Nära UV-litografi och dragkraftmikroskopi kombineras för att mäta cellulära krafter på mikromönsterförsedda hydrogeler. Den riktade ljusinducerade frisättningen av enstaka celler möjliggör ett stort antal mätningar på samma prov.
Traction force microscopy (TFM) är den huvudsakliga metoden som används i mekanobiologi för att mäta cellkrafter. Vanligtvis används detta för celler som följer platta mjuka substrat som deformeras under celldragkraft (2D-TFM). TFM förlitar sig på användning av linjära elastiska material, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) eller polyakrylamid (PA). För 2D-TFM på PA är svårigheten att uppnå högt genomströmning främst från den stora variationen av cellformer och dragkrafter, vilket kräver standardisering. Vi presenterar ett protokoll för att snabbt och effektivt tillverka micropatterned PA hydrogels för 2D-TFM studier. Mikropatternerna skapas först av masklös fotolitografi med hjälp av nära UV-ljus där extracellulära matrisproteiner endast binder till de mikropatternerade regionerna, medan resten av ytan förblir icke-lim för celler. Mikropatterning av extracellulära matrisproteiner beror på närvaron av aktiva aldehydgrupper, vilket resulterar i självhäftande regioner av olika former för att rymma antingen enstaka celler eller grupper av celler. För TFM-mätningar använder vi PA-hydrogeler med olika elasticitet genom att variera mängden akrylamid och bis-akrylamid och spåra förskjutningen av inbäddade fluorescerande pärlor för att rekonstruera celldragfält med legaliserad Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
För att ytterligare uppnå exakt registrering av cellkrafter beskriver vi användningen av en kontrollerad dos av mönstrat ljus för att frigöra celldragkrafter i definierade regioner för enstaka celler eller grupper av celler. Vi kallar denna metod lokal UV-belysning dragkraft mikroskopi (LUVI-TFM). Med enzymatisk behandling lossnar alla celler från provet samtidigt, medan luvi-TFM dragkraftskrafter hos celler i olika delar av provet kan registreras i följd. Vi visar tillämpligheten av detta protokoll (i) att studera cellen dragkraft krafter som en funktion av kontrollerad vidhäftning till substratet, och (ii) att uppnå ett större antal experimentella observationer från samma prov.
När de interagerar med sin extracellulära miljö utövar vidhäftande celler krafter som huvudsakligen förmedlas av integrinbaserade fokala vidhäftningar som förbinder den extracellulära matrisen (ECM) med aktin cytoskeleton. Fokala vidhäftningar är multiproteinenheter som är centrerade kring bindning av integriner till ECM-proteiner som fibronectin och kollagen. Integrin klustring och tillväxt av fokala vidhäftningar är avgörande inte bara för upprättandet av en mekaniskt stabil anslutning, men också för rekrytering av andra fokala vidhäftningsproteiner, inklusive de som aktiverar RhoA-vägen för reglering av cellulär kontraktilitet1. Den RhoA-beroende kontraktiliteten hos aktin cytoskeleton gör det möjligt för celler att sprida sig och migrera på den underliggande ECM, och även att känna dess styvhet2. Fördelningen av dragkraftskrafter beror starkt på cellernas spridningsområde och form, som båda förlitar sig på matrisegenskaper och därmed påverkar cytoskeletal organisation, så småningom bildar en sluten återkopplingsslinga mellan matrismekanik och cytoskeletal organisation3,4.
Ytmikropapperstekniker möjliggör en definierad kontroll av cellformen genom att skapa mikronstora regioner som presenterar ECM-limproteiner. beroende på storleken på dessa regioner, enstaka celler eller grupper av celler som håller sig till mikropattern5. ECM-proteiner kan mönstras på glassubstrat genom olika metoder som mikrokontakttryck, fotomönster eller lasermönster6. Användningen av UV-ljus (λ = 185 eller 375 nm) i kombination med ytfoulningsstrategier ger flexibiliteten för att utforma olika former och storlekar och immobilisering av flera proteintyper med hög precision nära ytkanter7,8. De regioner som är belagda med proteinavvisande kemikalier som polyetylenglykol (PEG) skyddas med antingen en kromfotomask eller ett DMD-baserat maskfritt litografisystem(Digital Mirror Device). Mönstren i maskerna möjliggör exponering för UV-ljus i regioner som sedan kommer att mönstras med ECM-proteiner. Mönstra av hydrogelytor med ECM-proteiner kräver ett överföringssteg för att avlägsna proteiner från glasytan och korsa dem till mönstren. Alternativt kan mönstring på mjuka material uppnås genom att först täcka fotomasken med ett repellent protein, följt av att bränna de omaskerade regionerna med djup UV-belysning. Eftersom djup UV genererar ozon och gör ytan reaktiv för proteinbindning, är de omaskerade regionerna belagda med ECM-proteiner och slutligen polymeriseras gelén direkt ovanpå de omaskerade regionerna9,10.
De mönstrade hydrogelerna kan användas för att utföra TFM, en teknik som mäter cellkrafter vid cellmaterialets gränssnitt11. I 2D-TFM använder man den plana ytan av en tjock polymerfilm, där markörpärlor har bäddats in för att spåra deformationer12,13,14,15. För att extrahera deplacementvektorer är det viktigt att kombinera två bilder, en av deformerade tillstånd och en referensbild utan deformationer. De två bilderna mappas sedan till varandra med bildbehandling. Vid hög markördensitet görs detta vanligtvis med Particle Image Velocimetry (PIV), som är en väletablerad metod för att rekonstruera hydrodynamiskt flöde. Vid låg markördensitet och i 3D-TFM görs detta vanligtvis med partikelspårningsvelocimetri (PTV), som innehåller specifika egenskaper hos den experimentella datauppsättningen. Ett exempel på ett beräkningsmässigt billigare alternativ är optiskt flöde, till exempel Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) algoritm16. När det gäller hydrogelsubstrat bäddas fluorescerande pärlor vanligtvis in med hög densitet under materialets polymerisation, och bilder spelas in före och efter cellutlösning vid enzymatisk avskildhet. Enzymatisk avlossning av vidhäftande celler, t.ex. genom trypsinisering, leder till samtidig frisättning av cellulära dragkrafter från alla celler på hydrogelerna, vilket gör det svårt att få en detaljerad analys från ett stort antal celler.
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda mikropatternerade hydrogeler för att kontrollera cellform och lokalisering och en metod för att effektivt mäta dragkrafter i följd med hjälp av UV för att lossa enskilda celler från substratet. För dragkraftsmätningar presenterar vi en teknik för att producera pa-hydrogeler med dubbla lager, där fluorescerande pärlor endast är inbäddade i det övre lagret, vilket ökar deras densitet och minskar deras vertikala spridning. Genom att kombinera UV-medierad frisättning av cellulära dragkrafter med mikropapper gör det möjligt att få rumslig kontroll över cellavlossning (t.ex. av enskilda celler utan att påverka vidhäftningen av andra celler i den intresseregion), förutsatt att det finns ett tillräckligt avstånd mellan mönstrade celler. Cellulär dragkraft rekonstrueras sedan med den mest effektiva och tillförlitliga metoden för 2D-TFM, nämligen Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) med legalisering17,18.
I detta protokoll beskriver vi beredningen av micropatterned PA hydrogels som innehåller fluorescerande pärlor, som används som fiducial markörer för TFM studier. Vårt tillvägagångssätt bygger på tre steg: 1) beredning av tvåskiktade PA-hydrogeler; 2) Mikropapperning av ECM-proteiner och överföring av dem till hydrogelytan. 3) användning av mönstrat nära UV-ljus för TFM. Den experimentella inställningen för att analysera celldragkrafter till substratet kräver användning av linjära elastiska material med kända styvhetsvärden för att beräkna krafterna relaterade till förskjutning av fluorescerande pärlor26. PA-hydrogeler är lätta att förbereda, styvheten kan enkelt justeras och de används ofta för styvhetsavkänning och TFM18,28. För att uppnå reproducerbara polymerisationstider och homogen polymerisation av hela hydrogelen bör man dock ägna uppmärksamhet åt lagring av förhållanden och tid för reagenserna, t.ex. bör APS hållas i en desiccator för att undvika att förlora sin aktivitet. TEMED bör skyddas mot direkt ljus. Användningen av oxiderad HEA möjliggör kovalent bindning av matrisproteiner på hydrogelytan, vilket kan vara fördelaktigt för att uppnå bildandet av ett komplett och stabilt proteinskikt. Den oxiderade HEA-lösningen ska beredas färsk varje gång PA-hydrogeler tillverkas. Den tvåskiktade PA-hydrogelen erbjuder tre huvudfördelar: 1) det ger ett alternativt sätt att reproducerbart få en homogen fördelning av fiducialpärlor nära hydrogelytan, utan att gelén behöver göra gelén extremt tunn (dvs. <20 μm). Kontroll över hydrogeltjockleken är avgörande för att få exakta mätningar med TFM. När det elastiska substratet är för tunt kan starka vidhäftande celler som fibroblaster känna av och mekaniskt reagera på det underliggande styva glassubstratet29,30. Tjocka hydrogeler gör bildförvärvet för kraftrekonstruktionen mer utmanande. Dessutom kommer många mikroskop inte att ha tillräckligt med utrymme för att rymma dem, med tanke på den extra tjockleken på det glassubstrat som används för att fästa hydrogelen, såvida inte ultrathinmikroskopir används. 2) I den tvåskiktade PA-hydrogelen uppnås den homogena fördelningen av fiducialpärlor nära ytan av PA-hydrogelen utan att använda en centrifug, utan snarare med en enkel inkubation av exakta mängder hydrogellösningar och fluorescerande pärlor. Hög pärltäthet är till stor fördel när PIV-analysen utförs eftersom den ökar upplösningen av dragkrafterna och signal-till-brus-förhållandet utan behov av konfokal mikroskopi. 3) Att begränsa pärlor i ett tunt skikt nära cellmaterialgränssnittet möjliggör avbildning av dragkrafter med epifluorescensmikroskop samt konfokala mikroskop. Vid beredning av hydrogelen bör användaren se till att den klibbar fast vid bottenglaset innan du fortsätter med de efterföljande stegen i protokollet. Vi rekommenderar att du följer inkubationstiden som anges för polymerisationen av hydrogelskikten, eftersom det kan vara svårt att ta bort glaset ovanpå ytan utan att skada hydrogelytan.
De mest kända teknikerna för att mäta elastiska egenskaper är AFM, nanoindentation, dragtester och rheometri. Nanoindentation inducerar dock mycket höga stammar på materialen som kan påverka bestämningen av elastiska egenskaper. Dragtester och rheometri är å andra sidan makroskopiska mättekniker, medan celler interagerar på mikroskopisk skala31,32. AFM möjliggör mätningar på mikroskalan med minskade stammar under fysiologiska förhållanden. Afm-mätningarnas tillförlitlighet kan påverkas negativt om experimentella detaljer saknas (t.ex. indragskraft och hastighet) eller om otillräckliga data registreras27. beskriver en algoritm för att extrahera Youngs moduli från AFM-data, som betonar att hålla mätdetaljer konstant27. Denna algoritm erbjuder en exakt och tillförlitlig bestämning av Youngs moduli och användes för våra experiment. Dessutom mätte vi många kurvor på prover tillverkade på olika dagar och fick mycket liknande resultat (variation av medelvärden på ca. 1-2 kPa). Detta visar att styvheten hos våra geler kan förutsägas på ett tillförlitligt sätt.
I det här protokollet använder vi en fotopatteringmodul för att skapa mikromönster på glas, som sedan överförs till hydrogelytorna. Mikropapperet som visas i detta protokoll är baserat på DMD (digital mikrospegelenhet)-baserad masklös nära UV-litografi (λ = 375 nm)7. En DMD består av ett stort antal mikromirrorer på ett chip. En enda pixel motsvarar en enda mikrospegel. Den pixelerade mönsterbildfilen från en dator projiceras via DMD och fokuseras på ytan med hjälp av en objektivlins. För mikropatterning av proteiner används det fokuserade laserljuset för att klyva repellent polymerborstar med hjälp av en fotoinitiator. Därefter fylls de exponerade regionerna med ECM-proteiner. Denna masklösa ablationsmetod erbjuder stor flexibilitet vid utformningen av nya mönster, eftersom den inte förlitar sig på användningen av en fotomask. Att designa och tillämpa ett mönster är mycket enkelt eftersom det bara tar flera minuter med hjälp av ett freeware som Inkscape. Antalet mönster och prover som produceras på kort tid är dock en stor nackdel, eftersom denna metod endast kan användas för att mönstra ett enda substrat varje gång. Fotopappersmodulen använder en nära UV-solid state-laserkälla som avger flera milliwatt. Den oskärmade laserstrålen är farlig för ögon och hud. Reflekterat och spridda ljus och strålning kan också vara farligt. Hanteringen måste åtföljas av en säkerhetsinstruktion från laserombud. Det mest kritiska steget i protokollet när du använder en fotopatteringmodul är att se till att lasern är ordentligt fokuserad på ytan under mikropatterningen och ablationen. En konsekvent belysningsdos (intensitet multiplicerad med tid) av UV-ljus under mönstrad är beroende av hur lasern är fokuserad på ytan. En svag intensitet på ytan på grund av dåligt fokus kan leda till att ECM överförs till hydrogelytan vilket resulterar i att inga celler fastnar på hydrogelen.
I TFM experiment, efter den första avbildningen av vidhäftande celler och fiducial markörer, cellerna släpps från PA hydrogel genom trypsin behandling för att registrera deras avslappnade tillstånd. En nackdel med att utföra detta steg är att hantera provet på mikroskopistadiet. Utan en perfusionskammare utgör det en utmaning för nybörjare och erfarna användare att öppna locket på skålen, aspirera på mediet, sköljning och pipettering trypsinlösning. Faktum är att dessa förfaranden är en viktig källa till avdriften i xyz-axlar , vilket resulterar i förlust av position och fokus. Vårt lokal-UV-belysningsprotokoll gör TFM till en mer tillgänglig teknik för nybörjare. Det bör noteras att vi använde en kommersiellt tillgänglig mikroskopibaserad masklös fotopappersmodul, men i princip kunde alla UV-A-belysningssystem användas, så småningom i kombination med en mask för att skydda regioner i substratet, där celldragkraftkrafter inte bör registreras. Att exponera celler med en betydande dos av lågt våglängds synligt ljus (t.ex. det violetta ljuset som exciterar DAPI-utsläpp) kommer att leda till ökad oxidativ stress, vilket kan leda till fototoxicitet och celldöd. Därför kan denna teknik appliceras även i ett epifluorescensmikroskop utan en UV-lasermodul. Men eftersom intensiteten är mycket svagare, kommer det att bli mycket lättare att uppnå TFM med den enzymatiska behandlingen i detta fall.
Med LUVI-TFM är det möjligt att använda samma prov för flera mätningar på grund av den lokala avlossningen av enstaka celler eller små grupper av celler. Uppmärksamhet bör dock ägnas åt valet av celler för att lossa, för att undvika att registrera krafter från närliggande celler. För encelliga mätningar i avsaknad av mikromönster bör därför trånga regioner undvikas. För mätningar på enstaka mikromönster bör mönstren utformas så att avståndet mellan enskilda strukturer är minst dubbelt så stor som diametern på det mönstrade området. Vi rekommenderar också att du inte använder celler från intilliggande mönster i följd, utan snarare tar prover på dem från avlägsna regioner på substratet. Vår mätning sker väl på ett epifluorescensmikroskop utrustat med en fokuskontrollfunktion och en 40 x luft NA = 0,9-lins, där linsens arbetsavstånd är tillräckligt långt och den snabba rörelsen från en brunn till en annan är mycket tunable. Den riktade lösgöringen av celler för TFM-tillämpningar är effektiv för att mäta cellkraften i en enskild cell eller i ett helt litet cellkluster (t.ex. upp till 300 μm i diameter). Med hjälp av vår setup observerade vi cell avrundning och avskildhet för UV-behandling av enstaka celler (figur 3A), medan detachement sällan inträffade för små cell kluster. Detta kan leda till en underskattning av celldragkraftkrafter. För större cellkluster rekommenderas enzymatisk lösgöring, eftersom användarna bör använda ett 20x luftmål för att avbilda hela klustret och en fokus kontroll funktion behövs. Eftersom fokusdjupet för 20x luftlinsen är mycket längre, kommer hanteringen inte att vara lika kritisk som det högre förstoringsmålet. Användaren bör se till att fokus är korrekt inställt för ablation av celler, eftersom belysningsdosen är beroende av laserfokus på ytan. Medan vi är medvetna om de möjliga begränsningarna i användning av LUVI-TFM i cellkollektiv på grund av möjliga mekaniska interaktioner med närliggande obehandlade celler, kan denna aspekt faktiskt visa sig vara användbar för studier om mekaniken för riktad cellprofilering, t.ex. från epitelial monolayers.
Sammanfattningsvis, med vår TFM strategi i kombination med ljus inducerad frisättning av micropatterned celler, vi ger en robust och hög-genomströmning protokoll för att mäta cell vidhäftning krafter. Mångsidigheten hos denna metod kan utnyttjas ytterligare med hjälp av mikroskopi och bildframställning som syftar till att förbättra upplösning och känslighet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Rebecca Alvarado för stödet i protokollets videoproduktion och Mr Stephen Casale för konstruktiv kritik mot manuskriptet. Vi tackar kollegorna från institutionen för cellulär biofysik, Max Planck Institute for Medical Research för de hjälpsamma diskussionerna. Det ekonomiska stödet från Max-Planck-Gesellschaft till E.A.C.-A. och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 till E.A.C.-A. och P4 till USA; DFG EXC 2082/1-390761711 till USA) är också mycket erkänt. J.B. tackar Carl Zeiss Foundation för ekonomiskt stöd. E.A.C.-A., C.S. och U.S.S. bekräftar finansiering genom Max Planck School Matter to Life som stöds av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF). C.S. stöds av Europeiska forskningsrådet (Consolidator Grant PHOTOMECH, nr.101001797).
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
UVO cleaner | #342-220 | Jelight |