Beurteilung der mechanischen Empfindlichkeit des Rückens bei der Ratte zur mechanistischen Untersuchung chronischer Rückenschmerzen

Rückenschmerzen sind weltweit die häufigste Ursache für Behinderungen, die dramatische persönliche, wirtschaftliche und soziale Folgen haben 1,2,3,4. Jedes Jahr sind ca. 37% der Bevölkerung von LBP⁵ betroffen. LBP verschwindet in der Regel innerhalb weniger Wochen, tritt jedoch bei 24 % bis 33 % der Personen wieder auf und wird in 5 % bis 10 % der Fälle chronisch². Um die Mechanismen und Auswirkungen von LBP sowie die Auswirkungen verschiedener therapeutischer Interventionen zu verstehen, wurden mehrere Tiermodelle von LBP verwendet, die klinische Bedingungen oder einige Komponenten von LBP⁶ nachahmen. Diese Maus- und Rattenmodelle können in eine oder mehrere der folgenden Kategorien eingeteilt werden: (1) diskogener LBP^7,8,, (2) radikulärer LBP 8,9,10,11, (3) Facettengelenksarthrose 12 und (4) muskelinduzierter LBP^13,14 . Da der Schmerz bei nicht-menschlichen Spezies nicht direkt gemessen werden kann, wurden zahlreiche Tests entwickelt, um schmerzähnliche Verhaltensweisen in diesen Modellen zu quantifizieren⁸. Diese Tests bewerten Verhaltensweisen, die durch einen schädlichen Reiz hervorgerufen werden (mechanische Kraft 15,16,17, thermische Stimulation 18,19,20,21,22,23,24,25) oder spontan erzeugt ^{werden 26,27,28,29}.

Zu den Methoden, bei denen mechanische Reize verwendet werden, gehören der Von-Frey-Test ^15,16 und der Randall-Selitto-Test¹⁷. Zu den Methoden, die Wärmereize verwenden, gehören der Tail-Flick-Test¹⁸, der Heizplattentest¹⁹, der Hargreaves-Test²⁰ und der Thermosondentest²¹. Zu den Methoden, die kalte Stimuli verwenden, gehören der Cold-Plate-Test²², der Aceton-Verdampfungstest 23 und der kalte Plantar-Assay²⁴. Methoden für spontane Verhaltensweisen umfassen die Grimassenskala 26, das Graben²⁷, die Gewichts- und Ganganalyse 28 sowie eine automatisierte Verhaltensanalyse²⁹. Trotz dieser zahlreichen verfügbaren Tests ist keiner von ihnen speziell für Rückenschmerzmodelle konzipiert.

Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen und zugänglichen Test zur Beurteilung der mechanischen Empfindlichkeit im Rücken von Ratten zu entwickeln. Die Technik basiert weitgehend auf dem Von-Frey-Test, der auf die Plantaroberfläche der Hinterpfote^{angewendet wird 15,16}. Das Grundprinzip des Von-Frey-Tests besteht darin, eine Reihe von Monofilamenten in der interessierenden Region zu verwenden, die konstante vorbestimmte Kräfte liefern. Eine Reaktion gilt als positiv, wenn die Ratte ein nozifensives Verhalten zeigt. Der mechanische Schwellenwert kann dann basierend auf den Filamenten berechnet werden, die Reaktionen hervorgerufen haben. In der vorliegenden Studie wird eine einfache und zugängliche Methode zur Verfügung gestellt, die vom Von-Frey-Test adaptiert wurde, um die mechanische Empfindlichkeit im Rücken von Ratten zu bestimmen.

Das Versuchsprotokoll wurde vom Tierpflegeausschuss der Université du Québec à Trois-Rivières genehmigt und entsprach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und den Richtlinien des Ausschusses für Forschung und ethische Fragen der International Association for the Study of Pain (IASP). In der vorliegenden Studie wurden sechs männliche Wistar-Ratten (Körpergewicht: 320-450 g; Alter: 18-22 Wochen) verwendet. Die Tiere stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die Daten dieser Ratten stammen aus der größeren Stichprobe einer früheren Studie³⁰.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Unterbringung der Tiere in einem temperaturkontrollierten Raum in Standard-Tiereinrichtungen mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h bis 10 h. Stellen Sie sicher, dass alle Tiere am Tag der Versuche bei guter Gesundheit sind.
2. Generieren Sie das Tiermodell für chronische Rückenschmerzen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Um chronische Rückenschmerzen zu induzieren, führen Sie eine intramuskuläre Injektion von Complete Freund Adjuvant (CFA) in die Rückenmuskulatur gemäß den vorherigen Berichten 14,30,31 durch.
   2. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran (4% für die Induktion und 2%-2,5% für die Erhaltung).
   3. Injizieren Sie mit einer 27-G-Nadel 150 μl einer gebrauchsfertigen Wasser-in-Öl-Emulsion von CFA (siehe Materialtabelle) je nach Protokollanforderungen einseitig oder bilateral in die paraspinalen Muskeln.
   4. Halten Sie die Injektionsnadel nach Abschluss der Injektion mindestens 3 Minuten lang an Ort und Stelle. Verwenden Sie für Tiere in der Kontrollgruppe die gleichen Verfahren³⁰, injizieren Sie jedoch eine Lösung steriler physiologischer Kochsalzlösung (150 μl, 0,9%) anstelle von CFA.
3. Stellen Sie den Testkäfig her.
   1. Stellen Sie einen Testkäfig für zwei Tiere her, der für jedes Tier eine Kammer umfasst.
      ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie hat jede Kammer die folgenden Abmessungen: Länge x Breite x Höhe: 50 x 20 x 7 cm (siehe Materialtabelle).
   2. Montieren Sie die beiden zusammenhängenden Kammern auf vier 33 cm langen Plexiglasbeinen. Verwenden Sie transparentes Plexiglas für die Wände der Kammern, aber verwenden Sie schwarzes Plexiglas, um die Kammern zu trennen, um zu verhindern, dass sich die Tiere sehen.
   3. Verwenden Sie ein Edelstahlgitter aus 1 mm Draht mit einem Abstand von 8 mm zwischen den Drähten, um den Boden und die Decke des Prüfkäfigs herzustellen (Abbildung 1).

2. Test der mechanischen Empfindlichkeit (BMS)

1. Machen Sie das Tier vor dem ersten Test 30 min/Tag an 5-7 aufeinanderfolgenden Tagen mit dem Testkäfig vertraut. Wiederholen Sie den Test nach Bedarf.
2. Betäuben Sie die Tiere mit 2% Isofluran³¹ (siehe Materialtabelle).
3. Rasieren Sie in Bauchlage unter Isofluran-Anästhesie das Rückenhaar des interessierenden Bereichs (von T6 bis L6 Wirbelebene) mit einem Tierhaarschneider (siehe Materialtabelle). Rasieren Sie bei wiederholten Messungen die Rückenhaare alle 3 Tage an einem Tag ohne Verhaltensbewertung, um sicherzustellen, dass die Reize immer direkt auf die Haut aufgetragen werden. Zeichnen Sie mit einem Permanentmarker eine schwarze Markierung auf die Haut, um sicherzustellen, dass die Filamente immer auf die gleiche Stelle aufgetragen werden, wenn der Test an verschiedenen Tagen wiederholt wird.
4. Setzen Sie die Tiere am Testtag vor dem Test für 15 bis 30 Minuten in den Testkäfig, bis sich das Tier beruhigt hat.
5. Tragen Sie während des Tests Von-Frey-Filamente (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 und 26 g) senkrecht auf den Rücken auf, wobei immer mit dem 2-g-Filament beginnen und die Up-Down-Methode¹⁵ verwendet wird (siehe Materialtabelle). Nähern Sie sich dem Rücken des Tieres langsam mit dem Filament hinter dem Tier.
   1. Tragen Sie das Filament nur auf, wenn das Tier wach ist, auf seinen vier Pfoten steht und sich nicht bewegt. Tragen Sie das Filament alle 15-30 s beidseitig für 2 s auf den interessierenden Bereich auf, 10 mm vom Dornfortsatz entfernt (Abbildung 2).
      HINWEIS: Eine Reaktion gilt als positiv, wenn das Tier während oder unmittelbar nach dem Auftragen des Filaments eines oder mehrere der folgenden Verhaltensweisen zeigt: (1) Muskelzuckungen, (2) Wölbung (Rückenstreckung), (3) Drehung des Halses, um auf den Rücken zu schauen, (4) Kratzen oder Lecken des Rückens und (5) Flucht.
6. Wie zuvor beschrieben¹⁵, wenn beim Anlegen eines Filaments keine Reaktion beobachtet wird, wird das nächste Filament mit einer höheren Kraft in der Reihe angewendet. Wenn eine Reaktion beobachtet wird, verwenden Sie das nächste Filament mit einer geringeren Kraft in der Reihe. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis nach der ersten Verhaltensänderung vier Messwerte erhalten werden (Antwort nach einer Reihe von "keine Antwort" oder keine Antwort nach einer Reihe von "Reaktionen").
7. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, berechnen Sie den Wert, der 50% des mechanischen Schwellenwerts entspricht, wie von Chaplan et ^al.15 beschrieben, mit dieser Formel:
   50%-Schwellenwert (g) = 10^(Xf+kδ)/10 000
   HINWEIS: In dieser Formel ist "Xf" die Griffmarke des letzten von Frey-Filaments, das verwendet wurde. "k" ist der tabellarische Wert, der auf dem Antwortmuster¹⁵ des Tieres basiert, und "δ" ist der Mittelwert der Handle-Mark-Inkremente zwischen den Von-Frey-Filamenten. Abhängig vom Versuchsdesign und den experimentellen Anforderungen kann nur eine Seite der Wirbelsäule bewertet werden, um einen Schwellenwert zu melden, oder es können zwei Seiten bewertet werden, und die Schwellenwerte werden separat oder als Mittelwert angegeben. Siehe Ergänzende Tabelle 1 für die Berechnungsvorlage³².

3. Verwertung der Tiere

1. Nachdem die intramuskuläre Injektion abgeschlossen ist, brechen Sie die Anästhesie ab und legen Sie das Tier zur Genesung allein in einen Standardkäfig.
2. Untersuchen Sie während der Erholungsphase das Verhalten des Tieres und lassen Sie es nicht unbeaufsichtigt.
3. Vergewissern Sie sich, dass sich das Tier von der Narkose erholt und sich innerhalb von 5 Minuten normal bewegt. Bringen Sie das Tier dann mit den anderen Tieren in seinen gewohnten Käfig zurück.
   HINWEIS: Am Ende des Experiments wird das Tier unter tiefer Isofluran-Anästhesie (5%) mit einer 10% igen Formalinlösung durch das Herz perfundiert. Die Rückenmuskulatur im injizierten Bereich wird dann zur Histologie und Bestätigung von entzündlichen Veränderungen extrahiert.

Die Methode wurde in einer früheren Studie verwendet, in der vollständige Daten und Statistiken vorgelegt wurden, um die mechanische Empfindlichkeit zwischen CFA und Kontrollrattenzu vergleichen 30. Repräsentative Einzeldaten (Mittelwert der linken und rechten Schwellenwerte) von sechs Ratten, die in die vorherige Studie eingeschlossen wurden, sind in Abbildung 3 und Tabelle 1 dargestellt. Zu Studienbeginn war die mechanische Empfindlichkeit zwischen den Gruppen ähnlich. Die intramuskuläre Injektion von CFA in die Lendenmuskulatur führte zu einem deutlichen Anstieg der mechanischen Empfindlichkeit (verringerte Schwelle) von 7 Tagen auf 28 Tage nach der CFA-Injektion. Im Gegensatz dazu zeigten die Kontrollratten (CTL) diese Veränderung nicht. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurde eine Variabilität innerhalb und zwischen den Tieren beobachtet, wie es bei dieser Art der Verhaltensbewertung zu erwarten war. Überempfindliche CFA-Ratten zeigten jedoch eine verminderte Variabilität. Basierend auf der vorherigen Studie 30 reichen 16 Tiere (8 CFA und 8 CTL) aus, um einen signifikanten Effekt zwischen den Gruppen über die Zeit (η2p = 0,38) für 5 Zeitpunkte zu erkennen.

In dieser Studie wurde das Vorliegen chronisch entzündlicher Veränderungen in den Muskeln, denen CFA injiziert wurde, durch eine histologische Untersuchung bestätigt (Abbildung 4)30. Außerdem wurde neben dem Rücken auch eine mechanische Überempfindlichkeit an der Hinterpfote mit einem Standard-Von-Frey-Test beobachtet (Abbildung 5)30. In früheren Studien mit dem gleichen Rückenschmerzmodell zeigten wir ein erhöhtes spontanes Schmerzverhalten und neuroinflammatorische und neurophysiologische Veränderungen14,31. Tatsächlich war das Leckverhalten bei CFA im Vergleich zu Kontrollratten während des Formalintests erhöht, und die Reaktionen einzelner Einheiten auf eine schädliche Stimulation des Ischiasnervs waren in der rechten Amygdala verändert31. Darüber hinaus war die NF-kB-Proteinexpression im Rückenmark von CFA im Vergleich zu Kontrollratten erhöht14. Zusammen validieren die Ergebnisse dieser Studien dieses Modell für chronische Rückenschmerzen, und die vorliegende Studie zeigt visuell, wie das Vorhandensein einer mechanischen Überempfindlichkeit im Rücken dieses Rattenmodells bestätigt werden kann.

Abbildung 1: Prüfkäfig mit mechanischer Empfindlichkeit (BMS) zurück. (A) Schematische Darstellung des Prüfkäfigs. b) Maßgefertigter Versuchskäfig mit zwei Kammern, eine für jedes Tier. (C) Seitenansicht des Prüfkäfigs mit einer Ratte in einer der Kammern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bewertung der mechanischen Empfindlichkeit des Rückens. Der Experimentator nähert sich dem Tier von hinten und appliziert das Von-Frey-Filament auf den interessierenden Bereich, 10 mm seitlich vom Dornfortsatz entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Einzelne Beispiele für die mechanische Empfindlichkeit des Rückens. Mechanische Rückenempfindlichkeit bei CFA- und Kontrollratten (CTL) zu Studienbeginn und 7, 14, 21 bzw. 28 Tage nach der intramuskulären Injektion von CFA bzw. Kochsalzlösung. Einzelne Daten werden durch graue (CTL) und schwarze (CFA) gefüllte Kreise dargestellt. Horizontale Balken zeigen die Mittelwerte an. Fehlerbalken bezeichnen den Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Histologische Bestätigung einer chronischen Muskelentzündung. Einzelbeispiele für Rückenmuskeln von CFA-Ratten und Kontrollen30. (A) Gesunder Rückenmuskel von einer Kontrollratte 14 Tage nach intramuskulärer Injektion von Kochsalzlösung. (B-C) Die Rückenmuskulatur von zwei CFA-behandelten Ratten zeigte 14 Tage nach der intramuskulären CFA-Injektion eine chronische Entzündung mit einer deutlichen Leukozyteninfiltration. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde zum Färben der Muskelscheiben verwendet. Maßstabsbalken = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Mechanische Überempfindlichkeit bei CFA-Ratten30. Zeitlicher Verlauf der mechanischen Empfindlichkeit über 4 Wochen, entweder nach CFA (n = 8) oder Kochsalzlösung (n = 8) Injektion in die Rückenmuskulatur (L5-L6-Spiegel). (A-B) Mechanische Empfindlichkeit unter den linken und rechten Hinterpfoten. Die mechanischen Schwellenwerte reduzierten sich im Vergleich zu Kontrollratten (P < 0,01) im Laufe der Zeit signifikant. Dieser Effekt unterschied sich nicht signifikant zwischen linken und rechten Hinterpfoten (P = 0,7). Für beide Hinterpfoten zusammen zeigte der Tukey-HSD-Test niedrigere mechanische Schwellenwerte bei CFA im Vergleich zu Kontrollratten, von 1 Woche bis 4 Wochen nach der Injektion (alle P < 0,03). Zeitverläufe für einzelne Hinterpfoten werden nur zur Veranschaulichung dargestellt (Interaktion nicht signifikant, siehe Ergebnisse für Details). (C-D) Mechanische Empfindlichkeit im Rücken. Die mechanischen Schwellenwerte reduzierten sich bei CFA im Vergleich zu Kontrollratten (P < 0,001) im Laufe der Zeit signifikant. Dieser Effekt unterschied sich nicht signifikant zwischen den linken und rechten Beurteilungsstellen (P = 0,3). Für die linke und rechte Bewertungsstelle zusammen zeigte der Tukey-HSD-Test einen niedrigeren mechanischen Schwellenwert bei CFA im Vergleich zu Kontrollratten von 1 Woche bis 4 Wochen nach der Injektion (alle P's < 0,05). Zeitverläufe für einzelne Hinterpfoten werden nur zur Veranschaulichung dargestellt (Interaktion nicht signifikant, siehe Ergebnisse für Details). In Panel (D) sind die individuellen Daten einer CFA-Ratte zu Illustrationszwecken nicht zu Illustrationszwecken am Ausgangswert (9,6 g) dargestellt. Schattierte Bereiche stellen die Basisbewertung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Einzelne Beispiele für die mechanische Empfindlichkeit des Rückens bei CFA- und Kontrollratten.

Ergänzende Tabelle 1: Bestimmung der mechanischen Schwelle. Diese Vorlagentabelle wird verwendet, um den mechanischen Schwellenwert zu berechnen. Das Muster der Antworten (X/O) wird notiert, und die für die Berechnung erforderlichen Werte werden nur für Xf und k eingegeben, entsprechend der Griffmarkierung des letzten Filaments, das für den Test verwendet wurde, und dem k-Wert, der dem Antwortmuster zugeordnet ist, in diesem Fall XX gefolgt von OOXXO. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen oder Beziehungen bestehen, die zu Interessenkonflikten führen können.