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Methodenartikel

Etablierung eines tiefen hypothermen Kreislaufstillstands bei Ratten

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DOI:

10.3791/63571

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16. Dezember 2022

 , 
1Department of Cardiopulmonary Bypass, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, State Key Laboratory of Cardiovascular Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Etablierung eines tiefen hypothermen Kreislaufstillstands bei Ratten dar, der zur Untersuchung des systemischen Entzündungsreaktionssyndroms, der Ischämie / Reperfusionsverletzung, des oxidativen Stresses, der Neuroinflammation usw. angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Der tiefe hypothermische Kreislaufstillstand (DHCA) wird routinemäßig während Operationen bei komplexen angeborenen Herzfehlern und Aortenbogenerkrankungen angewendet. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Etablierung von DHCA bei Ratten bereitzustellen. Um den Einfluss des DHCA-Prozesses auf die Vitalparameter zu bewerten, wurde ein normaltemperatur-Herz-Lungen-Bypass-Modell (CPB) ohne Kreislaufstillstand als Kontrolle verwendet. Wie erwartet, führte DHCA zu einer signifikanten Abnahme der Körpertemperatur und des mittleren arteriellen Blutdrucks. Die Blutgasanalyse zeigte, dass DHCA den Milchsäurespiegel erhöhte, aber den Blut-pH-Wert und die Konzentrationen von Hämoglobin, Hämatokrit, Na+, Cl−, K+ und Glukose nicht beeinflusste. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Transmissionselektronenmikroskopie im Vergleich zu den normalen CPB-Ratten einen leichten Anstieg der Hippocampus-Autophagosomen bei den DHCA-Ratten.

Einleitung

Der tiefe hypothermische Kreislaufstillstand (DHCA) wird seit 1953 in der Herzchirurgie eingesetzt1. DHCA beinhaltet die Senkung der Kerntemperatur des Patienten auf ein stark hypothermisches Niveau (15-22 ° C), bevor der Blutfluss zum Körper global unterbrochenwird 2. Der Kreislaufstillstand kann ein relativ unblutiges Operationsfeld liefern. Tiefe Hypothermie verringert den Stoffwechsel, insbesondere im Gehirn und Myokard, was eine wirksame Methode zum Schutz vor Ischämie ist3. DHCA wird häufig bei Operationen bei komplexen angeborenen Herzfehlern, Aortenbogenerkrankungen und sogar Nieren- oder Nebennierentumoren mit einem Vena Cava-Thrombus 4,5 angewendet. Daher bietet die Etablierung von DHCA-Tiermodellen eine wichtige Referenz für die Verfeinerung des Verfahrens und die Vermeidung von Komplikationen im klinischen Umfeld.

Obwohl Modelle mit Eckzähnen6, Kaninchen7 und anderen Tieren etabliert werden können, ist es vorzuziehen, Ratten wegen ihrer Bedienbarkeit und niedrigen Kosten zu verwenden. Das DHCA-Rattenmodell wurde erstmals 2006 von Jungwirth et al.8 beschrieben. Es wurde festgestellt, dass die Dauer des Kreislaufstillstands einen Einfluss auf die neurologischen Ergebnisse hatte. Seitdem wurden DHCA-Rattenmodelle breit untersucht. Es wurde klargestellt, dass DHCA ein systemisches Entzündungsreaktionssyndrom (SIRS) hervorrufen könnte9. In nachfolgenden Studien fanden Pharmakologen heraus, dass die durch SIRS induzierte DHCA-bedingte Neuroinflammation durch Resveratrol10 und Triptolid11 abgeschwächt werden konnte. Unser Team fand auch heraus, dass DHCA-bedingte Neuroinflammation durch Hemmung des kälteinduzierbaren RNA-bindenden Proteins12 abgeschwächt werden kann. Im kardiovaskulären System hat Superoxiddismutase eine kardioprotektive Wirkung auf Ischämie / Reperfusion (I / R) -Verletzungen während DHCA13. Diese Ergebnisse erweiterten das Verständnis von DHCA-bezogenen pathophysiologischen Prozessen und boten neue Wege zur Verbesserung der DHCA-Ergebnisse. Die Ergebnisse in Bezug auf Endotoxämie, oxidativen Stress und Autophagie nach DHCA sind jedoch nicht schlüssig. DHCA verwendet die gleiche operative Technologie wie der kardiopulmonale Bypass (CPB)14, aber seine Managementstrategie ist unterschiedlich, und die Schritte zur Erzeugung von DHCA unterscheiden sich in verschiedenen Teams 8,9,10,11. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Etablierung des DHCA-Verfahrens bei Ratten bereitzustellen.

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Protokoll

Die Protokolle wurden einer institutionellen Überprüfung unterzogen und vom Institutional Animal Care and Use Committee, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (FW-2021-0005) genehmigt. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

HINWEIS: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht: 500-600 g, Alter: 12-14 Wochen) wurden unter Standardlaborbedingungen mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Die Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt (n = 6, jede Gruppe): die DHCA-Gruppe und die Normaltemperatur-CPB-Gruppe (NtCPB-Gruppe).

1. Vorarbeiten

  1. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (Pinzette, Schere, Mikrozange, Elektrokoagulator, Rasierer usw.) vor dem Experiment (Abbildung 1).
  2. Stellen Sie die Verfügbarkeit der Verbrauchsmaterialien sicher, zu denen 2-0 Seide, eine 16-G-Kanüle (Endotrachealkatheter), eine 22-G-Kanüle, eine hausgemachte 16-G-Kanüle (intravenöser Multi-Öffnungskatheter), Injektionsspritzen, Gaze und Klebeband gehören.
    HINWEIS: Verwenden Sie für die hausgemachte 16-G-Kanüle ein Skalpell, um zwei oder drei Öffnungen von 2 mm Durchmesser an der Spitze der Kanüle zu schneiden, was dazu beiträgt, die venöse Drainage glatter zu machen.
  3. Stellen Sie die Verfügbarkeit von Sevofluran, 2% Lidocain, Kochsalzlösung, Heparin (5 IE / ml, 250 IE / ml), Adrenalin (40 μg / ml), Noradrenalin (20 μg / ml), Hydroxyethylstärke und Bicarbonat sicher.
  4. Stellen Sie sicher, dass die DHCA-Kreisläufe einen Behälter (modifiziert von Murphys Tropfer), eine Rollenpumpe, einen Wärmetauscher, einen Membranoxygenator, Verbindungsrohre und einen Wassertank enthalten (Abbildung 2). Schließen Sie den Kreislauf an und mischen Sie 12 ml Hydroxyethylstärke mit 1 ml Heparinnatrium (250 IE) und 1 ml Kochsalzlösung. Grundieren Sie den Kreislauf mit 14 mL der Ansauglösung mit sanft rotierender Walzenpumpe (10-40 ml/min).
    HINWEIS: Das Reservoir wird von einem Bluttransfusionsgerät mit Murphys Tropfer umgeformt. Der venöse Zuflussteil des Tropfers bleibt bei 10-15 cm und der venöse Auslassteil bei 10 cm.

2. Anästhesie und Kanülierung

  1. Betäuben Sie die Ratten mit 2% -3% Sevofluran und testen Sie dann auf das Fehlen des Bindehautreflexes und der Muskelentspannung, nachdem die Ratte das Bewusstsein verloren hat.
    HINWEIS: Der Bindehautreflex bezieht sich auf das sofortige Schließen des Augenlids, wenn die Hornhaut berührt wird. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die Hornhaut leicht zu berühren. Wenn die Anästhesietiefe ausreichend ist, schließen sich die Augenlider nicht.
  2. Führen Sie eine endotracheale Intubation mit einer 16-G-Kanüle durch, nachdem der Bindehautreflex verschwunden ist und kein Muskelwiderstand beobachtet wird. Schließen Sie den Schlauch an ein Beatmungsgerät an und stellen Sie die Parameter ein, indem Sie auf die Tasten am Beatmungsgerät klicken (Tidalvolumen: 1,0-1,2 ml/100g, Herzfrequenz: 80 Schläge pro Minute [bpm], I:E = 1:1, inspirierter Sauerstoffanteil: 60%).
  3. Legen Sie eine elektrische Heizdecke unter die Ratte und fixieren Sie die Ratte mit Klebeband. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Rasieren Sie die Haare an der linken Leistenregion, der rechten Halsregion und dem Schwanz mit einem Rasierer. Desinfizieren Sie die Haut dann dreimal mit Jod und Alkohol.
  4. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Wenn die Atemfrequenz höher ist als die vom Beatmungsgerät eingestellte (80 bpm) oder wenn Muskelsteifigkeit vorliegt, erhöhen Sie die Ausgangskonzentration von Sevofluran.
    HINWEIS: Wenn die Tiefe der Anästhesie ausreichend ist, sollte der Atemrhythmus mit dem Beatmungsgerät synchronisiert werden, und die Muskeln sollten ohne Spannung vollständig entspannt sein. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie alle 30 Minuten, um sicherzustellen, dass die Ratte während des gesamten Eingriffs keine Rückkehr des Bewusstseins erfährt.
  5. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut im linken Leistenbereich (ca. 1 cm) zu schneiden, und sezieren Sie den Muskel und das Gewebe sanft, um die linke Oberschenkelvene und Arterie freizulegen. Trennen Sie die Arterie sorgfältig.
  6. Cannulatieren Sie einen 22 G intravenösen Katheter in die linke Oberschenkelarterie. Ligieren Sie Arterie und Katheter mit einer 2-0-Seide (im Bereich der Kanülierung). Verwenden Sie kochsalzhaltiges Heparin (5 UI / ml), um die Kanüle zu spülen, um Gerinnung zu vermeiden. Verbinden Sie den Katheter mit dem Drucksensor, um den Blutdruck zu überwachen.
  7. Schneiden Sie die Haut des Schwanzes (ca. 1,5 cm) und schneiden Sie dann mit einem Skalpell die oberflächliche Faszie der Schwanzarterie, um die Schwanzarterie freizulegen, die sich in der Mitte des Operationsfeldes befindet.
  8. Cannulatieren Sie die Schwanzarterie mit einem 22 G intravenösen Katheter. Ligieren Sie Arterie und Katheter mit einer 2-0-Seide (im Bereich der Kanülierung). Verwenden Sie kochsalzhaltiges Heparin (5 UI / ml), um den Katheter zu spülen, um Gerinnung zu vermeiden.
    HINWEIS: Bei der Kanülierung des intravenösen Katheters hält die linke Hand die Arterie / Vene mit einer Pinzette, und die rechte Hand durchbohrt die Arterie / Vene mit der Nadel im Katheter und führt dann die Kanüle in die Arterie ein.
  9. Schneiden Sie die Haut an der rechten Halsvene (ca. 2 cm) und trennen Sie dann den Muskel und das Gewebe, um die Vene freizulegen. Führen Sie einen 16 G hausgemachten intravenösen Multi-Öffnungskatheter in die rechte äußere Halsvene ein und legen Sie ihn vorsichtig in die rechte untere Hohlvene oder den rechten Vorhof.
    HINWEIS: Die linke Oberschenkelvene und Arterie befinden sich unter der Oberfläche der linken Leistenregion. Die Vene ist dicker als die Arterie und die Blutfarbe der Arterien ist leuchtend rot. Die rechte Halsvene befindet sich in der Mitte der rechten Halsregion; Wenn die Haut geschnitten und die Muskeln getrennt sind, ist die Vene zu sehen (ca. 0,3-0,4 cm breit). Wenn die Spitze des Katheters den rechten Vorhof berührt, schwankt die Blutdruckwelle. Dann, nachdem Sie den Katheter ein wenig zurückgezogen haben, befindet sich die Spitze des Katheters in der oberen Hohlvene.
  10. Verabreichen Sie Heparinnatrium (500 IE/kg) über die rechte äußere Vene. Bedecken Sie jeden kanülierten Bereich mit feuchter Gaze, um eine Kontamination zu vermeiden.
    HINWEIS: Stellen Sie eine Box unter den Operationstisch, um ihn um ca. 40 cm anzuheben.

3. DHCA-Initiierung

  1. Verbinden Sie zuerst den DHCA-Kreislauf mit dem Katheter in der Schwanzarterie und halten Sie die Durchflussrate der Pumpe bei 1-2 ml / min. Verbinden Sie dann das Reservoir mit dem Katheter in der rechten äußeren Halsvene. Stellen Sie sicher, dass sich immer ein Blutspiegel von ca. 1 cm im Reservoir befindet.
  2. Schalten Sie den Wassertank ein und stellen Sie zuerst die Wassertemperatur auf 37 °C ein.
  3. Nachdem der Blutdruck stabil ist, erhöhen Sie den Pumpenfluss vorsichtig auf 80-100 ml / kg / min, um das Blut zu pumpen.

4. Kühlung

  1. Stellen Sie die Raumtemperatur auf ca. 20 °C ein. Legen Sie Eiswürfel in Einweghandschuhe und legen Sie sie dann auf den Kopf und die Seiten der Ratte. Passen Sie die Temperatur des Tanks in Echtzeit entsprechend der Rektaltemperatur der Ratten an.
  2. Sammeln Sie 0,1 ml Blut aus der linken Oberschenkelarterie und legen Sie es zur Blutgasanalyse auf die Blutgasmaschine. Ändern Sie die relevanten Parameter des Beatmungsgeräts entsprechend den Ergebnissen der Blutgasanalyse (z.B. PaCO2).
    HINWEIS: Die Herzfrequenz und der Blutdruck können sich ändern, und die Durchflussrate der Pumpe sollte entsprechend angepasst werden. Der Temperaturgradient zwischen Wassertank und Ratte muss weniger als 10 °C betragen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur innerhalb von 30 Minuten auf 15-20 °C gesenkt werden kann. Der normale Bereich von PaCO2 beträgt 35-45 mmHg. Wenn die Blutgasergebnisse einen niedrigeren PaCO2 zeigen, kann man das Tidalvolumen verringern und umgekehrt.

5. Tiefer hypothermer Kreislaufstillstand

  1. Wenn die Rektaltemperatur auf 15-20 °C sinkt, wechseln Sie die Einweghandschuhe (eishaltig), um die Aufrechterhaltung einer tiefen Unterkühlung während des Kreislaufstillstands zu gewährleisten.
  2. Stoppen Sie die Rollenpumpe, halten Sie das Reservoir in Kontakt mit der Umgebung und lassen Sie das Blut langsam von der äußeren Halsvene zum Reservoir ab.
  3. Achten Sie auf die Blutdruckwellenform. Wenn der Blutdruck und die Herzschlagfrequenz 0 sind, stoppen Sie die Drainage und halten Sie das Reservoir geschlossen. Schalten Sie den Ventilator aus.
    HINWEIS: Die Dauer des Kreislaufstillstands variiert je nach Zweck des Experiments.

6. Aufwärmen und Reperfusion

  1. Ziehen Sie alle Einweghandschuhe aus und erhöhen Sie die Raumtemperatur auf 25 °C. Stellen Sie die Belüftung des Membranoxygenators wieder her, während der venöse Drainageschlauch abgeschnitten bleibt. Schalten Sie die Rollenpumpe ein, um sicherzustellen, dass das Blut im Reservoir langsam zum Körper der Ratte zurückfließt.
  2. Schalten Sie das Beatmungsgerät ein. Sobald der Blutspiegel im Reservoir bei 1 cm bleibt, lockern Sie den Drainageschlauch und lassen Sie das Blut langsam aus dem rechten Vorhof zum Reservoir ab.
  3. Schalten Sie die Heizlampe, das Heizkissen und den Wassertank ein. Stellen Sie zuerst die Temperatur des Wassertanks auf 25 ° C ein und passen Sie dann die Austrittstemperatur rechtzeitig an die Rektaltemperatur der Ratte an.
    HINWEIS: Die Heizlampe sollte auf die großen Blutgefäße in der Ratten-Brusthöhle gerichtet sein und in einem bestimmten Abstand gehalten werden, um ein Verbrennen des Gewebes zu vermeiden. Achten Sie auf die Temperaturdifferenz zwischen der Austrittstemperatur und der Rektaltemperatur der Ratte (<10 °C). Falls erforderlich, testen Sie das Blutgas, passen Sie dann die Beatmungsparameter entsprechend an und verabreichen Sie Bicarbonat, Elektrolyte usw.
  4. Entfernen Sie die Heizlampe, nachdem die Rektaltemperatur wieder 34 °C erreicht hat.
    HINWEIS: Dieser Schritt sollte als Fortsetzung des schnellen Wiedererwärmungsprozesses langsam sein. In diesem Stadium können die Geräteparameter des Sevofluran-Vaporizers, des mechanischen Beatmungsgeräts und der Rollenpumpe auf das Niveau zu Beginn des CPB zurückgesetzt werden.

7. Entwöhnung der CPB

  1. Reduzieren Sie langsam und allmählich den Durchfluss der Rollenpumpe und passen Sie die venöse Entwässerungsgeschwindigkeit an, bis die Durchflussrate auf 1 ml / min reduziert wird.
    HINWEIS: Jede Durchflusseinstellung sollte für 3-5 Minuten beobachtet werden.
  2. Halten Sie das Reservoir in Kontakt mit der Umgebung (indem Sie die Behälterkappe abnehmen). Gießen Sie das verbleibende Blut in den Kreislauf mit einer Flussrate von 1 ml / min.
  3. Stoppen Sie die Membranoxygenierung und die Walzenpumpe.
  4. Euthanasieren Sie die Ratte nach einer Zeit der mechanischen Beatmung unter tiefer Narkose.
    HINWEIS: Dies ist ein Terminalverfahren. Die Dauer zwischen der Entwöhnung der CPB und der Euthanasie variiert je nach den verschiedenen Studienprotokollen. Denken Sie daran, die Wunden mit Jod und Alkohol zu desinfizieren und dann jede kanülierte Region mit feuchter Gaze zu bedecken, um eine Kontamination vor der Euthanasie zu vermeiden. Erhöhen Sie die Ausgangskonzentration von Sevofluran, um die Anästhesietiefe zu erhöhen.

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Ergebnisse

Als Kontrollgruppe zeigten die Normaltemperatur-CPB-Ratten (NtCPB) ohne Kreislaufstillstand während des gesamten Verfahrens einen stabilen mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) und eine stabile Körpertemperatur, während der MAP der DHCA-Ratten während des Herzstillstands abnahm (p < 0,01, Abbildung 3A). Die Temperatur der DHCA-Ratten sank während der Abkühlphase schnell und erholte sich allmählich während der Wiedererwärmungsphase. Beim Absetzen der Ratten aus den DHCA-Kreisläufe...

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Diskussion

Kanülierung ist das grundlegendste Verfahren zur Etablierung von DHCA bei Ratten. Vor der Kanülierung erleichtert das Einweichen der Arterie mit 0,5 ml 2% Lidocain die Kanülierung. Nach der Kanülierung ist eine Heparinisierung mit 500 I.E./kg Heparin über die Vena jugularis externa notwendig, um eine Mikrothrombusbildung zu vermeiden17. Wir haben wiederholt festgestellt, dass diese Dosis von Heparin das Ziel einer aktivierten Gerinnungszeit (ACT) >480 s erreichen kann. Die Wiedererwärmung...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Liang Zhang für die Hilfe bei der Sammlung der Videodaten während des Experiments. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen: 82070479) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (Fördernummer: 3332022128) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
WärmetauscherXi' an Xijing Medical Appliance Co., LtdAnimal-M
MembranoxygenatorDongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd.Micro-M
MonitorChengdu Techman Co., LtdBL-420s
RollenpumpeChangzhou Prefluid Technology Co., LtdBL100
SD RatHFK Bioscience Co., Ltd./
SevofluranMaruishi Pharmaceutical Co. LtdH20150020
RasiererHangzhou Huayuan Pet Products Co., Ltd./
VerdampferSPACECABS/
BeatmungsgerätShanghai Alcott Biotech Co., LtdALC-V8S
WassertankMaquet Critical Care ABJostra HCU20-600

Referenzen

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