निकट-यूवी लिथोग्राफी और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी को माइक्रोपैटर्न्ड हाइड्रोजेल पर सेलुलर बलों को मापने के लिए जोड़ा जाता है। एकल कोशिकाओं की लक्षित प्रकाश-प्रेरित रिहाई एक ही नमूने पर माप की एक उच्च संख्या को सक्षम बनाती है।
कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) कोशिका बलों को मापने के लिए मेचानोबायोलॉजी में उपयोग की जाने वाली मुख्य विधि है। आमतौर पर इसका उपयोग फ्लैट नरम सब्सट्रेट्स का पालन करने वाली कोशिकाओं के लिए किया जा रहा है जो सेल कर्षण (2 डी-टीएफएम) के तहत विकृत होते हैं। TFM रैखिक लोचदार सामग्री के उपयोग पर निर्भर करता है, जैसे polydimethylsiloxane (PDMS) या polyacrylamide (PA)। पीए पर 2 डी-टीएफएम के लिए, उच्च थ्रूपुट प्राप्त करने में कठिनाई मुख्य रूप से सेल आकृतियों और कर्षणों की बड़ी परिवर्तनशीलता से परिणाम देती है, मानकीकरण के लिए बुलाती है। हम तेजी से और कुशलता से 2 डी-टीएफएम अध्ययन के लिए micropatterned पीए hydrogels बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। माइक्रोपैटर्न को पहली बार मास्कलेस फोटोलिथोग्राफी द्वारा निकट-यूवी प्रकाश का उपयोग करके बनाया जाता है जहां बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन केवल माइक्रोपैटर्न क्षेत्रों से बंधते हैं, जबकि बाकी सतह कोशिकाओं के लिए गैर-चिपकने वाली रहती है। बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन का माइक्रोपैटर्निंग सक्रिय एल्डिहाइड समूहों की उपस्थिति के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों को समायोजित करने के लिए विभिन्न आकारों के चिपकने वाले क्षेत्र होते हैं। TFM माप के लिए, हम एक्रिलामाइड और bis-acrylamide की मात्रा को अलग-अलग करके और नियमित फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रैक्शन साइटोमेट्री (FTTC) के साथ सेल कर्षण क्षेत्रों के पुनर्निर्माण के लिए एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन को ट्रैक करके विभिन्न लोच के पीए हाइड्रोजेल का उपयोग करते हैं।
सेल बलों की सटीक रिकॉर्डिंग को और अधिक प्राप्त करने के लिए, हम एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों के लिए परिभाषित क्षेत्रों में सेल कर्षण जारी करने के लिए पैटर्न वाले प्रकाश की एक नियंत्रित खुराक के उपयोग का वर्णन करते हैं। हम इस विधि को स्थानीय यूवी रोशनी कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (LUVI-TFM) कहते हैं। एंजाइमेटिक उपचार के साथ, सभी कोशिकाओं को एक साथ नमूने से अलग कर दिया जाता है, जबकि एलयूवीआई-टीएफएम कर्षण के साथ नमूने के विभिन्न क्षेत्रों में कोशिकाओं के बलों को अनुक्रम में दर्ज किया जा सकता है। हम इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का प्रदर्शन करते हैं (i) सब्सट्रेट के लिए नियंत्रित आसंजन के एक समारोह के रूप में सेल कर्षण बलों का अध्ययन करने के लिए, और (ii) एक ही नमूने से प्रयोगात्मक टिप्पणियों की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए।
अपने बाह्य कोशिकीय वातावरण के साथ बातचीत करते समय, अनुयायी कोशिकाएं उन बलों को लागू करती हैं जो मुख्य रूप से इंटीग्रिन-आधारित फोकल आसंजन द्वारा मध्यस्थता की जाती हैं जो एक्टिन साइटोस्केलेटन से एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) को जोड़ती हैं। फोकल आसंजन मल्टीप्रोटीन असेंबली हैं जो फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन जैसे ईसीएम-प्रोटीन के लिए इंटीग्रिन के बंधन के आसपास केंद्रित हैं। इंटीग्रिन क्लस्टरिंग और फोकल आसंजन की वृद्धि न केवल एक यांत्रिक रूप से स्थिर कनेक्शन की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि अन्य फोकल आसंजन प्रोटीन की भर्ती के लिए भी महत्वपूर्ण है, जिसमें वे भी शामिल हैं जो सेलुलर संकुचन के विनियमन के लिए RhoA मार्ग को सक्रिय करते हैं1। एक्टिन साइटोस्केलेटन की RhoA-निर्भर संकुचन कोशिकाओं को अंतर्निहित ईसीएम पर फैलने और माइग्रेट करने की अनुमति देता है, और इसकी कठोरता को समझने के लिए भी। कर्षण बलों का वितरण दृढ़ता से कोशिकाओं के प्रसार क्षेत्र और आकार पर निर्भर करता है, जिनमें से दोनों मैट्रिक्स गुणों पर भरोसा करते हैं और इसलिए साइटोस्केलेटल संगठन को प्रभावित करते हैं, अंततः मैट्रिक्स यांत्रिकी और साइटोस्केलेटल संगठन 3,4 के बीच एक बंद प्रतिक्रिया लूप बनाते हैं।
सतह micropatterning तकनीकों ईसीएम चिपकने वाला प्रोटीन प्रस्तुत माइक्रोन आकार के क्षेत्रों का निर्माण करके सेल आकार के एक परिभाषित नियंत्रण की अनुमति देते हैं; इन क्षेत्रों के आकार के अनुसार, एकल कोशिकाएं, या कोशिकाओं के समूह जो माइक्रोपैटर्न 5 का पालन करते हैं। ईसीएम प्रोटीन को विभिन्न दृष्टिकोणों जैसे माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग, फोटो-पैटर्निंग या लेजर-पैटर्निंग 6 द्वारा ग्लास सब्सट्रेट पर पैटर्न किया जा सकता है। यूवी प्रकाश का उपयोग (π = 185 या 375 एनएम) सतह antifouling रणनीतियों के साथ संयुक्त विभिन्न आकार और आकार डिजाइन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है और सतह किनारों के पास एक उच्च परिशुद्धता के साथ कई प्रोटीन प्रकार के स्थिरीकरण7,8. पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) जैसे प्रोटीन विकर्षक रसायनों के साथ लेपित क्षेत्रों को या तो क्रोमियम फोटोमास्क या डिजिटल मिरर डिवाइस (डीएमडी) -आधारित मास्कलेस लिथोग्राफी सिस्टम के साथ संरक्षित किया जाता है। मास्क में पैटर्न उन क्षेत्रों के यूवी प्रकाश के संपर्क में आने की अनुमति देते हैं जो तब ईसीएम प्रोटीन के साथ पैटर्न किए जाएंगे। ईसीएम प्रोटीन के साथ हाइड्रोजेल सतहों के पैटर्निंग के लिए कांच की सतह से प्रोटीन को हटाने और उन्हें पैटर्न से क्रॉसलिंक करने के लिए एक हस्तांतरण चरण की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, नरम सामग्रियों पर पैटर्निंग को पहले एक विकर्षक प्रोटीन के साथ फोटोमास्क कोटिंग करके प्राप्त किया जा सकता है, इसके बाद गहरी यूवी रोशनी का उपयोग करके अनमास्क किए गए क्षेत्रों को जलाकर। चूंकि गहरी यूवी ओजोन उत्पन्न करती है और प्रोटीन बाइंडिंग के लिए सतह को प्रतिक्रियाशील बनाती है, इसलिए नकाबपोश क्षेत्रों को ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित किया जाता है और अंत में जेल को सीधे अनमास्क किए गए क्षेत्रों के शीर्ष पर पॉलिमराइज़ किया जाता है9,10।
पैटर्न वाले हाइड्रोजेल का उपयोग टीएफएम करने के लिए किया जा सकता है, एक तकनीक जो सेल-सामग्री इंटरफेस 11 पर सेल बलों को मापती है। 2डी-टीएफएम में, एक मोटी बहुलक फिल्म की सपाट सतह का उपयोग करता है, जिसमें मार्कर मोतियों को विरूपण 12,13,14,15 को ट्रैक करने के लिए एम्बेडेड किया गया है। विस्थापन वैक्टर निकालने के लिए, दो छवियों को संयोजित करना आवश्यक है, विकृत राज्य में से एक और विरूपण के बिना एक संदर्भ छवि। दो छवियों को तब छवि प्रसंस्करण के साथ एक दूसरे पर मैप किया जाता है। उच्च मार्कर घनत्व पर, यह आमतौर पर कण छवि वेलोसिमेट्री (PIV) के साथ किया जाता है, जो हाइड्रोडायनामिक प्रवाह के पुनर्निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। कम मार्कर घनत्व और 3 डी-टीएफएम में, यह आमतौर पर पार्टिकल ट्रैकिंग वेलोसिमेट्री (पीटीवी) के साथ किया जाता है, जिसमें प्रयोगात्मक डेटा सेट की विशिष्ट विशेषताएं शामिल हैं। कम्प्यूटेशनल रूप से सस्ता विकल्प का एक उदाहरण ऑप्टिकल प्रवाह है, जैसे कि कनाडे-लुकास-टोमासी (केएलटी) एल्गोरिदम 16। हाइड्रोजेल सब्सट्रेट के मामले में, फ्लोरोसेंट मोतियों को आमतौर पर सामग्री पोलीमराइजेशन के दौरान उच्च घनत्व पर एम्बेडेड किया जाता है, और एंजाइमेटिक टुकड़ी पर सेल रिलीज से पहले और बाद में छवियों को दर्ज किया जाता है। अनुयायी कोशिकाओं की एंजाइमेटिक टुकड़ी, उदाहरण के लिए, ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा, हाइड्रोजेल पर सभी कोशिकाओं से सेलुलर कर्षणों की एक साथ रिहाई की ओर जाता है, जिससे उच्च संख्या में कोशिकाओं से विस्तृत विश्लेषण प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है।
यहां हम सेल आकार और स्थानीयकरण को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोपैटर्न्ड हाइड्रोजेल तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और सब्सट्रेट से व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने के लिए यूवी का उपयोग करके अनुक्रम में कर्षण बलों को कुशलतापूर्वक मापने की एक विधि पेश करते हैं। कर्षण बल माप के लिए, हम दोहरी-स्तरित पीए हाइड्रोजेल का उत्पादन करने के लिए एक तकनीक पेश करते हैं, जहां फ्लोरोसेंट मोती केवल शीर्ष परत में एम्बेडेड होते हैं, जो उनके घनत्व को बढ़ाता है और उनके ऊर्ध्वाधर प्रसार को कम करता है। माइक्रोपैटर्निंग के साथ सेलुलर कर्षण बलों की यूवी-मध्यस्थता रिलीज के संयोजन से सेल टुकड़ी पर स्थानिक नियंत्रण प्राप्त करना संभव हो जाता है (उदाहरण के लिए, ब्याज के क्षेत्र में अन्य कोशिकाओं के आसंजन को प्रभावित किए बिना एकल कोशिकाओं का), बशर्ते कि पैटर्न वाली कोशिकाओं के बीच पर्याप्त दूरी हो। सेलुलर कर्षण को तब 2 डी-टीएफएम के लिए सबसे कुशल और विश्वसनीय विधि का उपयोग करके पुनर्निर्मित किया जाता है, अर्थात्, फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रैक्शन साइटोमेट्री (एफटीटीसी) नियमितीकरण 17,18 के साथ।
इस प्रोटोकॉल में, हम फ्लोरोसेंट मोतियों वाले माइक्रोपैटर्न पीए हाइड्रोजेल की तैयारी का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग टीएफएम अध्ययनों के लिए फिड्यूशियल मार्करों के रूप में किया जाता है। हमारा दृष्टिकोण तीन चरणों पर आधारित है: 1) दोहरी-स्तरित पीए हाइड्रोजेल की तैयारी; 2) ईसीएम प्रोटीन के micropatterning और हाइड्रोजेल सतह पर उनके हस्तांतरण; 3) TFM के लिए पैटर्न के पास यूवी प्रकाश का उपयोग करें। सब्सट्रेट के लिए सेल कर्षण का विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप को फ्लोरोसेंट मोतियों के विस्थापन से संबंधित बलों की गणना करने के लिए ज्ञात कठोरता मूल्यों के साथ रैखिक लोचदार सामग्री के उपयोग की आवश्यकता होती है26। पीए हाइड्रोजेल तैयार करना आसान है, कठोरता को आसानी से ट्यून किया जा सकता है, और वे आमतौर पर कठोरता संवेदन और टीएफएम 18,28 के लिए उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, पूरे हाइड्रोजेल के पुनरुत्पादक पोलीमराइजेशन समय और सजातीय पोलीमराइजेशन प्राप्त करने के लिए, अभिकर्मकों के लिए स्थितियों और समय को संग्रहीत करने पर ध्यान दिया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, एपीएस को अपनी गतिविधि को खोने से बचने के लिए एक डेसिकेटर में रखा जाना चाहिए; TEMED को प्रत्यक्ष प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। ऑक्सीकृत एचईए का उपयोग हाइड्रोजेल सतह पर मैट्रिक्स प्रोटीन के सहसंयोजक बंधन की अनुमति देता है, जो एक पूर्ण और स्थिर प्रोटीन परत के गठन को प्राप्त करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। ऑक्सीकृत HEA समाधान हर बार पीए hydrogels गढ़े जाते हैं ताजा तैयार किया जाना चाहिए. दोहरी स्तरित पीए हाइड्रोजेल तीन मुख्य लाभ प्रदान करता है: 1) यह जेल को बेहद पतला बनाने की आवश्यकता के बिना हाइड्रोजेल सतह के पास फिड्यूशियल मोतियों का एक समरूप वितरण प्राप्त करने का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है (यानी, <20 μm)। हाइड्रोजेल मोटाई पर नियंत्रण टीएफएम के साथ सटीक माप प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब लोचदार सब्सट्रेट बहुत पतला होता है, तो फाइब्रोब्लास्ट जैसी मजबूत अनुयायी कोशिकाएं अंतर्निहित कठोर ग्लास सब्सट्रेट 29,30 को समझ सकती हैं और यांत्रिक रूप से प्रतिक्रिया कर सकती हैं। मोटी हाइड्रोजेल बल पुनर्निर्माण के लिए छवि अधिग्रहण को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इसके अलावा, कई माइक्रोस्कोप में उन्हें समायोजित करने के लिए पर्याप्त स्थान नहीं होगा, हाइड्रोजेल को संलग्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लास सब्सट्रेट की अतिरिक्त मोटाई पर विचार करते हुए, जब तक कि अल्ट्राथिन माइक्रोस्कोपी स्लाइड का उपयोग नहीं किया जाता है। 2) दोहरी स्तरित पीए हाइड्रोजेल में, पीए हाइड्रोजेल की सतह के पास फिड्यूशियल मोतियों का समरूप वितरण एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग किए बिना प्राप्त किया जाता है, बल्कि हाइड्रोजेल समाधान और फ्लोरोसेंट मोतियों की सटीक मात्रा के एक सरल इनक्यूबेशन के साथ। PIV विश्लेषण करते समय उच्च मनका घनत्व महत्वपूर्ण लाभ का होता है क्योंकि यह कर्षण बलों के संकल्प और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता के बिना सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाता है। 3) सेल-सामग्री इंटरफ़ेस के करीब एक पतली परत में मोतियों को सीमित करना एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ-साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कर्षण बलों की इमेजिंग को सक्षम बनाता है। हाइड्रोजेल तैयार करते समय, उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले यह दृढ़ता से नीचे के ग्लास का पालन करता है। हम हाइड्रोजेल परतों के पोलीमराइजेशन के लिए संकेतित इनक्यूबेशन समय का पालन करने की सलाह देते हैं, क्योंकि हाइड्रोजेल सतह को नुकसान पहुंचाए बिना सतह के शीर्ष पर कांच को हटाना मुश्किल हो सकता है।
लोचदार गुणों को मापने के लिए सबसे प्रसिद्ध तकनीकें एएफएम, नैनोइंडेंटेशन, तन्यता परीक्षण और रियोमेट्री हैं। हालांकि, नैनोइंडेंटेशन उन सामग्रियों पर बहुत अधिक उपभेदों को प्रेरित करता है जो लोचदार गुणों के निर्धारण को प्रभावित कर सकते हैं। दूसरी ओर तन्यता परीक्षण और रिओमेट्री मैक्रोस्कोपिक माप तकनीकें हैं, जबकि कोशिकाएं एक सूक्ष्म पैमाने पर बातचीत करती हैं31,32। एएफएम शारीरिक परिस्थितियों के तहत कम उपभेदों के साथ माइक्रोस्केल पर माप की अनुमति देता है। AFM माप की विश्वसनीयता प्रतिकूल रूप से प्रभावित हो सकती है यदि प्रयोगात्मक विवरण अनुपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, इंडेंटेशन बल और गति) या अपर्याप्त डेटा रिकॉर्ड किया गया है27। Huth et al. AFM डेटा से यंग के मोडुली को निकालने के लिए एक एल्गोरिथ्म का वर्णन करता है, जो माप विवरण को स्थिर रखने पर जोर देता है27। यह एल्गोरिथ्म यंग के मोडुली का एक सटीक और विश्वसनीय निर्धारण प्रदान करता है और इसका उपयोग हमारे प्रयोगों के लिए किया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने अलग-अलग दिनों में बनाए गए नमूनों पर कई वक्रों को मापा और बहुत समान परिणाम प्राप्त किए (ca. 1-2 kPa के माध्य मानों की भिन्नता)। इससे पता चलता है कि हमारे जैल की कठोरता की मज़बूती से भविष्यवाणी की जा सकती है।
इस प्रोटोकॉल में, हम कांच पर माइक्रोपैटर्न्ड क्षेत्रों को बनाने के लिए एक फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल का उपयोग करते हैं, जिसे तब हाइड्रोजेल सतहों पर स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया माइक्रोपैटर्निंग डीएमडी (डिजिटल माइक्रो-मिरर डिवाइस) -आधारित मास्कलेस नियर-यूवी लिथोग्राफी (π = 375 एनएम)7 पर आधारित है। एक डीएमडी में एक चिप पर बड़ी संख्या में माइक्रोमिरर होते हैं। एक एकल पिक्सेल एक एकल माइक्रो-मिरर से मेल खाता है। एक कंप्यूटर से पिक्सेलेटेड पैटर्न छवि फ़ाइल को डीएमडी के माध्यम से प्रक्षेपित किया जाता है और एक उद्देश्य लेंस का उपयोग करके सतह पर केंद्रित किया जाता है। प्रोटीन के माइक्रोपैटर्निंग के लिए, केंद्रित लेजर प्रकाश का उपयोग एक फोटोइनिशिएटर की मदद से विकर्षक बहुलक ब्रश को क्लीव करने के लिए किया जाता है। बाद में, उजागर क्षेत्रों को ईसीएम प्रोटीन से भर दिया जाता है। यह मुखौटा रहित एब्लेशन विधि नए पैटर्न डिजाइन करने में महान लचीलापन प्रदान करती है, क्योंकि यह फोटोमास्क के उपयोग पर भरोसा नहीं करती है। एक पैटर्न को डिजाइन करना और लागू करना बहुत आसान है क्योंकि इंकस्केप जैसे फ्रीवेयर का उपयोग करके केवल कई मिनट लगते हैं। हालांकि, कम समय में उत्पादित पैटर्न और नमूने की संख्या एक बड़ी खामी है, क्योंकि इस विधि का उपयोग केवल हर बार एक सब्सट्रेट को पैटर्न करने के लिए किया जा सकता है। फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल एक निकट यूवी ठोस-राज्य लेजर स्रोत का उपयोग करता है जो कई मिलीवाट का उत्सर्जन करता है। बिना तेल वाली लेजर बीम आंखों और त्वचा के लिए खतरनाक है। परावर्तित और बिखरे हुए प्रकाश और विकिरण भी खतरनाक हो सकते हैं। हैंडलिंग लेजर अधिकारियों से एक सुरक्षा निर्देश के साथ किया जाना चाहिए। एक फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल का उपयोग करते समय प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोपैटर्निंग और एब्लेशन के दौरान लेजर ठीक से सतह पर केंद्रित है। पैटर्निंग के दौरान यूवी-लाइट की एक सुसंगत रोशनी खुराक (समय से गुणा तीव्रता) इस बात पर निर्भर करती है कि लेजर सतह पर कैसे केंद्रित है। खराब फोकस के कारण सतह पर एक कमजोर तीव्रता के परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल सतह पर ईसीएम हस्तांतरण की विफलता हो सकती है जिसके परिणामस्वरूप कोई कोशिकाएं हाइड्रोजेल से जुड़ी नहीं होती हैं।
टीएफएम प्रयोगों में, अनुयायी कोशिकाओं और फिड्यूशियल मार्करों की प्रारंभिक इमेजिंग के बाद, कोशिकाओं को उनके आराम की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए ट्रिप्सिन उपचार द्वारा पीए हाइड्रोजेल से जारी किया जाता है। इस चरण को निष्पादित करने में एक दोष माइक्रोस्कोपी चरण पर नमूने को संभाल रहा है। एक परफ्यूजन कक्ष के बिना, पकवान के ढक्कन को खोलना, माध्यम को एस्पिरेट करना, रिंसिंग, और पिपेटिंग ट्रिप्सिन समाधान शुरुआती और अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। वास्तव में, ये प्रक्रियाएं xyz अक्षों में बहाव का एक प्रमुख स्रोत हैं, जिसके परिणामस्वरूप स्थिति और फोकस का नुकसान होता है। हमारे स्थानीय-यूवी रोशनी प्रोटोकॉल टीएफएम को शुरुआती लोगों के लिए एक अधिक सुलभ तकनीक बनाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोपी-आधारित मास्कलेस फोटोपैटर्निंग मॉड्यूल का उपयोग किया, लेकिन सिद्धांत रूप में किसी भी यूवी-ए प्रकाश प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है, अंततः सब्सट्रेट के क्षेत्रों की रक्षा के लिए मास्क के साथ संयोजन में, जहां सेल कर्षण बलों को दर्ज नहीं किया जाना चाहिए। कम तरंग दैर्ध्य दृश्यमान प्रकाश की एक महत्वपूर्ण खुराक के साथ कोशिकाओं को उजागर करना (उदाहरण के लिए, बैंगनी प्रकाश जो डीएपीआई उत्सर्जन को उत्तेजित करता है) ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि का कारण बनेगा, जिसके परिणामस्वरूप फोटोटॉक्सिसिटी और सेल मृत्यु हो सकती है। इसलिए, इस तकनीक को यूवी लेजर मॉड्यूल के बिना एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप में भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, जैसा कि तीव्रता बहुत कमजोर है, इस मामले में एंजाइमेटिक उपचार के साथ टीएफएम को पूरा करना बहुत आसान होगा।
LUVI-TFM के साथ एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के छोटे समूहों की स्थानीय टुकड़ी के कारण कई मापों के लिए एक ही नमूने का उपयोग करना संभव है। हालांकि, पड़ोसी कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग बलों से बचने के लिए, अलग करने के लिए कोशिकाओं के चयन पर ध्यान दिया जाना चाहिए। इस प्रकार, माइक्रोपैटर्न की अनुपस्थिति में एकल सेल माप के लिए, भीड़-भाड़ वाले क्षेत्रों से बचा जाना चाहिए; एकल माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं पर माप के लिए, पैटर्न को इस तरह से डिज़ाइन किया जाना चाहिए कि एकल संरचनाओं के बीच की दूरी कम से कम पैटर्न वाले क्षेत्र के व्यास से दोगुनी हो। हम अनुक्रम में आसन्न पैटर्न से कोशिकाओं का उपयोग नहीं करने की भी सलाह देते हैं, बल्कि सब्सट्रेट पर दूर के क्षेत्रों से उनका नमूना लेते हैं। हमारा माप एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर अच्छी तरह से आयोजित किया जाता है जो एक फोकस नियंत्रण सुविधा और 40 x एयर एनए = 0.9 लेंस से सुसज्जित होता है, जहां लेंस की काम करने की दूरी पर्याप्त रूप से लंबी होती है और एक अच्छी तरह से दूसरे तक तेजी से आंदोलन अत्यधिक ट्यूनेबल होता है। TFM अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं की लक्षित टुकड़ी एक एकल सेल या एक पूरे छोटे सेल क्लस्टर के सेलुलर बल को मापने के लिए प्रभावी है (उदाहरण के लिए, व्यास में 300 μm तक)। हमारे सेटअप का उपयोग करते हुए, हमने एकल कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) के यूवी उपचार के लिए सेल गोलाई और टुकड़ी देखी, जबकि छोटे सेल क्लस्टर के लिए टुकड़ी शायद ही कभी हुई। यह सेल कर्षण बलों के एक कम करके आंकने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। बड़े सेल क्लस्टर के लिए, एंजाइमेटिक टुकड़ी की सिफारिश की जाती है, क्योंकि उपयोगकर्ताओं को पूरे क्लस्टर की छवि के लिए 20x हवा के उद्देश्य का उपयोग करना चाहिए और एक फोकस नियंत्रण सुविधा की आवश्यकता होती है। चूंकि 20x एयर लेंस के फोकस की गहराई बहुत लंबी है, इसलिए हैंडलिंग उच्च आवर्धन उद्देश्य के रूप में महत्वपूर्ण नहीं होगी। उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कोशिकाओं के एब्लेशन के लिए फोकस सही ढंग से सेट किया गया है, क्योंकि रोशनी की खुराक सतह पर लेजर फोकस पर निर्भर है। जबकि हम पड़ोसी अनुपचारित कोशिकाओं के साथ संभावित यांत्रिक बातचीत के कारण सेल कलेक्टिव में एलयूवीआई-टीएफएम का उपयोग करने में संभावित सीमाओं से अवगत हैं, यह पहलू वास्तव में लक्षित सेल एक्सट्रूज़न के यांत्रिकी पर अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, उपकला मोनोलेयर्स से।
अंत में, हमारे TFM दृष्टिकोण के साथ माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं के प्रकाश प्रेरित रिलीज के साथ संयुक्त, हम सेल आसंजन बलों को मापने के लिए एक मजबूत और उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को रिज़ॉल्यूशन और संवेदनशीलता में सुधार के उद्देश्य से माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेटअप का उपयोग करके आगे बढ़ाया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोटोकॉल वीडियो उत्पादन में समर्थन के लिए श्रीमती रेबेका अल्वाराडो और पांडुलिपि पर रचनात्मक आलोचना के लिए श्री स्टीफन कैसले को धन्यवाद देते हैं। हम सेलुलर बायोफिज़िक्स विभाग के सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं, मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च सहायक चर्चाओं के लिए। मैक्स-प्लैंक-Gesellschaft से E.A.C.-A तक वित्तीय सहायता। और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 से E.A.C.-A. और P4 से U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 अमेरिका के लिए) को भी बहुत स्वीकार किया जाता है। J.B. वित्तीय सहायता के लिए कार्ल Zeiss फाउंडेशन धन्यवाद. E.A.C.-A., C.S. और U.S.S. जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF) द्वारा समर्थित मैक्स प्लैंक स्कूल मैटर टू लाइफ के माध्यम से धन स्वीकार करते हैं। सीएस यूरोपीय अनुसंधान परिषद (Consolidator Grant PHOTOMECH, no.101001797) द्वारा समर्थित है।
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
UVO cleaner | #342-220 | Jelight |