. Exportieren Sie Daten, sobald alle Kanäle sortiert wurden, und verwenden Sie eine Analysesoftware, um die Wellenformen zu plotten und weiter zu analysieren.

12. Rasterelektronenmikroskopische Bildgebung (REM)

HINWEIS: Dieser Schritt macht Arrays unbrauchbar und sollte nur verwendet werden, um die Ergebnisse der Spitzenbehandlung zu überprüfen, um zu überprüfen, ob die Arrays ordnungsgemäß verarbeitet werden. Dieser Schritt muss nicht ausgeführt werden, um ein erfolgreiches Array zu erstellen. Im Folgenden finden Sie einen allgemeinen Überblick über den SEM-Prozess. Benutzer, die SEM zuvor nicht verwendet haben, sollten jedoch Hilfe von einem geschulten Benutzer erhalten.

1. Schneiden Sie das faserige Ende der Leiterplatte ab und montieren Sie es auf einem mit Kohleband maskierten REM-Stummel. Platzieren Sie die Arrays auf einer kleinen Plattform aus gestapeltem Kohleband (4-5 Schichten), um zu verhindern, dass die Kohlefasern am REM-Stumpf haften bleiben.
2. Beschichten Sie die Arrays mit Gold (100-300 Å) nach den vom Hersteller des Goldsputterbeschichters beschriebenen Verfahren.
3. Um die Spitzenbehandlungseffekte zu untersuchen, bilden Sie die Arrays in einem REM mit einem Arbeitsabstand von 15 mm und einer Strahlstärke von 20 kV ab.
   HINWEIS: Arrays können ohne Sputterbeschichtung unter niedrigem Vakuum abgebildet werden, wie in Abbildung 8D für UV-lasergeschnittene Fasern dargestellt. Für diesen Aufbau wird empfohlen, einen Arbeitsabstand von 11-12 mm und eine Strahlfestigkeit von 4 kV zu haben.

Tipp Validierung: REM-Bilder
Frühere Arbeiten20 zeigten, dass das Schneiden von Scheren zu unzuverlässigen Impedanzen führte, da Parylen c über die Aufnahmestelle gefaltet wurde. Das Scherenschneiden wird hier nur verwendet, um Fasern vor der Verarbeitung mit einem zusätzlichen Finish-Schneidverfahren auf die gewünschte Länge zu schneiden. REM-Bilder der Spitzen wurden verwendet, um die exponierte Kohlenstofflänge und die Spitzengeometrie zu bestimmen (Abbildung 8).

Scissor und Nd:YAG lasergeschnittene Fasern wurden zuvor überprüft17,20. Scherengeschnittene Fasern (Abbildung 8A) weisen inkonsistente Spitzengeometrien auf, wobei Parylen c beim Schneiden über das Ende faltet20. Die lasergeschnittenen Nd:YAG-Fasern bleiben im Bereich, in der Form und der Impedanz der Aufnahmestelle konsistent (Abbildung 8B). Gebläsefaser20 führen zu der größten Elektrodengrößen- und Formvariabilität und einer geschärften Spitze, die das Einsetzen in zähes Gewebe ermöglicht. Im Durchschnitt wurden 140 μm Kohlenstoff erneut belichtet, mit einem glatten Übergangsbereich zwischen der Kohlenstoff- und Parylene C-Isolierung (Abbildung 8C). UV-lasergeschnittene Fasern ähnelten geblästeten Fasern und zeigten 120 μm Kohlenstoff, der von der Spitze aus belichtet wurde (Abbildung 8D). Impedanzen zeigten an, dass entweder die UV-Laser- oder Bläserspitzenschneidmethode für ePhys geeignet sind und praktikable Lösungen für Labore ohne Zugang zu einem Nd:YAG-Laser sind.

TippValidierung: Elektrische Aufzeichnung
Abbildung 9 zeigt die resultierenden Impedanzen aus jeder Vorbereitungsmethode mit Flex Arrays. Die resultierenden Werte liegen in einem geeigneten Bereich für die ePhys-Aufzeichnung. Nd:YAG lasergeschnittene Fasern führten zu der kleinsten Oberfläche, aber den höchsten Impedanzen, selbst mit der PEDOT:pTS-Beschichtung (blanker Kohlenstoff: 4138 ± 110 kΩ; mit PEDOT:pTS: 27 ± 1,15 kΩ; n = 262). Es folgt die inverse Beziehung bei geblästeten (blanker Kohlenstoff: 308 ± 7 kΩ; mit PEDOT:pTS: 16 ± 0,81 kΩ; n = 262) und UV-lasergeschnittenen (blanker Kohlenstoff: 468 ± 85,7 kΩ; mit PEDOT:pTS: 27 ± 2,83 kΩ; n = 7) Fasern, die eine große Oberfläche und niedrige Impedanzen aufweisen. In allen Fällen fallen die PEDOT:pTS-beschichteten Fasern jedoch unter den zuvor festgelegten Schwellenwert von 110 kΩ, um eine gute, niederohmige Elektrode anzuzeigen.

Akute ePhys-Aufnahmen wurden von einer Long Evans-Ratte entnommen, die akut mit einem ZIF-Array mit UV-lasergeschnittenen und PEDOT:pTS-behandelten Fasern implantiert wurde, um die Durchführbarkeit dieser Methode zu demonstrieren. ePhys wurde zuvor mit Scherenschnitt20 und Nd:YAG-17 und Lötlampenbehandelten Fasern7,8 getestet und nachgewiesen und wurde daher in diesem Text nicht erneut validiert. Akute Aufnahmen von vier UV-Laserbehandlungsfasern (2 mm Länge), die gleichzeitig in den motorischen Kortex der Ratte (n = 1) implantiert wurden, sind in Abbildung 10 dargestellt. Drei Einheiten wurden über alle Fasern hinweg gefunden, was darauf hindeutet, dass die Behandlung der Fasern mit dem kostengünstigen UV-Laser anderen Schneidmethoden ähnelt, die es der Kohlefaser ermöglichen, neuronale Einheiten aufzuzeichnen, wie es die SEMs und Impedanzen erwarten würden. Während Kohlefaser-Arrays leicht gebaut und modifiziert werden können, um den Bedürfnissen des Benutzers gerecht zu werden, sollte beachtet werden, dass für einige Builds eine zusätzliche Validierung erforderlich ist (Tabelle 3), während andere für bestimmte Endaufgaben weniger geeignet sind.

Kommerzielle Parylene C
Kommerziell beschichtete Arrays wurden vom Hersteller mit einer Parylene C-Dicke von 710 nm bestimmt, was weit innerhalb des Zielbereichs der Isolierung liegt. Die Arrays wurden für ePhys-Aufnahmen mit der Löselampenspitzenvorbereitung vorbereitet. Impedanzen wurden nach der Erstellung der Spitzen genommen und mit vorhandenen Daten verglichen. Eine geblästorchierte und PEDOT:pTS-beschichtete Sonde hatte eine durchschnittliche Impedanz von 14,5 ± 1,3 kΩ über 16 Fasern. Rem-Bilder wurden von der Spitze und dem Schaft aufgenommen, um die Parylene C-Ablagerung zu vergleichen (Abbildung 11 A, B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung eines kommerziellen Anbieters die erwarteten Impedanzwerte nicht verändert hat, was darauf hindeutet, dass dies eine ebenso praktikable Substitution für die Abscheidung im reinen Raum der Universität sein wird.

Gerätekostenanalyse
Vorausgesetzt, alle Werkzeuge und Schüttgüter (z. B. Epoxidharze, Lot) sind für den Forscher zugänglich, eine Parylene C-Benutzergebühr von 41 US-Dollar und eine Charge von 8 Sonden, betragen die Gesamtmaterialkosten 1168 US-Dollar (146 US-Dollar pro Sonde). Der Personalaufwand (Tabelle 4) beträgt ~25 h für die Charge. Wenn Sie einen substituierten Herstellungsschritt verwenden, variieren die Kosten der Sonden basierend auf den kommerziellen Parylene C-Beschichtungskosten ($ 500-800 angegeben). Die Zeit für die Buildschritte (Tabelle 4) wird der Einfachheit halber für alle Instanzen einer wiederholten Aufgabe gruppiert. Die Bauzeiten für Designs mit einem größeren Raster (Wide Board und ZIF) werden drastisch reduziert, da die manuell intensiven Schritte (z. B. Kohlefaserplatzierung) einfacher und schneller abzuschließen sind.

Abbildung 1: Steckverbinder und zugehörige Leiterplatten. (A) Wide Board mit einem von sechzehn notwendigen Anschlüssen im Einschub (Einschubskala = 5 mm). (B) ZIF und einer von zwei Anschlüssen und einem Gehäuse. (C) Flex Array mit einem 36-poligen Anschluss; Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Löt- und Isolationsschritte für das Flex Array. (A) Verlegen des Lotes für die unteren Anschlussstifte. (B) Hintere Stifte, die an Ort und Stelle befestigt sind, wobei die vorderen Stifte zum Löten bereit sind. (C) Verzögert eingestelltes epoxidisoliertes Flex Array; Beachten Sie, dass das verzögert eingestellte Epoxidharz die Referenz- und Gemahlenen durchkontaktiert auf beiden Seiten nicht abdeckt. (D) Rückseite des Flex Arrays mit einem Band aus verzögert eingestelltem Epoxidharz über die Pad-Vias (nicht die Masse und die Referenz-Vias) und um die Seite der Platine zum Rand des Steckverbinders gewickelt. Mensur = 0,5 cm (B) und 1 cm (A, C, D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Auftragen von Silberepoxidharz und Ausrichten von Kohlefasern zwischen den Leiterbahnen des Flex Array. Kapillaren wurden mit einem weißen Overlay hervorgehoben. (A) Das Ende der Kapillare passt zwischen die Spuren, um (B) sauberes Silberepoxid (gekennzeichnet mit Pfeilen am Ende der Kapillare und innerhalb der Spuren) Ablagerung ohne Spillover außerhalb der Spurenpaare zu erhalten. (C) Kohlefasern werden in das Epoxidharz gegeben und dann (D) mit einer sauberen Kapillare begradigt. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Isolierung mit UV-Epoxid-Anwendung (A) UV-Epoxid wird mit einer sauberen Kapillare und zwei Tropfen UV-Epoxidharz (mit weißen Überlagerungen markiert) aufgetragen. UV-Epoxid wird in Tröpfchen mit einem Durchmesser von 0,25-0,75 mm aufgetragen, bis das UV-Epoxidharz eine glatte Blase über den Spuren bildet. (B) UV-Epoxid wird unter UV-Licht ausgehärtet. Das Flex Array wird in Kitt auf einem Holzblock platziert, um die Bewegung und Ausrichtung unter dem UV-Licht zu erleichtern. Das UV-Licht wird mit einem Halter ~1 cm über dem Ende des Flex Arrays gehalten. Inset (B) zeigt das Seitenprofil eines ordnungsgemäß UV-epoxidisolierten Flex Arrays. Die UV-Epoxidblase auf beiden Seiten der Platte ist etwa 50 μm hoch. Maßstabsbalken = 500 μm (A und Einschub B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Aufbau für Impedanzmessungen. Alle Teile sind beschriftet, und Systemanschlüsse und Adapter sind systemabhängig. PBS wird hervorgehoben, wenn die Lösung später im Build gegen PEDOT:pTS ausgetauscht wird. Ansonsten ist das Setup jedoch identisch. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PEDOT:pTS = Poly(3,4-ethylendioxythiophen):p-Toluolsulfonat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Flex Array für parylene C-Beschichtung vorbereitet. Das Flex Array wird während des Beschichtungsprozesses mit Klebeband an einer erhöhten Schaumstoffplattform mit der Klebeseite nach oben befestigt. Maßstabsleiste =10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Masse- und Referenzdrähte, die an das fertige Flex Array angeschlossen sind. Lötzinn wurde auf jede Seite des Via auf beiden Seiten der Platine (A) aufgebracht, um eine sichere Verbindung zu schaffen. ePhys Vias werden auf dem Board als GND und Ref gekennzeichnet und auf gegenüberliegenden Seiten des Boards miteinander gepaart. Es gibt zwei zusätzliche Vias, die ebenfalls mit GND und Ref2 gekennzeichnet sind. Beide GND-Durchkontaktierungen werden zusammen kurzgeschlossen. Ref2 soll in elektrochemischen Experimenten verwendet werden. Überschüssiger Draht in (A) ist mit einem roten Kasten gekennzeichnet und wird (B) von der Rückseite der Sonde entfernt (rote Box zeigt, wo sich der Draht befand), um die Geräuschreduzierung und die Handhabung der Sonde zu unterstützen. (C) Final Flex Array für die zukünftige Verwendung gespeichert. Beachten Sie, dass die gepaarten GND - und Ref-Vias auf diesem Board es für ePhys-Aufnahmen kennzeichnen. Maßstabsbalken = 200 μm (A, B). Abkürzungen: ePhys = Elektrophysiologie; GND = Boden; Ref = Referenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: REM-Bilder von Fasern mit verschiedenen Spitzenschneidetechniken. (A) Scherengeschnittene Fasern mit sehr wenig freiliegendem Kohlenstoff. (B) Nd: YAG-Laserschnitt. (C) Gebläsefaser mit ~ 140 mm Kohlenstoff, der von der Spitze aus freigelegt wurde. (D) UV-lasergeschnittene Fasern mit ~ 120 mm Kohlenstoff, die von der Spitze aus belichtet werden. Rote Pfeile zeigen den Übergangsbereich zwischen Parylen C und blanker Kohlefaser an. Maßstabsbalken = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Abkürzungen: REM = Rasterelektronenmikroskopisch; Nd:YAG = Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Impedanzunterschiede zwischen der alleinigen Anwendung der Behandlung (blanker Kohlenstoff) und der Zugabe von PEDOT:pTS. In allen Fällen verringert die Zugabe von PEDOT:pTS die Impedanz um eine Größenordnung. Stichprobenumfang: Nd:YAG = 262, Lötlampe = 262, UV = 7. Der Unterschied in der UV-Probengröße ist auf die Neuartigkeit der Herstellungsmethode zurückzuführen. Es zeigt jedoch wie erwartet eine ähnliche Reichweite wie die Löhne. Impedanzdaten werden als Mittelwert ± Standardfehler ausgedrückt. Abkürzungen: PEDOT:pTS = Poly(3,4-ethylendioxythiophen):p-Toluolsulfonat; Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Akute elektrophysiologische Spiking-Daten von vier UV-lasergeschnittenen Elektroden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Kommerzielle Parylene C-beschichtete Arrays. (A) Das geschärfte Array zeigt eine gleichmäßige Schärfung über alle Fasern, was darauf hinweist, dass die kommerzielle Beschichtung keine Nachteile aufweist. (B) Nach dem Löhnen zeigt der Übergang (red box) zwischen blanker Kohlefaser und Parylen c keinen erkennbaren Unterschied zwischen Arrays, die in einer Reinraumanlage beschichtet sind. Maßstabsbalken = 200 μm (A) und 10 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Jede Leiterplatte hat einen anderen Stecker und eine andere Tonhöhe. Abkürzung: PCB = Leiterplatte.

Tabelle 2: Typischer Bereich der Impedanzen nach jeder Build-Phase (n = 272). *n = 16. PEDOT:pTS-behandelte Sonden über 110 kΩ können immer noch Signale aufzeichnen; alle behandelten Elektroden fallen jedoch typischerweise unter diesen Wert. Abkürzungen: PEDOT:pTS = Poly(3,4-ethylendioxythiophen):p-Toluolsulfonat; Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat.

Tabelle 3: Validierte Verwendungen der einzelnen Platten mit den beschriebenen Schneidmethoden. Alle Schneidmethoden beinhalteten die galvanische Abscheidung von PEDOT:pTS. "Nicht lebensfähig" weist darauf hin, dass ein Formfaktor des Designs verhindert, dass diese Spitzenbehandlung zu diesem Zeitpunkt getestet wird (d. H. Faserpech). Abkürzungen: Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat; REM = Rasterelektronenmikroskopie; ePhys = Elektrophysiologie; ZIF = Null Einfügekraft.

Tabelle 4: Zeitaufwand für jeden Schritt eines Fertigungsprozesses. Das Löten des Steckers und der Masse- und Referenzdrähte wurde hier kombiniert, um die Aktivitätsliste zu vereinfachen. Abkürzungen: PEDOT:pTS = Poly(3,4-ethylendioxythiophen):p-Toluolsulfonat; Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.