Mikrodissektion des Nagetierauges

Die Augendissektion ist eine wichtige Technik in der ophthalmologischen Forschung und hat es den Forschern ermöglicht, für gezielte Studien auf die Augensegmente zuzugreifen. Früher verließen sich Augenforscher für ihre Studien auf das Augengewebe von erkrankten Personen. Die im Laufe der Jahre immer größer werdende Anzahl von Stämmen von ophthalmologischen Nagetiermodellen¹ hat jedoch den Bedarf an menschlichem Augengewebe verringert. Diese Mausstämme haben ein tieferes Verständnis von Augenerkrankungen und Interventionen ermöglicht. Sie haben jedoch auch einen Bedarf an innovativen Techniken der okulären Mikrodissektion geweckt. Die geringe Größe und der begrenzte Arbeitsbereich schränken den effektiven Zugang zu den Augenunterteilen stark ein. Darüber hinaus ist es aufgrund der homogenen zellulären Anordnung der hinteren und vorderen Augenmuscheln schwierig, gezielte Eingriffe nach der Dissektion durchzuführen. Die derzeitigen Mikrodissektionstechniken des Lasers² und der chirurgischen Mikrodissektion ^3,4 reichen nicht aus, um diese Anforderungen der Augenforschung zu erfüllen. Die Laser-Mikrodissektion ist bei der Einzelzellanalyse sehr effektiv, aber das spezifische Gewebe muss vor dem Laserverfahren mikropräpariert werden². Die Technik kann kleine Regionen von Interesse aus einem vorpräparierten Gewebe für die molekulare Analyse isolieren. Daher eignet sich die Technik nicht zur Herstellung von Ganzkörpern oder zur Isolierung von axial gepackten Augenschichten für eine optimale Visualisierung.

Die chirurgische Methode ist die am weitesten verbreitete Technik; Bei dieser Methode wird das Auge über den Sehnerv⁵ ruhiggestellt und anschließend die Dissektion durchgeführt. Diese Praxis ist mühsam und kann jedes zerbrechliche Gewebe beschädigen, da sich das sphärische Auge während der Dissektion weiter bewegt. Obwohl die Technik für die Isolierung der verschiedenen Abschnitte der Netzhautschichten vorteilhaft ist, kann sie die räumliche Orientierung des Gewebes bei der Dissektion nicht abgrenzen.

Während der Dissektion bietet die Aufrechterhaltung des Vorhandenseins der angebrachten Nickhaut oder des dritten Augenlids (Abbildung 1) einzigartige und signifikante Vorteile. Bei dieser Methode wird zunächst der Augapfel mit dem dritten Augenlid enukleiert. Dann wird das dritte Augenlid verwendet, um das Auge⁶ zu immobilisieren (Abbildung 2A). Es folgt das Durchstechen des Augapfels durch den Hornhautlimbus und die Verwendung des Einschnitts als Eintrittspunkt (Abbildung 2B, C). Dann werden die Augenmuscheln getrennt, indem entlang des Umfangs nach vorne und hinten geschnitten wird (Abbildung 2D-G). Durch eine weitere Präparation der hinteren Augenmuschel kann die durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut identifiziert und vorsichtig abgezogen werden. In den erhaltenen halbkugelförmigen vorderen und hinteren Schalen werden dann drei oder vier äquidistante Schnitte gemacht, die es diesen blütenförmigen Bechern ermöglichen, flach auf einen Objektträger zu fallen (Abbildung 2H).

Das dritte Augenlid ermöglicht eine einfache und effiziente Handhabung während der Dissektion und sorgt so für eine minimale Schädigung des Gewebes beim Zugang zu den verschiedenen Augenschichten und bei der Herstellung ganzer Halterungen. Darüber hinaus hilft das Vorhandensein des dritten Augenlids, lokalisierte Eingriffe während der Visualisierung zu lokalisieren und zu untersuchen.

Das Verfahren wurde in unserem Labor an einem CBA/J- oder einem rd1-Mausstamm bei P28 jeglichen Geschlechts durchgeführt. Das Verfahren kann an jedem Stamm, Alter oder Geschlecht des Tieres durchgeführt werden und hat keine Verzerrung gemäß diesen Merkmalen.

Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen beschafft (siehe Materialtabelle) und in der Small Animal Facility (SAF) des National Institute of Immunology (NII) gehalten. Sie wurden in einzeln belüfteten Käfigen (IVC) gehalten und erhielten ad libitum Zugang zu angesäuertem autoklaviertem Wasser und Nahrung. Sie wurden bei 21-23 °C und mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h gehalten.

Im Folgenden ist eine modifizierte chirurgische Methode für die Mikrodissektion eines Mausauges angegeben.

Dieses Verfahren wurde von der institutionellen Tierethikkommission des Nationalen Instituts für Immunologie in Neu-Delhi genehmigt. Die laufende Referenznummer der Genehmigung lautet IAEC#480/18. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Regulierungsrichtlinien des Ausschusses für die Kontrolle und Überwachung von Tierversuchen des Ministeriums für Fischerei, Tierhaltung und Milchwirtschaft der indischen Regierung unter der Aufsicht eines professionellen Tierarztes der SAF, NII, durchgeführt.

1. Vorbereitung

1. Erweitern Sie die Augen der Nagetiere mit einem Tropfen 0,8% Tropicamid und 5% Phenylephrin ophthalmologischen Lösungen in jedem Auge. Legen Sie das Tier vor dem Eingriff 30 Minuten lang an einen dunklen Ort.
   HINWEIS: Ein Analgetikum ist nicht erforderlich, da das Tier unmittelbar nach Ablauf der 30 Minuten eingeschläfert wird. Die dunkle Anpassung und die Erweiterung der Augen des Tieres ermöglichen es dem Betrachter, vor dem Eingriff nach Augenrissen und -schäden zu suchen. Zusätzlich ist die Dilatation bei der Arbeit mit dem pigmentierten Augapfelgewebe von Vorteil.
2. Euthanasieren Sie das Tier durch intraperitoneale Verabreichung einer 5-fachen Dosis Anästhesie. Eine typische Dosis beträgt 200 μl PBS, die 10 mg Ketamin und 1 mg Xylazin enthalten.
   ANMERKUNG: Die Dosis für die Einschläferung des Tieres beträgt Ketamin bei 400-500 mg/kg Körpergewicht und Xylazin bei 50 mg/kg Körpergewicht intraperitoneal. Für eine typische Maus mit einem Gewicht von 20 g beträgt die Dosis 200 μl PBS, die 10 mg Ketamin (100 μl einer Stammlösung von 100 mg/ml Ketamin) und 1 mg Xylazin (100 μl einer Stammlösung von 10 mg/ml Xylazin) enthalten.
3. Bestätigen Sie das völlige Fehlen einer Reaktion auf einen Reiz, indem Sie den Pedalreflex untersuchen. Das Fehlen eines Herzschlags und einer Atmung sind ebenfalls wichtige Indikatoren.
4. Legen Sie die Maus in die seitliche Liegelage, um einen vollständigen Zugang zum Auge zu ermöglichen.
5. Bereiten Sie eine Colibri-Nahzange, eine gebogene Pinzette, eine Mikroklinge (15°, 3 mm groß), eine Feder-Mikroschere und eine abgewinkelte Feder-Mikroschere für den Eingriff vor.

2. Enukleation des Mausauges zusammen mit dem dritten Augenlid

1. Platzieren Sie die Maus in der seitlichen Liege, um einen vollständigen Zugang zum Auge zu ermöglichen. Öffnen Sie die äußeren Augenlider mit der Pinzette, um das dritte Augenlid optimal sichtbar zu machen.
   HINWEIS: Das dritte Augenlid, auch Nickhaut genannt, befindet sich in der oberen Ecke der Nasentangente (Abbildung 1A).
2. Identifizieren Sie das dritte Augenlid als kleinen durchscheinenden Vorsprung mit einer pigmentierten Grenze (Abbildung 1B).
3. Legen Sie eine gebogene Pinzette um den Augapfel und kneifen Sie, um das Auge von fremden Anhaftungen zu befreien. Dadurch werden Blutungen aus dem umgebenden Gewebe in das Auge minimiert.
4. Ersetzen Sie die gebogene Pinzette durch eine Federmikroschere und schneiden Sie mit dem dritten Augenlid um den Augapfel herum. Verwenden Sie kleine kontinuierliche Schnitte, um den Augapfel von den umgebenden Gewebeansätzen zu lösen.
5. Platzieren Sie eine gebogene Feder-Mikroschere unter dem Augapfel, um das Auge durch Schneiden des Sehnervs zu befreien. Stellen Sie sicher, dass der Augapfel vollständig aus der Augenhöhle gelöst ist.

3. Reinigung des Fremdgewebes

1. Legen Sie das enukleierte Auge der euthanasierten Maus in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4, wobei die Petrischale so gefüllt ist, dass der Augapfel in PBS eingetaucht ist.
2. Immobilisieren Sie den enukleierten Augapfel der Maus mit dem angebrachten dritten Augenlid mit einer Hand mit einer Pinzette.
3. Hängen Sie den Augapfel in flüssigem Medium auf, um eine effizientere Handhabung zu ermöglichen. Einige extraokulare Muskeln oder Gewebe beginnen vom Augapfel wegzuschweben. Entfernen Sie sie, indem Sie sie mit einer Feder-Mikroschere vom Augapfel abschneiden.
4. Schneiden und entfernen Sie den Sehnerv mit einer Mikroschere von der Basis des Augapfels, um eine bessere Trennung der Netzhaut für Whole-Mount-Präparate zu ermöglichen.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den Sehnerv für die Gewebeschnitte zu entfernen.
5. Waschen Sie den Augapfel mit PBS und geben Sie ihn in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für mindestens 2 Stunden bei 4 °C zur Gewebefixierung.
   HINWEIS: Der Eingriff kann in diesem Schritt unterbrochen werden, indem das Gewebe bis zu 12 h bei 4 °C in PFA belassen wird. Für die Isolierung lebender Zellen sollten die Fixierungsschritte jedoch nicht durchgeführt werden, und der gesamte Vorgang muss ohne Pausen durchgeführt werden.

4. Dissektion des enukleierten Auges, um die vorderen und hinteren Augenmuscheln zu erhalten

1. Nach der PFA-Fixierung (wenn Sie lebende Zellen sammeln, fahren Sie ohne die Fixierung des Augapfels fort), übertragen Sie den Augapfel in eine Petrischale, die PBS enthält, und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop, um den nachfolgenden Eingriff durchzuführen.
2. Immobilisieren Sie den Augapfel, indem Sie das dritte Augenlid mit einer Colibri-Nahzange festhalten.
3. Machen Sie einen kleinen Einschnitt am Limbus, indem Sie ihn mit einer Mikroklinge durchstechen. Der Limbus ist der Hornhaut-Sklera-Übergang. Machen Sie den Schnitt vorzugsweise gegenüber dem dritten Augenlid und schaffen Sie so einen Zugangspunkt für die Feder-Mikroschere.
   HINWEIS: Die Verwendung einer Mikroklinge von 15° und einer Größe von 3 mm kann eine bessere Kontrolle über die Tiefe dieses Einschnitts ermöglichen.
4. Als nächstes machen Sie mit diesem Einschnitt als Ausgangspunkt mit einer Mikroschere kleine und kontinuierliche Schnitte entlang des Umfangs des Hornhaut-Sklera-Limbus. Vervollständigen Sie zunächst einen Halbkreis von Schnitten, beginnend mit dem Schnittpunkt bis zum dritten Augenlid. Vervollständigen Sie dann den verbleibenden Halbkreis der Schnitte auf der anderen Seite. Machen Sie schließlich einen Schnitt um das dritte Augenlid, um die hintere Schale und die vordere Schale zu trennen.
   HINWEIS: Abhängig von der interessierenden Augenmuschel kann die Nickhaut entweder an der vorderen oder hinteren Augenmuschel befestigt bleiben.
5. Entfernen Sie die Linse mit einer Pinzette aus dem hinteren Becher, um den hinteren Becher zu erhalten, der die Schichten der neuralen Netzhaut und des retinalen Pigmentepithels (RPE) umfasst. Die Linse, die hintere Schale und die vordere Schale des Auges sind somit getrennt.
   HINWEIS: Wenn mit nicht fixiertem Gewebe gearbeitet wird, können die vorderen und hinteren Schalen jetzt enzymatisch verdaut werden, um eine einzellige Suspension der Hornhaut oder der Netzhaut zu erhalten.
6. Um die Gewebe zu fixieren, werden diese Becher 12 h bei 4 °C in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4% PFA überführt.
   HINWEIS: Nach der Fixierung kann das Gewebe in ein geeignetes Medium eingebettet werden, und es kann eine Kryo- oder Paraffinschnitte durchgeführt werden, um Hornhaut- oder Netzhautschnitte zu erhalten.

5. Isolierung der neuralen Netzhaut und der RPE-Schichten

1. Führen Sie den hinteren Becher wieder in die Petrischale ein, die PBS-Puffer enthält, um das Gewebe einzutauchen.
2. Überprüfen Sie, ob die neuronale Netzhaut vorhanden ist. Dies kann als opake Schicht auf der pigmentierten RPE-Schicht sichtbar gemacht werden, die am Randumfang des Bechers angebracht ist.
3. Halten Sie das dritte Augenlid mit einer Pinzette fest, um die hintere Schale zu immobilisieren, und ziehen Sie die Neuralnetzhaut ausgehend von der Peripherie mit einer zweiten Pinzette ab.
   HINWEIS: Sehr sanfte und leichte Handbewegungen werden dringend empfohlen, um das Gewebe nicht zu beschädigen. Am Ausgang des Sehnervs kann die gebogene Federschere unter die Netzhaut der Neuralnetzhaut eingeführt werden, und es kann ein Schnitt gemacht werden, um die Schichten vollständig zu befreien, wenn die Netzhaut der Neuralnetzhaut wie in Abbildung 3 dargestellt anhaftet. Optional können Sie die Netzhaut mit sanften Strichen mit einer weichen Bürste befreien oder ablösen. Es wäre jedoch nicht angebracht, dies zu tun, wenn die Netzhaut für die Histologie entnommen wird.
   HINWEIS: Auf diese Weise werden die neurale Netzhaut und die pigmentierte RPE-Schicht mit dem dritten Augenlid erhalten.

6. Segmentierung von Netzhaut- und RPE-Schichten für Wholemounts

1. Führen Sie die vorderen und hinteren Becher wieder in die Petrischale mit PBS-Puffer ein und stellen Sie die Schale unter das Präpariermikroskop.
2. Immobilisieren Sie die vordere Schale, indem Sie das dritte Augenlid gedrückt halten.
3. Verwenden Sie eine abgewinkelte Federschere, um einen Schnitt von etwa 3/4 des Durchmessers der Augenmuschel neben dem dritten Augenlid zu machen, und schneiden Sie von der Peripherie senkrecht zum optischen Zentrum.
4. Halten Sie das dritte Augenlid fest im Griff und machen Sie einen Schnitt neben dem ersten Schnitt.
5. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt zwischen dem zweiten Schnitt und dem dritten Augenlid.
   HINWEIS: Drei oder vier solcher äquidistanten Schnitte öffnen die halbkugelförmigen Becher in eine Blütenform, die flach fällt und leicht montiert werden kann.
6. Immobilisieren Sie die hintere Schale, indem Sie das dritte Augenlid gedrückt halten.
7. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie bei den Schnitten (Schritte 6.3-6.5) an der vorderen Schale, um drei oder vier äquidistante Schnitte an der hinteren Schale vorzunehmen.
   HINWEIS: Machen Sie für die Histologie der in Schritt 5 isolierten neuralen Netzhaut ähnliche Schnitte, um sicherzustellen, dass sie flach auf eine Oberfläche fällt. Machen Sie keine sehr tiefen Schnitte in der Mitte der Tasse, da dies dazu führen kann, dass die Blattabschnitte auseinanderfallen oder sich leicht trennen.
8. Führen Sie die Färbung durch und montieren Sie das Gewebe für eine effektive Visualisierung ^7,8.
   HINWEIS: Das Vorhandensein der Nickhaut fungiert als konstanter physikalischer Indikator für die Nasenseite der Augenmuschel bei ganzen Halterungen. Es hilft, die dorsale/ventrale Seite der Augenmuschel abzugrenzen, da das dritte Augenlid der Augenmuschel die nasale/ventrale Ausrichtung anzeigt.

Ein ganzer Berg von rd1-Augen-/Hornhautgewebe der Maus wurde hergestellt, um eine mögliche Lymphangiogenese im vorderen / Hornhautgewebe in einem erkrankten Zustand zu untersuchen. Das anhaftende Bindehautgewebe aus dem dritten Augenlid wirkte als Positivkontrolle, da der Hornhaut Lymphgefäße fehlen. Für die Studie wurde das Hornhautgewebe mit der Bindehaut präpariert und mit 4% PFA fixiert, gefolgt von Permeabilisierung und Blockierung. Das Gewebe wurde dann mit einem primären Antikörper gegen den lymphatischen Endothelmarker (LYVE1)9 gefärbt. Es folgte die Inkubation mit einem sekundären Antikörper, der mit Alexa Fluor 488 (grün) markiert war. Repräsentative Bilder (Abbildung 4) wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 4x und 10x aufgenommen.

Ein ganzer Berg der neuralen Netzhaut aus der hinteren Augenmuschel wurde hergestellt, um das retinale Gefäßsystem für morphologische, strukturelle und funktionelle Studien der Netzhaut sichtbar zu machen7. Die neurale Netzhaut wurde vorsichtig von der Aderhaut-RPE-Schicht abgezogen und Schnitte wurden gemacht, um sie flach in eine Blütenstruktur zu legen. Zur Visualisierung der retinalen Gefäßstruktur wurde das Blättchen 1 h bei Raumtemperatur mit Isolectin IB4-Alexa Fluor 488 gefärbt und bei 2-facher und 20-facher Vergrößerung visualisiert (Abbildung 5).

Abbildung 1: Das dritte Augenlid oder die Nickhaut der Maus. (A) Das dritte Augenlid befindet sich in Richtung des oberen Winkels der Nasentangente und (B) hat oft eine pigmentierte Grenze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Schritte bei der Isolierung der vorderen und hinteren Augenmuscheln von einem enukleierten Augapfel. (A) Das dritte Augenlid wird verwendet, um das Auge zu immobilisieren, und (B) ein Schnitt wird durch den Hornhautlimbus gemacht. (C) Eine Eintragung erfolgt nach dem Formen des Einschnitts und des Schnitts entlang des Umfangs, wie in (D-F) gezeigt. (G) Die vordere und hintere Augenmuschel sind somit getrennt. Auf der hinteren Augenmuschel befindet sich eine durchscheinende Schicht der neuralen Netzhaut, die abgezogen wird. (H) In den Bechern werden dann drei äquidistante Schnitte gemacht, damit sie flach fallen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung zeigt, wie eine gekrümmte Federschere unter die Netzhaut des Nervensystems eingeführt werden kann, um die Schichten freizugeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Gesamte Befestigung der vorderen Schale. Das Hornhautgewebe wurde wie beschrieben mikroseziert, um die Lymphgefäße freizulegen. Das Gewebe wurde mit dem lymphatischen Endothelmarker (LYVE1) und einem Alexa Fluor 488 (grün)-markierten Sekundärantikörper gefärbt. (A) Bilder bei 4-facher und (B) bei 10-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Die gesamte Halterung der neuralen Netzhaut. Das Isolectin IB4 färbt das retinale Gefäßsystem ein, das leicht grün dargestellt werden kann. (A) Die aus der hinteren Augenmuschel erhaltene flache Netzhauthalterung wurde mit Isolectin IB4 gefärbt, das mit Alexa Fluor 488 (2x) markiert war. (B) Eine 20-fache Vergrößerung des retinalen Gefäßsystems, die den intermediären Gefäßplexus in der Netzhaut zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.