Nær UV-litografi og trekkraftmikroskopi kombineres for å måle cellulære krefter på mikropatterned hydrogeler. Den målrettede lysinduserte frigjøringen av enkeltceller muliggjør et høyt antall målinger på samme prøve.
Trekkraftmikroskopi (TFM) er hovedmetoden som brukes i mekanobiologi for å måle cellekrefter. Vanligvis brukes dette til celler som holder seg til flate myke substrater som deformeres under celle trekkraft (2D-TFM). TFM er avhengig av bruk av lineære elastiske materialer, som polydimetylsiloksan (PDMS) eller polyakrylamid (PA). For 2D-TFM på PA er vanskeligheten med å oppnå høye gjennomstrømningsresultater hovedsakelig fra den store variasjonen av celleformer og trekkrafter, og krever standardisering. Vi presenterer en protokoll for raskt og effektivt å fremstille mikropatterned PA hydrogeler for 2D-TFM-studier. Mikropatternene opprettes først av maskløs fotolitografi ved hjelp av nær UV-lys der ekstracellulære matriseproteiner bare binder seg til de mikropatternerte områdene, mens resten av overflaten forblir ikke-klebende for celler. Mikropattering av ekstracellulære matriseproteiner skyldes tilstedeværelsen av aktive aldehydgrupper, noe som resulterer i limområder av forskjellige former for å imøtekomme enten enkeltceller eller grupper av celler. For TFM-målinger bruker vi PA-hydrogeler av forskjellig elastisitet ved å variere mengden akrylamid og bisakrylamid og spore forskyvningen av innebygde fluorescerende perler for å rekonstruere celletraksjonsfelt med regularisert Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
For ytterligere å oppnå presis registrering av cellekrefter beskriver vi bruken av en kontrollert dose mønstret lys for å frigjøre cellegrep i definerte regioner for enkeltceller eller grupper av celler. Vi kaller denne metoden lokal UV-belysningskraftmikroskopi (LUVI-TFM). Ved enzymatisk behandling løsnes alle celler fra prøven samtidig, mens med LUVI-TFM kan trekkraftkrefter av celler i forskjellige regioner i prøven registreres i rekkefølge. Vi demonstrerer anvendelsen av denne protokollen (i) for å studere celletraksjonskrefter som en funksjon av kontrollert vedheft til substratet, og (ii) for å oppnå et større antall eksperimentelle observasjoner fra samme prøve.
Når de samhandler med sitt ekstracellulære miljø, utøver tilhengerceller krefter som hovedsakelig formidles av integrinbaserte fokaladhesjoner som forbinder den ekstracellulære matrisen (ECM) til aktincytoskjelettet. Fokale vedheft er multiproteinsamlinger som er sentrert rundt bindingen av integrins til ECM-proteiner som fibronectin og kollagen. Integrinsk klynger og vekst av fokale vedheft er avgjørende ikke bare for etableringen av en mekanisk stabil forbindelse, men også for rekruttering av andre fokale vedheftproteiner, inkludert de som aktiverer RhoA-banen for regulering av cellulær kontraktilitet1. Den RhoA-avhengige kontraktiliteten til actin cytoskeleton gjør det mulig for celler å spre seg og migrere på den underliggende ECM, og også å føle stivheten2. Fordelingen av trekkraftkrefter avhenger sterkt av cellenes spredningsområde og form, som begge er avhengige av matriseegenskaper og påvirker derfor cytoskeletal organisering, og danner til slutt en lukket tilbakemeldingssløyfe mellom matrisemekanikk og cytoskeletal organisasjon3,4.
Overflatemikropatterningsteknikker tillater en definert kontroll av celleform ved å skape mikron-størrelse regioner som presenterer ECM-limproteiner; i henhold til størrelsen på disse regionene, enkeltceller eller grupper av celler som holder seg til micropattern5. ECM-proteiner kan mønstres på glasssubstrater ved forskjellige tilnærminger som mikrokontaktutskrift, fotomønster eller lasermønster6. Bruk av UV-lys (λ = 185 eller 375 nm) kombinert med overflate antifouling strategier gir fleksibiliteten til å designe ulike former og størrelser og immobilisering av flere proteintyper med høy presisjon nær overflatekanter7,8. Regionene belagt med proteinavstøtende kjemikalier som polyetylenglykol (PEG) er beskyttet med enten en kromfotomaske eller en digital speilenhet (DMD)-basert maskeløs litografisystem. Mønstrene i maskene tillater eksponering for UV-lys av regioner som deretter vil bli mønstret med ECM-proteiner. Mønsteret av hydrogeloverflater med ECM-proteiner krever et overføringstrinn for å fjerne proteiner fra glassoverflaten og krysskoble dem til mønstrene. Alternativt kan mønster på myke materialer oppnås ved først å belegge fotomasken med et avstøtende protein, etterfulgt av å brenne de umaskerte områdene ved hjelp av dyp UV-belysning. Siden dyp UV genererer ozon og gjør overflaten reaktiv for proteinbinding, er de umaskerte områdene belagt med ECM-proteiner, og til slutt polymeriseres gelen direkte på toppen av de umaskerte områdene9,10.
De mønstrede hydrogelene kan brukes til å utføre TFM, en teknikk som måler cellekrefter ved cellematerialegrensesnittet11. I 2D-TFM bruker man den flate overflaten av en tykk polymerfilm, der markørperler har blitt innebygd for å spore deformasjoner12,13,14,15. For å trekke ut forskyvningsvektorer er det viktig å kombinere to bilder, en av deformert tilstand og ett referansebilde uten deformasjoner. De to bildene tilordnes deretter til hverandre med bildebehandling. Ved høy markørtetthet gjøres dette vanligvis med PIV (Particle Image Velocimetry), som er en veletablert metode for å rekonstruere hydrodynamisk strømning. Ved lav markørtetthet og i 3D-TFM gjøres dette vanligvis med PTV (Particle Tracking Velocimetry), som inkluderer spesifikke funksjoner i det eksperimentelle datasettet. Et eksempel på et beregningsmessig billigere alternativ er optisk flyt, for eksempel Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritme16. Når det gjelder hydrogelsubstrater, er fluorescerende perler vanligvis innebygd ved høy tetthet under materialpolymeriseringen, og bilder registreres før og etter celleutgivelse ved enzymatisk løsing. Enzymatisk løsrivelse av tilhengerceller, for eksempel ved trypsinisering, fører til samtidig frigjøring av cellulære trekkrafter fra alle celler på hydrogelene, noe som gjør det vanskelig å få en detaljert analyse fra et høyt antall celler.
Her presenterer vi en protokoll for å forberede mikropatterned hydrogeler for å kontrollere celleform og lokalisering og en metode for effektivt å måle trekkraftkrefter i rekkefølge ved hjelp av UV for å løsne individuelle celler fra substratet. For trekkraftmålinger presenterer vi en teknikk for å produsere tolags PA-hydrogeler, der fluorescerende perler bare er innebygd i topplaget, noe som øker tettheten og reduserer deres vertikale spredning. Ved å kombinere UV-mediert frigjøring av cellulære trekkraftkrefter med mikropattering gjør det mulig å oppnå romlig kontroll over celleavløsning (f.eks. av enkeltceller uten å påvirke vedheft av andre celler i interesseområdet), forutsatt at det er tilstrekkelig avstand mellom mønstrede celler. Cellulær trekkraft rekonstrueres deretter ved hjelp av den mest effektive og pålitelige metoden for 2D-TFM, nemlig Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) med regularisering17,18.
I denne protokollen beskriver vi fremstilling av mikropatterned PA hydrogeler som inneholder fluorescerende perler, som brukes som fiducial markører for TFM-studier. Vår tilnærming er basert på tre trinn: 1) tilberedning av tolags PA hydrogeler; 2) mikropattering av ECM-proteiner og deres overføring til hydrogeloverflaten; 3) bruk av mønstret nær UV-lys for TFM. Det eksperimentelle oppsettet for å analysere cellegrep til substratet krever bruk av lineære elastiske materialer med kjente stivhetsverdier for å beregne kreftene knyttet til forskyvning av fluorescerende perler26. PA hydrogeler er enkle å forberede, stivheten kan enkelt justeres, og de brukes ofte til stivhetssensor og TFM18,28. For å oppnå reproduserbare polymerisasjonstider og homogen polymerisering av hele hydrogelen, bør det imidlertid tas hensyn til lagring av forhold og tid for reagensene, for eksempel bør APS holdes i en desiccator for å unngå å miste sin aktivitet; TEMED skal beskyttes mot direkte lys. Bruken av oksidert HEA tillater kovalent binding av matriseproteiner på hydrogeloverflaten, noe som kan være fordelaktig for å oppnå dannelsen av et fullt og stabilt proteinlag. Den oksiderte HEA-oppløsningen skal tilberedes fersk hver gang PA-hydrogeler fremstilles. Den tolags PA hydrogelen gir tre hovedfordeler: 1) det gir en alternativ måte å reprodusere en homogen fordeling av fiducial perler nær hydrogeloverflaten, uten behov for å gjøre gelen ekstremt tynn (dvs. <20 μm). Kontroll over hydrogeltykkelsen er avgjørende for å oppnå nøyaktige målinger med TFM. Når det elastiske substratet er for tynt, kan sterke festeceller som fibroblaster føle og reagere mekanisk på det underliggende stive glasssubstratet29,30. Tykke hydrogeler gjør bildeanskaffelsen for kraftrekonstruksjonen mer utfordrende. Videre vil mange mikroskoper ikke ha tilstrekkelig plass til å imøtekomme dem, med tanke på den ekstra tykkelsen på glasssubstratet som brukes til å feste hydrogelen, med mindre ultratynne mikroskopiske lysbilder brukes. 2) I den tolags PA hydrogel oppnås den homogene fordelingen av fiducial perler nær overflaten av PA-hydrogelen uten å bruke sentrifuge, men heller med en enkel inkubasjon av presise mengder hydrogelløsninger og fluorescerende perler. Høy perletetthet er av betydelig fordel når du utfører PIV-analysen fordi den øker oppløsningen av trekkraftkreftene og signal-til-støy-forholdet uten behov for konfektmikroskopi. 3) Begrensende perler i et tynt lag nær cellematerialegrensesnittet muliggjør avbildning av trekkraftkrefter med epifluorescensmikroskop samt konfokale mikroskoper. Når du forbereder hydrogelen, bør brukeren sørge for at den fester seg godt til bunnglasset før du fortsetter med de påfølgende trinnene i protokollen. Vi anbefaler å følge inkubasjonstiden som er angitt for polymerisering av hydrogellagene, da det kan være vanskelig å fjerne glasset på toppen av overflaten uten å skade hydrogeloverflaten.
De mest kjente teknikkene for å måle elastiske egenskaper er AFM, nanoindentasjon, strekkprøver og reometri. Nanoindentasjon induserer imidlertid svært høye stammer på materialene som kan påvirke bestemmelsen av elastiske egenskaper. Strekkprøver og reometri er derimot makroskopiske måleteknikker, mens celler samhandler på en mikroskopisk skala31,32. AFM tillater målinger på mikroskalaen med reduserte stammer under fysiologiske forhold. Påliteligheten til AFM-målinger kan påvirkes negativt hvis eksperimentelle detaljer mangler (f.eks. innrykkskraft og hastighet) eller utilstrekkelige data registreres27. Huth et al. beskriver en algoritme for å trekke ut Youngs moduli fra AFM-data, som legger vekt på å holde måledetaljene konstante27. Denne algoritmen tilbyr en presis og pålitelig bestemmelse av Youngs moduli og ble brukt til våre eksperimenter. I tillegg målte vi mange kurver på prøver fremstilt på forskjellige dager og fikk svært like resultater (variasjon av gjennomsnittsverdier på ca. 1-2 kPa). Dette viser at stivheten i gelene våre kan forutsies pålitelig.
I denne protokollen bruker vi en fotopatteringsmodul for å lage mikropatternerte områder på glass, som deretter overføres til hydrogeloverflatene. Mikropatterningen som vises i denne protokollen er basert på DMD (digital mikrospeilenhet)-basert maskeløs nær UV-litografi (λ = 375 nm)7. En DMD består av et stort antall mikromirrorer på en brikke. En enkelt piksel tilsvarer ett enkelt mikrospeil. Bildefilen med pikselert mønster fra en datamaskin projiseres gjennom DMD og fokuserer på overflaten ved hjelp av et objektiv. For mikropattering av proteiner brukes det fokuserte laserlyset til å spalte avstøtende polymerbørster ved hjelp av en fotoinitiator. Etterpå er de eksponerte områdene fylt med ECM-proteiner. Denne maskeløse ablasjonsmetoden gir stor fleksibilitet i utformingen av nye mønstre, da den ikke er avhengig av bruk av en fotomaske. Det er veldig enkelt å designe og bruke et mønster, da det bare tar flere minutter å bruke en freeware som Inkscape. Antall mønstre og utvalg som produseres på kort tid er imidlertid en stor ulempe, da denne metoden bare kan brukes til å mønstre et enkelt substrat hver gang. Fotopatteringsmodulen bruker en laserkilde i nær UV-fast tilstand som avgir flere milliwatt. Den uskjermede laserstrålen er farlig for øynene og huden. Reflektert og spredt lys og stråling kan også være farlig. Håndtering må ledsages av en sikkerhetsinstruksjon fra laseroffiserer. Det mest kritiske trinnet i protokollen når du bruker en fotopatteringsmodul er å sikre at laseren under mikropatterningen og ablasjonen er riktig fokusert på overflaten. En konsistent belysningsdose (intensitet multiplisert med tid) av UV-lys under mønster er avhengig av hvordan laseren er fokusert på overflaten. En svak intensitet på overflaten på grunn av dårlig fokus kan føre til svikt i ECM-overføringen til hydrogeloverflaten, noe som resulterer i at ingen celler blir festet til hydrogelen.
I TFM-eksperimenter, etter den første avbildningen av tilhengerceller og fiducial markører, frigjøres celler fra PA-hydrogelen ved trypsinbehandling for å registrere deres avslappede tilstand. En ulempe med å utføre dette trinnet er å håndtere prøven på mikroskopistadiet. Uten et perfusjonskammer representerer åpning av lokket på parabolen, aspirering av medium, skylling og pipettering trypsin-løsning en utfordring for nybegynnere og erfarne brukere. Faktisk er disse prosedyrene en viktig kilde til driften i xyz-akser , noe som resulterer i tap av posisjon og fokus. Vår lokale UV-belysningsprotokoll gjør TFM til en mer tilgjengelig teknikk for nybegynnere. Det skal bemerkes at vi brukte en kommersielt tilgjengelig mikroskopibasert maskeringsfri fotopatteringsmodul, men i prinsippet kan ethvert UV-A-belysningssystem brukes, til slutt i kombinasjon med en maske for å beskytte regioner i underlagene, hvor cellegrep ikke skal registreres. Eksponering av celler med en betydelig dose synlig lys med lav bølgelengde (f.eks. fiolett lys som begeistrer DAPI-utslipp) vil føre til økende oksidativt stress, noe som kan føre til fototoksisitet og celledød. Derfor kan denne teknikken brukes selv i et epifluorescensmikroskop uten EN UV-lasermodul. Men siden intensiteten er mye svakere, vil det være mye lettere å oppnå TFM med den enzymatiske behandlingen i dette tilfellet.
Med LUVI-TFM er det mulig å bruke samme prøve for flere målinger på grunn av lokal løsrivelse av enkeltceller eller små grupper av celler. Det bør imidlertid tas hensyn til valg av celler for å løsne, for å unngå å registrere krefter fra nærliggende celler. Således, for enkeltcellemålinger i fravær av mikropatterns, bør overfylte regioner unngås; For målinger på enkeltmikropatternede celler, bør mønstrene utformes slik at avstanden mellom enkeltstrukturer er minst dobbelt så stor diameter som det mønstrede området. Vi anbefaler også at du ikke bruker celler fra tilstøtende mønstre i rekkefølge, men heller prøver dem fra fjerne områder på substratet. Vår måling er godt utført på et epifluorescence mikroskop utstyrt med en fokuskontrollfunksjon og en 40 x luft NA = 0,9 linse, hvor arbeidsavstanden til linsen er tilstrekkelig lang og den raske bevegelsen fra en brønn til en annen er svært justerbar. Den målrettede løsningen av celler for TFM-applikasjoner er effektiv for måling av cellulær kraft i en enkelt celle eller en hel liten celleklynge (f.eks. opptil 300 μm i diameter). Ved hjelp av oppsettet vårt observerte vi celleavrunding og løsrivelse for UV-behandling av enkeltceller (figur 3A), mens løsrivelse sjelden skjedde for små celleklynger. Dette kan føre til en undervurdering av celle trekkraft krefter. For større celleklynger anbefales enzymatisk løsrivelse, siden brukerne bør bruke et 20x luftmål for å avbilde hele klyngen og en fokuskontrollfunksjon er nødvendig. Siden fokusdybden til 20x-luftlinsen er mye lengre, vil håndteringen ikke være så kritisk som det høyere forstørrelsesmålet. Brukeren bør sørge for at fokuset er riktig innstilt for ablasjon av celler, siden belysningsdosen er avhengig av laserfokuset på overflaten. Selv om vi er klar over de mulige begrensningene ved bruk av LUVI-TFM i cellekollektiver på grunn av mulige mekaniske interaksjoner med nærliggende ubehandlede celler, kan dette aspektet faktisk vise seg å være nyttig for studier på mekanikken til målrettet celleekstrudering, for eksempel fra epitelale monolayers.
Til slutt, med vår TFM-tilnærming kombinert med lysindusert frigjøring av mikropatternede celler, tilbyr vi en robust og høy gjennomstrømningsprotokoll for å måle celleadhesjonskrefter. Allsidigheten til denne metoden kan utnyttes ytterligere ved hjelp av mikroskopi og bildebehandlingsoppsett med sikte på å forbedre oppløsning og følsomhet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Fru Rebecca Alvarado for støtten i protokollvideoproduksjonen og Mr. Stephen Casale for konstruktiv kritikk av manuskriptet. Vi takker kollegene fra Institutt for cellulær biofysikk, Max Planck Institute for Medical Research for de nyttige diskusjonene. Den økonomiske støtten fra Max-Planck-Gesellschaft til E.A.C.-A. og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 til E.A.C.-A. og P4 til USA; DFG EXC 2082/1-390761711 til USA) er også sterkt anerkjent. J.B. takk Carl Zeiss Foundation for økonomisk støtte. E.A.C.-A., C.S. og U.S.S. anerkjenner finansiering gjennom Max Planck School Matter to Life støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF). C.S. støttes av Det europeiske forskningsrådet (Consolidator Grant PHOTOMECH, nr.101001797).
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
UVO cleaner | #342-220 | Jelight |