Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

Die Entstehung und das Fortschreiten von Cholangiopathien wie Gallenatresie, primär sklerosierender Cholangitis (PSC) und primärer biliärer Cholangitis (PBC) sind entweder unbekannt oder unvollständig ^1,2. Das begrenzte Verständnis der Entstehung und des Verlaufs dieser Krankheiten führt zu einem Mangel an Therapieoptionen³. Das schwierigste Hindernis bei der Untersuchung neonataler Gallengangserkrankungen ist das molekulare Verständnis der Pathophysiologie. Einer der wesentlichen Schlüssel zum besseren Verständnis der molekularen Pathologie ist die bestmögliche Beobachtung des betroffenen Gewebes. Um eine verminderte Vergleichbarkeit und Diskrepanzen zwischen der Forschung zu vermeiden, wie z.B. die Beobachtung der potenziellen viralen Ätiologie der Gallenatresie⁴, ergibt sich die Notwendigkeit der bestmöglichen Vorbereitung und des Austauschs der durchgeführten Dissektionstechniken. Eine reine Präparation des Zielgewebes ist für spätere mikroskopische Untersuchungen oder die Züchtung von Zell- und 3D-Organoidkulturen notwendig. Bei neonatalen Erkrankungen der Maus sind Gewebeproben jedoch selten und treten aufgrund der sehr geringen Größe nur in geringer Menge auf. In Bezug auf Gallengangserkrankungen wurden Schwierigkeiten bei einer sauberen Vorbereitung der Gallengänge bei murinen Neugeborenen beschrieben⁵. Aufgrund des neonatalen Entwicklungsstadiums ist die Gewebedifferenzierung nicht übermäßig fortgeschritten, was die Vorbereitung erschwert und die Schwierigkeit im Vergleich zur Vorbereitung von adulten Proben erhöht. Daher untersuchte die operative Arbeitsgruppe eine neuartige Strategie zur Vorbereitung des EBDS in einem neonatalen Mausmodell. In der vorliegenden Studie ermöglicht die Technik eine effiziente Zerlegung jeder Probe.

Das Gallengangssystem befindet sich intraperitoneal im rechten Oberbauch, der aus der Leber entsteht. Die Gallenblase befindet sich unter der viszeralen Oberfläche des rechten Leberlappens. Der Gallengang ist zusammen mit der Pfortader und der Leberarterie in das Ligamentum hepatoduodenalis eingebettet. Es verbindet die Leber und den Zwölffingerdarm direkt und leitet Gallenflüssigkeit in den Zwölffingerdarm⁶ ab. Anatomisch ist der Gallengang in die rechten und linken Lebergänge, den gemeinsamen Lebergang, den Zystengang und den Ductus choledochus unterteilt, der durch den Zusammenfluss des zystischen Ganges und des gemeinsamen Lebergangs⁷ gebildet wird. Dieser entleert schließlich Gallenflüssigkeit und Speichel aus dem Pankreasgang über die Ampulla von Vater in den Zwölffingerdarm.

Cholangiozyten kleiden den Gallengang intra- und extrahepatisch aus und leben in einer komplizierten anatomischen Nische, wo sie die Gallenproduktion und Homöostase unterstützen⁸. Gallenflüssigkeit passiert diese spezialisierten Epithelzellen täglich in hohen Konzentrationen. Insbesondere die HCO3-Schirmpflege ist sehr wichtig für den Schutz vor Gallensäuretoxizität⁹. Cholangiozyten sind die erste Verteidigungslinie im hepatobiliären System gegen beispielsweise luminale Mikroorganismen¹⁰. Die Abwehrwirksamkeit der Cholangiozyten gegen toxische Angriffe kann durch genetische Veranlagung geschwächt werden. Eine toxische Überlastung verursacht Schäden und Zerstörung und kann daher zu Cholangiopathien führen. Darüber hinaus ist der sich entwickelnde Gallengang nicht vollständig zu allen Selbstschutzmechanismen fähig, was zu einer höheren Anfälligkeit für Umweltgifte in neonatalen Gallengängen führt¹¹.

Nach der ethischen Zulassung (N045/2021) wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse bis zum Alter von 9 Tagen beobachtet. Die Tiere wurden von der Tiereinrichtung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland geboren und zu Versuchszwecken zur Verfügung gestellt. Die Neugeborenen wurden zusammen mit ihren Elterntieren in einem Käfig untergebracht. Die Umgebungsbedingungen wurden in Temperatur (20-24 °C), 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus und relativer Luftfeuchtigkeit von 40%-70% kontrolliert.

1. Versuchsvorbereitung

1. Bereiten Sie die erforderliche Ausrüstung für den chirurgischen Eingriff vor, einschließlich Schere, Pinzette usw. (siehe Materialtabelle).
2. Stellen Sie desinfizierte und autoklavierte Instrumente auf eine sterile Oberfläche neben dem Operationstisch.
3. Euthanasieren Sie eine P9-gealterte neonatale Maus schnell durch Enthauptung mit einer Operationsschere. Legen Sie den Körper der euthanasierten Neugeborenenmaus auf ein steriles Operationsfeld. Sezieren Sie die EBDSs bei 9 Tage alten Mausneugeborenen (Schritt 5).
   HINWEIS: Das beschriebene Sezierverfahren gibt jedem Wissenschaftler die richtigen Werkzeuge, um das EBDS von neugeborenen und älteren Mäusen zu entfernen. Je älter die Maus, desto einfacher die Vorbereitung.

2. Zugang zur Peritonealhöhle

1. Fassen Sie die Haut über der Lage der Harnblase mit einer Pinzette. Schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 2 mm mit einer Schere in die Haut, ohne das Peritoneum und die darunter liegenden Strukturen zu beschädigen. Erweitern Sie den Schnitt bis zur Stelle der Enthauptung, indem Sie der linken vorderen Achsellinie folgen. Entfernen Sie die Haut von links nach rechts mit der schonenden Pinzette.
2. Ergreife das Peritoneum, das die Milz umgibt. Heben Sie es vorsichtig an, bis das Peritoneum einer zeltartigen Struktur ähnelt, und schneiden Sie ein Loch von 1 mm Durchmesser in die Mitte. Warten Sie, bis sich das "Peritonealzelt" mit Luft gefüllt hat. Verwenden Sie für diesen und die folgenden Schritte eine 10-fache mikroskopische Vergrößerung.
3. Schneiden Sie das Peritoneum in einem Fenster ab, das von den unteren Rippen, beiden seitlichen Bauchregionen und dem unteren Blasenbereich eingerahmt wird, um den vollen Zugang zu Leber, Gallengangssystem, Magen, Dünndarm und Dickkopf zu gewährleisten.
   HINWEIS: Um den Zugang zur Leber zu verbessern, kann ein zusätzlicher Schnitt durchgeführt werden, bei dem die drei untersten Rippen entfernt werden, während der Xiphoidfortsatz, das falciforme Band, die Leber und die Gallengangsstrukturen intakt bleiben. Der Blick auf die Leber ist leicht zu erhalten.

3. Untersuchung der Gallenblase und der Gallenwege

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probe während aller folgenden Schritte regelmäßig nass bleibt.

1. Ziehen Sie den Xiphoid-Prozess vorsichtig in eine kranioventrale Position, um die Gallenblase zu untersuchen.
   HINWEIS: Die Spannung am falciformen Band nimmt mit dieser Bewegung zu und die angeschlossene Gallenblase wird sichtbar.
   1. Führen Sie nur einen leichten Zug durch, um ein unkontrollierbares Reißen des falciformen Bandes zu vermeiden, das dazu führen könnte, dass die Gallenblase aus dem Gallengangssystem reißt. Lassen Sie den Zug des Xiphoid-Prozesses vor dem nächsten Schritt los.
2. Ziehen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig nach unten, um das Gallengangssystem zu befreien.
   HINWEIS: Wenn die Spannung am hepatoduodenalen Band zunimmt, wird das Gallengangsgewebe sichtbar.

4. En-bloc-Resektion

1. Führen Sie die untere en-bloc-Mobilisierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Identifizieren Sie die Zwölffingerdarmpapille, die das Gallengangssystem mit dem Zwölffingerdarm verbindet.
   2. Schneiden Sie durch den Zwölffingerdarm etwa 2 cm von der rechten seitlichen Seite der Papille.
   3. Schneiden Sie durch den Pylorusbereich. Stellen Sie sicher, dass der Mageninhalt im Pylorusbereich zwischen der Schnittstelle und der Zwölffingerdarmpapille vorhanden ist.
      HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt für die spätere Orientierungssicherheit für die korrekte Lokalisierung von oralen und aboralen Zwölffingerdarmteilen.
2. Führen Sie die obere en-bloc-Mobilisierung durch.
   1. Ziehen Sie vorsichtig am Xiphoidfortsatz und erhalten Sie Zugang zum falciformen Band.
   2. Führen Sie einen 1 cm langen Schnitt durch das falciforme Band durch, so nah wie möglich am Xiphoidfortsatz, zwischen der Gallenblase und dem Xiphoidfortsatz. Achten Sie darauf, die Gallenblase nicht zu beschädigen.
   3. Durchschneiden Sie die folgenden Verbindungsstrukturen zwischen Leber und Thorax: Speiseröhre, Vena cava inferior, thorakale Aorta, alle Bänder, die den nackten Bereich der Leber umgeben, und alle dorsal verbleibenden Gewebeverbindungen.
      HINWEIS: Die en-bloc-Probe ist vollständig seziert. Es enthält die Leber, das Gallengangssystem und den Zwölffingerdarmkorpus, der mit der Pylorusregion des Magens verbunden ist.

5. Abschließende Gallenblasen- und Gallengangsdissektion

1. Führen Sie die grobe Vorbereitung mit den folgenden Schritten durch.
   1. Legen Sie die en-bloc-Probe auf ein Schaumstoffpolster, das normalerweise zur Dehydratisierung verwendet wird. Verwenden Sie für diesen und die folgenden Schritte eine 20-fache mikroskopische Vergrößerung und zwei mikrochirurgische atraumatische Pinzetten mit einer maximalen Spitzengröße von 6 mm.
   2. Montieren Sie die Probe auf dem Schaumstoffpolster. Reorganisieren Sie die Probe in der richtigen anatomischen Position. Flachen Sie den oralen und aboralen Teil des Zwölffingerdarms ab und führen Sie eine sanfte Bewegung aus.
   3. Beginnen Sie die Bewegung an der Zwölffingerdarmpapille und fahren Sie mit einer traumatischen Pinzette zu den Schneidkanten fort. Glätten Sie den weißen breiigen Inhalt des Magens, der nur im oralen Teil des Zwölffingerdarms auftritt. Stellen Sie sicher, dass Sie den oralen und den aboralen Teil des Zwölffingerdarms identifizieren, um eine wahrscheinliche Gallengangsrotation auszuschließen.
   4. Schneiden Sie große Reste von Lebergewebe weg, um mit der Dissektion des Gallengangs zu beginnen.
2. Führen Sie die abschließende Isolierung durch.
   1. Drücken Sie das restliche Lebergewebe vorsichtig in die Poren der Schaummatte. Stellen Sie sicher, dass die Schabenbewegungen vom Gallengangssystem ausgehen und zu den Lebergrenzen führen.
   2. Überführen Sie die Probe nach einigen Schabenbewegungen in verschiedene Richtungen in eine sauberere Position auf der Schaummatte. Nutzen Sie den Vorteil von weniger gequetschtem Lebergewebe im Hintergrund, um die Sicht für die bestmögliche Unterscheidung zwischen EBDS und unerwünschten Zellen zu optimieren. Kratzen Sie das Lebergewebe aus dem Gallengang, bis nichts oder so wenig wie möglich vom Lebergewebe übrig bleibt.
   3. Verarbeiten Sie das hepatoduodenale Band, bis das isolierte EBDS verbleibt. Entfernen Sie intraligamentöse Blutgefäße wie die Leberarterie, die Pfortader und kleine Reste. Entfernen Sie dieses empfindliche Filament mit einem sanften Zug und hoher Sorgfalt auf die linke seitliche Seite. Dieser Dissektionsschritt kann bereits während der vorherigen Entfernung von Lebergewebe unbeabsichtigt oder teilweise abgeschlossen begonnen haben, was letztendlich zum gleichen Ergebnis führt.
      HINWEIS: Die Blutgefäße treten als weißes und sehr empfindliches Filament etwa 3-5 mm oral der Zwölffingerdarmpapille auf und verbinden das Hepatoduodenalband von der linken lateralen Seite und sammeln sich mit dem Gallengang zur Glisson-Triade. Nach Abschluss dieses Schritts wird die endgültige Probe vollständig isoliert. Wenn eine Aufzeichnung erforderlich ist, können Bilder aufgenommen werden, nachdem die Gallengangsstrukturen in ihre anatomische Position gebracht wurden (Abbildung 1). Es wird empfohlen, die letzten Vorbereitungsschritte auf einer Schaumstoffmatte durchzuführen, da die Probe nicht so stark an der Oberfläche des Operationsfeldes haftet. Wenn die Poren nass sind, schwebt oder schwimmt der Gallengang. Beim Bewegen der Probe haftet sie nicht so fest wie bei der Vorbereitung auf dem Operationstuch, was zu keinem Reißen beim Bewegen der Probe führt.

6. Vorbereitung für die histologische Analyse

1. Die isolierte Probe wird so bald wie möglich nach der Dissektion in eine gepufferte Lösung, ein spezielles Medium oder formalinhaltige Fixiermittel (siehe Materialtabelle) gegeben.
2. Wählen Sie eine geeignete Lagerlösung in Abhängigkeit von weiteren geplanten Verarbeitungsschritten.
   VORSICHT: Verwenden Sie formalinhaltige Fixiermittel wegen akuter Toxizität, Korrosivität und verschiedener Gesundheitsgefahren nur unter einer Lüftungsöffnung.
   HINWEIS: In der vorgestellten Studie wurden die EBDS-Proben in Paraformaldehyd eingefügt, dehydriert und in Paraffin eingebettet. Sie wurden bei Raumtemperatur gelagert und vor dem Schneiden abgekühlt. In einem Wärmeschrank wurden 2 μm Scheiben über Nacht aufbewahrt und mit herkömmlichem Hämatoxylin und Eosin⁴ gefärbt (siehe Materialtabelle).

Abbildung 1A zeigt das EBDS eines murinen Neugeborenen, das mit der beschriebenen Technik seziert wurde. Mikroskopisch ist kein weiteres Lebergewebe sichtbar. Das Lebergewebe wurde während der letzten Isolationsschritte des Protokolls entfernt und konnte in Farbe und Konsistenz leicht vom Gallengangsgewebe unterschieden werden. Abbildung 1B zeigt die isolierte Probe im Vergleich zu einer Millimeterskala. Die Länge des EBD (gemessen von der Gallenblase bis zur Zwölffingerdarmpapille) beträgt weniger als 10 mm. Der Durchmesser des sehr empfindlichen Ductus choledochus variierte zwischen 0,05 und 0,2 mm. Abbildung 2 zeigt die Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines Längsschnitts des EBDS mit offenem Lumen. Die Cholangiozyten, die das Lumen umgeben, können als Monoschicht identifiziert und dunkler gefärbt werden. Die Mikroskopie wurde mit 20-facher Vergrößerung durchgeführt. Die Zahlen zeigen, dass der Bediener mit dem beschriebenen Dissektionsprotokoll das EBDS in der Nähe der Ränder des Kanals mikroskopisch sezieren kann, auch bei neonatalen Mäusen. Die Proben wurden von 9 Tage alten murinen Neugeborenen genommen.

Abbildung 1: EBDS-Dissektion . (A) Endgültige EBDS-Probe eines murinen Neugeborenen. (1) Gallenblase, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Zwölffingerdarm. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Größenmaß des zerlegten EBDS im Vergleich zu einer Millimeterskala. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Längsschnitt des EBDS. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigt EBDS, das ein offenes Lumen enthält. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Gewichtsentwicklung von C57BL/6-Neugeborenen bis zum neunten Lebenstag. Neugeborene wurden bis zu zweimal täglich gewogen. Die bereitgestellten Daten zeigen das Gewicht der Kontrolltiere (n = 5). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.