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Summary

Das vorliegende Protokoll skizziert eine Methode, die Luzifergelb in einem apikalen enteroiden Modell verwendet, um die Darmpermeabilität zu bestimmen. Diese Methode kann verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität in Enteroiden zu bestimmen, die entzündliche Darmerkrankungen wie nekrotisierende Enterokolitis modellieren.

Abstract

Enteroide sind ein aufstrebendes Forschungsinstrument bei der Untersuchung entzündlicher Darmerkrankungen wie nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Sie werden traditionell in der basolateralen (BO) Konformation angebaut, wo die apikale Oberfläche der Epithelzelle dem inneren Lumen zugewandt ist. In diesem Modell ist der Zugang zur luminalen Oberfläche von Enteroiden für Behandlung und Experimente eine Herausforderung, was die Fähigkeit zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen einschränkt. Um dies zu umgehen, wurde ein neonatales apikales Out-Modell (AO) für nekrotisierende Enterokolitis erstellt. Da Veränderungen der Permeabilität von Darmepithelzellen für NEC pathognomonisch sind, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Lucifergelb (LY) als Marker für parazelluläre Permeabilität. LY durchquert die intestinale Epithelbarriere über alle drei wichtigen parazellulären Signalwege: Pore, Leck und uneingeschränkt. Die Verwendung von LY in einem AO-Modell ermöglicht eine breitere Untersuchung der Permeabilität in NEC. Nach IRB-Genehmigung und elterlicher Zustimmung wurden chirurgische Proben von Darmgewebe von menschlichen Frühgeborenen gesammelt. Darmstammzellen wurden durch Kryptenisolierung gewonnen und zum Züchten von Enteroiden verwendet. Enteroide wurden bis zur Reife gezüchtet und dann AO transformiert oder in BO-Konformation belassen. Diese wurden entweder nicht behandelt (Kontrolle) oder mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelt und hypoxischen Bedingungen zur Induktion von in vitro NEC ausgesetzt. LY wurde verwendet, um die Permeabilität zu beurteilen. Immunfluoreszenzfärbung des apikalen Proteins Zogula occludens-1 und des basolateralen Proteins β-Catenin bestätigte die AO-Konformation. Sowohl AO- als auch BO-Enteroide, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine signifikant erhöhte parazelluläre Permeabilität. Sowohl AO- als auch BO-Enteroide zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine erhöhte Aufnahme von LY in das Lumen der behandelten Enteroide. Die Verwendung von LY in einem AO-Enteroidmodell ermöglicht die Untersuchung aller drei Hauptwege der parazellulären Permeabilität. Es ermöglicht auch die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen und wie sich dies auf die Permeabilität im Vergleich zum BO-Enteroid-Modell auswirken kann.

Introduction

Enteroide sind dreidimensionale (3D) Strukturen, die von organbeschränkten menschlichen Darmstammzellen abgeleitet^{sind 1,2}. Sie bestehen vollständig aus epithelialen Linien und enthalten alle differenzierten Darmepithelzelltypen². Enteroide behalten auch die zelluläre Polarität bei, die aus einer apikalen luminalen Oberfläche besteht, die ein inneres Kompartiment bildet, und einer basolateralen Oberfläche, die dem umgebenden Medium zugewandt ist. Enteroide sind ein einzigartiges Modell, da sie die Eigenschaften des Wirts bewahren, aus dem sie erzeugt wurden³. Daher stellen Enteroide, die von Frühgeborenen erzeugt werden, ein Modell dar, das für die Untersuchung von Krankheiten nützlich ist, die hauptsächlich diese Population betreffen, wie z.B. nekrotisierende Enterokolitis (NEC).

Das traditionelle enteroide Modell wird in einer basolateralen Out-Konformation (BO) gezüchtet, bei der das Enteroid in einer Kuppel aus Basalmembranmatrix (BMM) eingeschlossen ist. BMM induziert das Enteroid, eine 3D-Struktur mit der basolateralen Oberfläche auf der Außenseite aufrechtzuerhalten. BO-Enteroide sind ein geeignetes Modell für NEC, das die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) primären menschlichen Zelllinien und in vivo Tiermodellen schließt ^2,4. NEC wird in Enteroiden induziert, indem Krankheitserreger wie LPS oder Bakterien in die die Enteroide umgebenden Medien eingebracht werden, gefolgt von einer Exposition gegenüber hypoxischen Bedingungen ^2,3. Die Herausforderung beim BO-enteroiden NEC-Modell besteht darin, dass es keine effektive Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen ermöglicht, die an der apikalen Oberfläche in vivo auftreten. Veränderungen der intestinalen Permeabilität sind auf diese Wirt-Pathogen-Interaktionen zurückzuführen. Um besser zu verstehen, wie sich die Permeabilität auf die pathophysiologischen Grundlagen von Krankheiten auswirkt, muss ein Modell erstellt werden, das die Behandlung der apikalen Oberfläche beinhaltet.

Co et al. waren die ersten, die zeigten, dass reife BO-Enteroide dazu gebracht werden können, eine apikale Out-Konformation (AO) zu bilden, indem die BMM-Kuppeln entfernt und in Medien resuspendiert^{werden 5}. Dieser Artikel zeigte, dass AO-Enteroide die korrekte epitheliale Polarität beibehielten, alle Darmzelltypen enthielten, die intestinale Epithelbarriere aufrechterhielten und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglichten⁵. Die Verwendung von AO-Enteroiden als NEC-Modell erreicht eine physiologische Reproduktion des Krankheitsprozesses und die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen.

Ein wesentlicher Beitrag zur Pathophysiologie von NEC ist eine erhöhte Darmpermeabilität⁶. Mehrere Moleküle wurden vorgeschlagen, um die Darmpermeabilität in vitro⁷ zu testen. Unter diesen ist Lucifergelb (LY) ein hydrophiler Farbstoff mit Anregungs- und Emissionspeaks bei 428 nm bzw. 540 nm⁸. Da es alle wichtigen parazellulären Signalwege durchquert, wurde es verwendet, um die parazelluläre Permeabilität in verschiedenen Anwendungen zu bewerten, einschließlich der Blut-Hirn- und Darmepithelbarrieren ^8,9. Die traditionelle Anwendung von LY verwendet Zellen, die in Monoschichten auf einer semipermeablen Oberfläche¹⁰ gezüchtet werden. LY wird auf die apikale Oberfläche aufgetragen und durchquert parazelluläre Tight-Junction-Proteine, um sich auf der basolateralen Seite zu versammeln. Höhere LY-Konzentrationen im basolateralen Kompartiment deuten auf eine verminderte Tight Junction-Proteine mit anschließendem Abbau der intestinalen Epithelzellbarriere und eine erhöhte Permeabilität hin¹⁰. Es wurde auch in 3D-BO-Enteroidmodellen beschrieben, bei denen LY zu den Medien hinzugefügt wurde und einzelne Enteroide für die Aufnahme von LY in das Lumen^{abgebildet wurden 11}. Obwohl dies eine qualitative Analyse über die Visualisierung der LY-Aufnahme ermöglicht, ist die quantitative Analyse begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Technik, die LY verwendet, um die parazelluläre Permeabilität unter Verwendung eines in vitro NEC enteroiden Modells in AO-Enteroiden unter Beibehaltung der 3D-Orientierung zu bewerten. Diese Methode kann sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Analyse der Permeabilität verwendet werden.

Protocol

Die vorliegende Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung des Institutional Review Board (IRB, #11610, 11611) an der University of Oklahoma durchgeführt. Vor der Entnahme menschlicher chirurgischer Proben gemäß den IRB-Spezifikationen war die Zustimmung der Eltern erforderlich. Nach IRB-Genehmigung und elterlicher Zustimmung wurde menschliches Dünndarmgewebe von Säuglingen (korrigiertes Gestationsalter (GA) im Bereich von 36-41 Wochen zum Zeitpunkt der Probenentnahme, alle mit einer Vorgeburtsgeschichte bei einer geschätzten GA von 25-34 Wochen, 2: 1 M: F) gewonnen, die sich einer Operation für NEC oder andere Darmresektionen wie Stomaentfernung oder Atresiereparatur unterziehen. Enteroide wurden aus Gewebe erzeugt, das entweder aus dem Jejunum oder dem Ileum gewonnen wurde.

1. Enteroide Kulturen von Menschen aus Säuglingen: Kryptenisolierung und Beschichtung aus dem gesamten Gewebe

1. Bereiten Sie Kulturmedien, Chelatbildpuffer #1 und Chelatbildpuffer #2 (Tabelle 1) nach dem vorherigen Bericht^{vor 4}. Lagern Sie Chelatpuffer bei 4 °C und verbrauchen Sie sie innerhalb von 48 Stunden.
2. Bereiten Sie menschliche Minigutmedien vor (Tabelle 1). Lagern Sie die Brühe bei −20 °C und erwärmen Sie sie vor Gebrauch in einem 37 °C warmen Wasserbad.
3. Bereiten Sie 50% L-WRN konditionierte Medien (CM) vor (Tabelle 1). Lagern Sie den Vorrat bis zu 1 Woche bei 4 °C.
   HINWEIS: 100% L-WRN-Basis für die konditionierten Medien wird in einem Protokoll von Miyoshi et ^al.12 beschrieben.
4. Generieren Sie Enteroide aus Dünndarmgewebeproben, die aus chirurgischen Proben nach dem vorherigen Bericht⁴ gewonnen wurden. Plate vier Wells von Enteroiden in einer 24-Well-Platte aus einem 0,75-2,5 g Stück Darmgewebe.
   HINWEIS: Enteroide können erfolgreich aus Gewebe erzeugt werden, das in 30 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4 °C für bis zu 48 h gelagert wird.
5. Stellen Sie die 24-Well-Platte für 15-20 min kopfüber in einen 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} , um die Polymerisation der BMM-Kuppeln⁴ zu ermöglichen.
6. Fügen Sie 500 μL 50% L-WRN CM (wie in Schritt 1.3 beschrieben) mit 0,5 μL Y-27632, ROCK-Inhibitor (RI, siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung hinzu. Nach 2-3 Tagen durch 50% L-WRN CM ohne RI ersetzen.

2. Erzeugung von AO-Enteroiden

1. Züchten Sie Enteroide, die in BMM eingebettet sind, für 7-10 Tage mit 50% L-WRN CM⁴.
2. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 500 μL Zellwiederherstellungslösung (CRS, siehe Materialtabelle) in eine Vertiefung. Schaben Sie die Kuppel ab, pipetten Sie mehrmals auf und ab und fügen Sie dann die CRS / Enteroid / BMM-Lösung in die nächste Vertiefung hinzu.
3. Schaben Sie die Kuppel ab, pipetten Sie mehrmals auf und ab und legen Sie die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 500 μL CRS in die zweite Vertiefung, pipettieren Sie nach oben und unten und fügen Sie es dann in die erste Vertiefung hinzu. Diese Lösung wird in dasselbe 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.3 und bündeln Sie zwei Vertiefungen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, bis sich der gesamte Bohrlochinhalt in CRS befindet.
   HINWEIS: Mehr als zwei Vertiefungen können in einem größeren konischen 15-ml-Rohr zusammengefasst werden, wenn große Mengen an AO-Enteroiden erzeugt werden. Die Aufrechterhaltung eines CRS-Pro-Well-Verhältnisses von 500 μL ist wichtig, um eine vollständige Solubilisierung von BMM zu gewährleisten.
5. Die Mikrozentrifugenröhrchen (Schritt 2.3) mit gepoolter CRS/Enteroid-/BMM-Lösung für 1 h bei 4 °C auf einen Rotator legen, um das BMM aufzulösen.
6. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 200 x g für 3 min bei 4 °C, entfernen Sie dann den Überstand mit einer Mikropipette und lassen Sie das Pellet zurück.
7. Resuspendieren Sie das enteroide Pellet in 1 ml 50% L-WRN CM (wie in Schritt 1.3 hergestellt) pro Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig 500 μL der resuspendierten enteroiden/Medienlösung in jede Vertiefung der extrem niedrig angesetzten 24-Well-Gewebekulturplatten (siehe Materialtabelle).
8. Bei 37 °C mit 5% CO₂ für 3 Tage vor dem Versuch inkubieren.

3. Verifizierung der AO-Enteroidkonformation durch Ganzmontage-Immunfluoreszenzfärbung

1. Nach der Inkubation der Enteroide in Mediensuspension für 3 Tage pipetten Sie die enteroide / Mediensuspension von einer Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Zentrifugieren Sie die enteroide/Mediensuspension bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
3. Resuspendieren Sie die Enteroide in 20 μL BMM. 10 μL enteroide Suspension werden auf einen Objektträger pipettiert und in einer dünnen Schicht von ca. 1 cm x 1 cm Quadrat verteilt. Wiederholen Sie den Vorgang mit den restlichen 10 μL enteroider Suspension auf einem separaten Teil desselben Objektträgers, so dass zwei Abstriche mit enteroider / BMM-Suspension vorhanden sind.
4. Lassen Sie die enteroiden/BMM-Abstriche bei Raumtemperatur (RT) für 15 min erstarren.
5. Arbeiten Sie im Abzug, legen Sie den Objektträger in ein Färbeglas und füllen Sie ihn mit 4% Paraformaldehyd, bis er den enteroiden / BMM-Abstrich bedeckt (~ 30 ml für einen Objektträger, wenn ein Glasfärbeglas mit 10 Objektträgern verwendet wird). Lassen Sie 30 Minuten (bei Raumtemperatur) für die Fixierung stattfinden.
   ACHTUNG: 4% Paraformaldehyd ist gefährlich und kann Augenschäden/-reizungen, Hautreizungen und Krebs verursachen. Arbeiten Sie immer unter einem Abzug, wenn Sie es verwenden. Tragen Sie beim Umgang Schutzhandschuhe und persönliche Schutzausrüstung. Entsorgen Sie es in einem zugelassenen Abfallbehälter.
6. Entsorgen Sie 4% Paraformaldehyd in einem geeigneten Abfallbehälter. Fügen Sie 30 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das Färbeglas oder bis PBS die enteroiden / BMM-Abstriche bedeckt. Lassen Sie es 3 Minuten bei RT ruhen und entsorgen Sie dann das PBS in der Paraformaldehyd-Abfallflasche. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male für insgesamt drei Waschgänge.
7. Füllen Sie ein neues Färbeglas mit 30 ml 0,5% Triton X-100, verdünnt in PBS. Legen Sie den Objektträger mit enteroiden / BMM-Abstrichen in die Triton-Lösung und lassen Sie ihn 20 Minuten bei RT permeabilisieren.
8. Verwerfen Sie das 0,5% Triton X-100 verdünnt in PBS. Geben Sie 30 ml PBS in das Färbeglas und lassen Sie es 3 Minuten ruhen. Verwerfen Sie den PBS durch Dekantieren.
9. Wischen Sie den Objektträger vorsichtig um die enteroiden / BMM-Abstriche herum und achten Sie darauf, sie nicht zu stören. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift (Barriere-PAP-Stift, siehe Materialtabelle) einen Kreis um jeden der enteroiden/BMM-Abstriche. Stellen Sie ein 20%iges Serum her, spezifisch für das Tier, bei dem der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde (siehe Materialtabelle).
10. Legen Sie den Objektträger flach auf den Labortisch. Blockieren Sie den Objektträger für 1 h bei 4 °C, indem Sie 100 μL spezifisches 20%iges Serum aus Schritt 3.9 auf jeden der enteroiden/BMM-Abstriche pipettieren, die vom hydrophoben Barrierestift umgeben sind.
11. Es wird eine 100-μL-Lösung mit 1:100 bzw. 1:200 Verdünnungen von β-Catenin- bzw. ZO-1-Primärantikörpern, verdünnt in PBS, hergestellt.
    HINWEIS: Jeder primäre Antikörper muss von einem anderen Tier stammen, um sicherzustellen, dass sie bei der Abbildung unterschiedliche Immunfluoreszenzkanäle aufweisen. Die vorliegende Studie verwendet einen Maus-β-Catenin-Antikörper und einen Kaninchen-ZO-1-Antikörper (siehe Materialtabelle).
12. Tippen Sie auf den Objektträger auf der Theke, um das 20% Serum zu entfernen und vorsichtig trocken zu wischen, wobei Sie darauf achten, die enteroiden / BMM-Abstriche nicht zu stören. 100 μL β-Catenin/ZO-1-Primärantikörperlösung werden auf einen der enteroiden/BMM-Abstriche pipettiert. Pipettieren Sie 100 μL PBS ohne primären Antikörper als Negativkontrolle auf den anderen enteroiden/BMM-Abstrich.
13. Legen Sie den Boden eines Kunststoffbehälters mit einem nassen Papiertuch aus, um einen befeuchteten Behälter zu erstellen. Legen Sie den Objektträger in den Behälter und achten Sie darauf, die Lösungen, die die enteroiden / BMM-Abstriche bedecken, nicht zu stören. Setzen Sie den Deckel auf den Behälter, um ihn zu verschließen, und lagern Sie ihn über Nacht flach bei 4 °C.
    HINWEIS: Lassen Sie das Objektträger nicht austrocknen. Stellen Sie sicher, dass der Behälter geschlossen ist, um Austrocknung zu vermeiden.
14. Sobald Sie bereit sind, fortzufahren, tippen Sie auf den Objektträger auf der Theke, um primäre Antikörper und PBS aus den enteroiden / BMM-Abstrichen zu entfernen.
15. Führen Sie einen Waschschritt durch, indem Sie den Objektträger in ein Färbeglas legen und mit 30 ml PBS füllen oder bis PBS die enteroiden / BMM-Abstriche bedeckt. Lassen Sie es 3 min bei Raumtemperatur ruhen. Verwerfen Sie das PBS und wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal für insgesamt drei Waschgänge.
16. Bereiten Sie 200 μL sekundäre Antikörper für zwei verschiedene Immunfluoreszenzkanäle vor, wobei jeder Antikörper eine Verdünnung von 1:1000 in PBS aufweist (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Lösung vom Licht fern.
17. Pipettieren Sie 100 μL sekundäre Antikörperlösung auf jeden der enteroiden/BMM-Abstriche. Stellen Sie es in die Dunkelheit und lassen Sie es für 1 h bei RT sitzen.
18. Tippen Sie auf den Objektträger auf dem Tresen, um sekundäre Antikörper zu entfernen. Wiederholen Sie die in Schritt 3.15 beschriebenen Waschschritte, um sicherzustellen, dass alle Waschvorgänge im Dunkeln durchgeführt werden.
19. Fügen Sie jedem der enteroiden/BMM-Abstriche einen Tropfen 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (Fluoroshield mit DAPI, siehe Materialtabelle) hinzu und tragen Sie ein Deckglas auf, um sicherzustellen, dass beide Abstriche ausreichend abgedeckt sind. Vermeiden Sie es, Blasen unter dem Deckglas einzufangen. Halten Sie den Objektträger im Dunkeln, bis er bereit ist, unter dem Mikroskop zu sehen.
    HINWEIS: Die sofortige Abbildung der Objektträger liefert die optimalsten Ergebnisse. Dias können jedoch flach in einem befeuchteten Behälter bei 4 °C gelagert und bis zu 1 Woche nach Zugabe von DAPI abgebildet werden.

4. Einführung von experimentellem NEC

1. Stellen Sie sicher, dass AO-Enteroide vor der Anwendung mindestens 72 Stunden in Suspension waren.
2. Pipettieren Sie vorsichtig die gesamte enteroide/Mediensuspension aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Mehrere Vertiefungen können in einem konischen 15-ml-Rohr zusammengefasst werden, wenn ein großes Volumen an Vertiefungen behandelt wird. Für dieses Protokoll werden mindestens drei Vertiefungen pro Behandlungsgruppe empfohlen.
3. Bei 300 x g 3 min bei RT zentrifugieren und den Überstand entfernen.
4. 10 μL 5 mg/ml Lipopolysaccharid (LPS, siehe Materialtabelle) zu 500 μL 50% LWRN CM pro Vertiefung (Endkonzentration 100 μg/ml LPS) zugeben.
5. Resuspendieren Sie AO-Enteroide, die als Behandlungsgruppe bezeichnet werden, in 50% LWRN + LPS und aliquoten 500 μL Suspension auf eine 24-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte. Resuspendieren Sie AO-Enteroide, die als unbehandelte Kontrollen bezeichnet werden, in 500 μL 50% LWRN CM pro Vertiefung. Aliquot 500 μL dieser Suspension auf eine separate 24-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte.
6. Induzieren Sie eine Hypoxie in den LPS-behandelten AO-Enteroiden über eine modulare Inkubatorkammer (MIC) mit 1% O2, 5% CO₂ und 94%_N2 gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Behandeln Sie die Enteroide mit Hypoxie und LPS für 24 h.
7. Die unbehandelten und LPS + Hypoxie-behandelten Kulturen, die sich noch in der MIC-Kammer befinden, für 24 h in einen 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} geben.

5. Messung der parazellulären Permeabilität mittels LY

1. Pipettieren Sie die enteroide/Mediensuspension vorsichtig aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Warme DPBS und 50% LRWN CM im 37 °C warmen Wasserbad.
2. Zentrifugieren Sie die enteroide/Mediensuspension bei 300 x g für 3 min bei RT.
3. Entfernen Sie das Medium. Waschen Sie die Enteroide mit warmen 500 μL DPBS.
4. Zentrifuge bei 300 x g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3-5.4 noch einmal für insgesamt zwei Mal.
6. Nach dem Waschen 450 μL warmes 50% LWRN CM (wie in Schritt 1.3 vorbereitet) hinzufügen.
7. 50 μL 2,5 mg/ml LY (Endkonzentration beträgt 0,25 μg/μL, siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung geben und vorsichtig schwenken. In einen 37 °C, 5% CO₂ Inkubator für 2 h stellen.
8. Pipettieren Sie die enteroide/Mediensuspension vorsichtig aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
9. Bei 300 x g für 3 min bei RT zentrifugieren, dann den Überstand entfernen und das enteroide Pellet zurücklassen.
10. Waschen Sie die Enteroide mit 500 μL warmem DPBS.
11. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 3 min bei RT, dann entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das enteroide Pellet zurück.
12. Wiederholen Sie die Schritte 5.10-5.11 noch dreimal für insgesamt vier Waschgänge.
13. Resuspendieren Sie jedes Pellet mit 1.000 μL kaltem DPBS und pipettieren Sie kräftig auf und ab, um die Enteroide zu dissoziieren.
14. Bereiten Sie Standards für die LY-Standardkurve in DPBS (100 ng/ml; 50 ng/ml; 25 ng/ml; 12,5 ng/ml; 6,25 ng/ml; 3,13 ng/ml; 1,57 ng/ml; 0 ng/ml) vor.
15. Pipettieren Sie 150 μl jeder Probe pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung auf einer 96-Well-Platte.
16. Messen Sie die Fluoreszenz bei einem Anregungspeak von 428 nm und einem Emissionspeak von 536 nm auf einem Plattenlesegerät, das Fluoreszenz lesen kann (siehe Materialtabelle). Berechnen Sie die Konzentrationen mithilfe einer statistischen Software (siehe Materialtabelle), indem Sie die Standardkurve interpolieren und eine Kurve mit vier Parametern verwenden.

Representative Results

Discussion

Die intestinale Permeabilität ist komplex und spiegelt die epitheliale Barrierefunktion wider. Die Darmbarriere besteht aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen, die den transzellulären und parazellulären Transport vermittelt¹⁴. Parazelluläre Permeabilität beruht auf Tight-Junction-Proteinen, die den Raum zwischen Epithelzellen abdichten¹⁴. Innerhalb dieses parazellulären Transports gibt es drei verschiedene Wege, auf denen sich Moleküle kreuzen können: Pore, Leck und uneingeschränkt¹⁵. Der Porenweg ermöglicht eine Durchlässigkeit für kleine geladene Ionen, während der Leckweg größere, ungeladene Moleküle über¹⁵ ermöglicht. Der dritte, uneingeschränkte Signalweg spiegelt die Durchlässigkeit infolge von Epithelschäden oder Tod wider¹⁶. Obwohl viele Moleküle verwendet werden, um die parazelluläre Permeabilität zu beurteilen, beeinflussen Art und Größe des Moleküls, welcher Permeabilitätsweg untersucht wird.

Als kleines, hydrophiles Molekül kann LY alle drei parazellulären Signalwege durchqueren, was es zu einem optimalen Werkzeug für die Untersuchung der parazellulären Permeabilität macht. Im Gegensatz dazu kann 4 kDa FITC-Dextran, ein Zuckermolekül, das als Marker für parazelluläre Permeabilität verwendet wird, nur das Leck und uneingeschränkte Wege durchqueren. Der größere, 70 kDa FITC-Dextran ist nur auf den uneingeschränkten Weg beschränkt. Eine weitere Methode zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität sind transepitheliale Widerstandsmessungen (TEER), die den elektrischen Widerstand über Monoschichten hinweg messen. Diese Methode misst nur den Porenweg¹⁷. Somit bietet LY einen besseren Einblick in die gesamte parazelluläre Permeabilität, indem es auf alle drei Signalwege abzielt. Dieses Protokoll nutzt dies, indem es LY verwendet, um die parazelluläre Permeabilität zu untersuchen.

Das enteroide Modell wurde in diesem Protokoll ausgewählt, da es die In-vivo-Bedingungen genauer nachahmt, indem es einen 3D-Mini-Darm zur Untersuchung erstellt. Die Herausforderung beim traditionellen BO-Enteroidmodell besteht jedoch darin, wie man auf die apikale Oberfläche zugreifen kann, um Wirt-Pathogen-Interaktionen und die nachfolgenden Permeabilitätsänderungen zu untersuchen. Das AO-Enteroidmodell überwindet diese Herausforderung, indem es die Polarität umkehrt, wo die apikale Oberfläche mit dem umgebenden Medium in Kontakt steht. Mehrere alternative Methoden zum Zugang zur apikalen Oberfläche von Enteroiden wurden beschrieben. Dazu gehören Darm-Chip-Systeme, Mikroinjektion, Fragmentierung und wachsende Enteroide in Monoschichten^18,19. Fortschritte in Darm-Chip-Systemen haben es ermöglicht, Organoide und Endothelzellen im Kontext von Vaskularität und Peristaltik zusammen zu kultivieren, um die Darmumgebung nachzuahmen¹⁸. Die Mikroinjektion beinhaltet die Injektion in das enteroide BO-Lumen unter Verwendung spezieller Geräte wie eines Mikromanipulators und eines Mikroinjektors¹⁹. Die Fragmentierung nutzt die Dissoziation von Enteroiden in einzelne Zellen, die dann in Medien mit dem Erreger inkubiert werden, bevor eine 3D-Struktur reformiert^{wird 19}. Die Umwandlung von Enteroiden in 2D-Monoschichten mit anschließender Behandlung der apikalen Oberfläche wurde ebenfalls beschrieben¹⁹. Das AO-Enteroidmodell adressiert einige der Schwierigkeiten dieser Modelle, indem es eine einfache, effektive Möglichkeit bietet, die apikale Oberfläche freizulegen, ohne teure Ausrüstung zu benötigen oder die strukturelle Integrität des Enteroids zu beeinträchtigen.

Obwohl die Verwendung von LY in einem AO-Modell eine umfassende Untersuchung der parazellulären Permeabilität sekundär zu Wirt-Pathogen-Interaktionen ermöglicht, kann dieses Protokoll für die Verwendung mit BO-Enteroiden sowie FITC-Dextran anstelle von LY angepasst werden. Zwei wichtige Änderungen an diesem Protokoll sind erforderlich, um es für BO-Enteroide zu modifizieren. Erstens können BO-Enteroide in BMM-Kuppeln für alle Waschschritte vor und nach dem Hinzufügen von LY beibehalten werden. Es ist wichtig, für diese Waschschritte auf 37 °C erwärmte Lösungen zu verwenden, um eine Solubilisierung der BMM-Kuppel zu verhindern. Zweitens muss die BMM-Kuppel mit kaltem DPBS unterbrochen und das Bohrloch mit einer Pipettenspitze abgekratzt werden, nachdem alle Waschschritte abgeschlossen sind, um eine vollständige Resuspension der dissoziierten Enteroide und LY zu ermöglichen. Wenn FITC-Dextran LY ersetzt, wird empfohlen, das 4 kDa-Molekül zu verwenden, da es zwei der drei parazellulären Wege durchquert.

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll umfassen die Sicherstellung angemessener Waschungen, um Spuren LY aus der Lösung außerhalb des Enteroids zu entfernen. Es ist auch wichtig, die Enteroide vorsichtig zu waschen, um Dissoziation und mögliche Freisetzung von LY aus dem Lumen in die umgebende Lösung zu vermeiden, bis sie mit einem Mikrotiterplattenleser quantifiziert werden können. Die Verwendung von erwärmten Lösungen während der Waschschritte verringert auch die Belastung der Enteroide. Wenn kalte Lösungen verwendet werden, können Enteroide Apoptose erfahren, was zu ungenauen Ergebnissen führt.

Zu den Einschränkungen dieser Methode gehören die Unfähigkeit, AO-Enteroide zu vermehren, und längere Kultivierungszeiten aufgrund der zusätzlichen 72 Stunden, die erforderlich sind, um die Polarität umzukehren. Es gibt auch eine 2% -5% ige Abnahme der Anzahl der behandelten AO-Enteroide im Vergleich zu Kontrollen. Obwohl dies insgesamt vernachlässigbar ist, kann es zu einer Unterschätzung der Ergebnisse führen. Die Einschränkungen bei der Verwendung von LY ähneln anderen Permeabilitätsmolekülen wie 4 kDa FITC-Dextran, bei denen Spuren die intestinale Epithelbarriere über Transzytose²⁰ passieren können. Obwohl diese Menge vernachlässigbar ist, kann sie die Ergebnisse beeinflussen. Basierend auf diesen Erkenntnissen bietet die Anwendung von LY auf die Medien von AO-Enteroiden eine elegante und relativ einfache Möglichkeit, die parazelluläre Darmpermeabilität in einem 3D-Modell quantitativ und qualitativ zu analysieren.

Materials

[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.<sup>12</sup>
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&amp;D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-&beta;-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254