Methodenartikel

Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

2.5K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/64424

⸱

23. August 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2Research Laboratory for Pediatric Surgery, 3Research Animal Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Für die Beobachtung von neonatalen Gallengangsstörungen der Maus sind ein intakter Gallengang und eine effiziente Vorbereitung erforderlich. Daher wurde erfolgreich ein neuer Ansatz zur Isolierung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems bei murinen Neugeborenen unter Beibehaltung der Integrität des Gallengangs entwickelt.

Zusammenfassung

Die Dissektion der neonatalen Gallengänge von Mäusen wurde als schwierig beschrieben. Das Hauptziel der beschriebenen Standardarbeitsanweisung ist die Isolierung des extrahepatischen Gallengangs (EBD) bei Mausneugeborenen, ohne den Gallengang während der Präparation zu schädigen. Aufgrund seiner außergewöhnlich engen Präparation im Vergleich zur Cholangiozyten-Zelllinie und der Gewinnung des gesamten extrahepatischen Gallengangssystems (EBDS) ist der beschriebene Ansatz äußerst nützlich bei der Erforschung von Tiermodellen neugeborener Gallengangserkrankungen, wie z.B. der Gallenatresie. Nach der Euthanasie wurde die Peritonealhöhle betreten und Gallengangssystem, Zwölffingerdarm und Leber mit der einzigartigen En-bloc-Resektion (EbR) extrahiert. Die extrahierte Probe wird auf eine Schaumstoffmatte gelegt, und das EBD wird ohne notwendige Berührung atraumatisch von kontaminierenden Zellen seziert. Die Dissektion des gesamten EBDS ist ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Aufgrund der geringen Größe und Menge an Gallengangsgewebe ist Vorsicht geboten. Mit der beschriebenen Technik gibt es keine Schädigung der Cholangiozyten. Weiterhin ist die Reinheit der Technik reproduzierbar (n = 10). So können optimal vergleichbare Proben entnommen werden. Darüber hinaus wird kein Gallengangsgewebe geschädigt, da jeder Kontakt mit dem Gallengangssystem während der Präparation vermieden werden kann und die Gallenflüssigkeit in der Gallenblase verbleibt. Am wichtigsten ist, dass bei der Durchführung der abschließenden Gallenblasen- und Gallengangsdissektion atraumatische Mikroinstrumente nur geringfügig seitlich des Gallengangs verwendet wurden, ohne ihn zu quetschen. Dies ist der Schlüssel zu einer sauberen und intakten Probe und unerlässlich für weitere histologische Untersuchungen oder die Isolierung von Cholangiozyten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene innovative Dissektionstechnik es besonders unerfahrenen Bedienern ermöglicht, das EBDS möglichst sauber zu isolieren.

Einleitung

Die Entstehung und das Fortschreiten von Cholangiopathien wie Gallenatresie, primär sklerosierender Cholangitis (PSC) und primärer biliärer Cholangitis (PBC) sind entweder unbekannt oder unvollständig 1,2. Das begrenzte Verständnis der Entstehung und des Verlaufs dieser Krankheiten führt zu einem Mangel an Therapieoptionen3. Das schwierigste Hindernis bei der Untersuchung neonataler Gallengangserkrankungen ist das molekulare Verständnis der Pathophysiologie. Einer der wesentlichen Schlüssel zum besseren Verständnis der molekularen Pathologie ist die bestmögliche Beobachtung des betroffenen Gewebes. Um eine verminderte Vergleichbarkeit und Diskrepanzen zwischen der Forschung zu vermeiden, wie z.B. die Beobachtung der potenziellen viralen Ätiologie der Gallenatresie4, ergibt sich die Notwendigkeit der bestmöglichen Vorbereitung und des Austauschs der durchgeführten Dissektionstechniken. Eine reine Präparation des Zielgewebes ist für spätere mikroskopische Untersuchungen oder die Züchtung von Zell- und 3D-Organoidkulturen notwendig. Bei neonatalen Erkrankungen der Maus sind Gewebeproben jedoch selten und treten aufgrund der sehr geringen Größe nur in geringer Menge auf. In Bezug auf Gallengangserkrankungen wurden Schwierigkeiten bei einer sauberen Vorbereitung der Gallengänge bei murinen Neugeborenen beschrieben5. Aufgrund des neonatalen Entwicklungsstadiums ist die Gewebedifferenzierung nicht übermäßig fortgeschritten, was die Vorbereitung erschwert und die Schwierigkeit im Vergleich zur Vorbereitung von adulten Proben erhöht. Daher untersuchte die operative Arbeitsgruppe eine neuartige Strategie zur Vorbereitung des EBDS in einem neonatalen Mausmodell. In der vorliegenden Studie ermöglicht die Technik eine effiziente Zerlegung jeder Probe.

Das Gallengangssystem befindet sich intraperitoneal im rechten Oberbauch, der aus der Leber entsteht. Die Gallenblase befindet sich unter der viszeralen Oberfläche des rechten Leberlappens. Der Gallengang ist zusammen mit der Pfortader und der Leberarterie in das Ligamentum hepatoduodenalis eingebettet. Es verbindet die Leber und den Zwölffingerdarm direkt und leitet Gallenflüssigkeit in den Zwölffingerdarm6 ab. Anatomisch ist der Gallengang in die rechten und linken Lebergänge, den gemeinsamen Lebergang, den Zystengang und den Ductus choledochus unterteilt, der durch den Zusammenfluss des zystischen Ganges und des gemeinsamen Lebergangs7 gebildet wird. Dieser entleert schließlich Gallenflüssigkeit und Speichel aus dem Pankreasgang über die Ampulla von Vater in den Zwölffingerdarm.

Cholangiozyten kleiden den Gallengang intra- und extrahepatisch aus und leben in einer komplizierten anatomischen Nische, wo sie die Gallenproduktion und Homöostase unterstützen8. Gallenflüssigkeit passiert diese spezialisierten Epithelzellen täglich in hohen Konzentrationen. Insbesondere die HCO3-Schirmpflege ist sehr wichtig für den Schutz vor Gallensäuretoxizität9. Cholangiozyten sind die erste Verteidigungslinie im hepatobiliären System gegen beispielsweise luminale Mikroorganismen10. Die Abwehrwirksamkeit der Cholangiozyten gegen toxische Angriffe kann durch genetische Veranlagung geschwächt werden. Eine toxische Überlastung verursacht Schäden und Zerstörung und kann daher zu Cholangiopathien führen. Darüber hinaus ist der sich entwickelnde Gallengang nicht vollständig zu allen Selbstschutzmechanismen fähig, was zu einer höheren Anfälligkeit für Umweltgifte in neonatalen Gallengängen führt11.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Nach der ethischen Zulassung (N045/2021) wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse bis zum Alter von 9 Tagen beobachtet. Die Tiere wurden von der Tiereinrichtung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland geboren und zu Versuchszwecken zur Verfügung gestellt. Die Neugeborenen wurden zusammen mit ihren Elterntieren in einem Käfig untergebracht. Die Umgebungsbedingungen wurden in Temperatur (20-24 °C), 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus und relativer Luftfeuchtigkeit von 40%-70% kontrolliert.

1. Versuchsvorbereitung

  1. Bereiten Sie die erforderliche Ausrüstung für den chirurgischen Eingriff vor, einschließlich Schere, Pinzette usw. (siehe Materialtabelle).
  2. Stellen Sie desinfizierte und autoklavierte Instrumente auf eine sterile Oberfläche neben dem Operationstisch.
  3. Euthanasieren Sie eine P9-gealterte neonatale Maus schnell durch Enthauptung mit einer Operationsschere. Legen Sie den Körper der euthanasierten Neugeborenenmaus auf ein steriles Operationsfeld. Sezieren Sie die EBDSs bei 9 Tage alten Mausneugeborenen (Schritt 5).
    HINWEIS: Das beschriebene Sezierverfahren gibt jedem Wissenschaftler die richtigen Werkzeuge, um das EBDS von neugeborenen und älteren Mäusen zu entfernen. Je älter die Maus, desto einfacher die Vorbereitung.

2. Zugang zur Peritonealhöhle

  1. Fassen Sie die Haut über der Lage der Harnblase mit einer Pinzette. Schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 2 mm mit einer Schere in die Haut, ohne das Peritoneum und die darunter liegenden Strukturen zu beschädigen. Erweitern Sie den Schnitt bis zur Stelle der Enthauptung, indem Sie der linken vorderen Achsellinie folgen. Entfernen Sie die Haut von links nach rechts mit der schonenden Pinzette.
  2. Ergreife das Peritoneum, das die Milz umgibt. Heben Sie es vorsichtig an, bis das Peritoneum einer zeltartigen Struktur ähnelt, und schneiden Sie ein Loch von 1 mm Durchmesser in die Mitte. Warten Sie, bis sich das "Peritonealzelt" mit Luft gefüllt hat. Verwenden Sie für diesen und die folgenden Schritte eine 10-fache mikroskopische Vergrößerung.
  3. Schneiden Sie das Peritoneum in einem Fenster ab, das von den unteren Rippen, beiden seitlichen Bauchregionen und dem unteren Blasenbereich eingerahmt wird, um den vollen Zugang zu Leber, Gallengangssystem, Magen, Dünndarm und Dickkopf zu gewährleisten.
    HINWEIS: Um den Zugang zur Leber zu verbessern, kann ein zusätzlicher Schnitt durchgeführt werden, bei dem die drei untersten Rippen entfernt werden, während der Xiphoidfortsatz, das falciforme Band, die Leber und die Gallengangsstrukturen intakt bleiben. Der Blick auf die Leber ist leicht zu erhalten.

3. Untersuchung der Gallenblase und der Gallenwege

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probe während aller folgenden Schritte regelmäßig nass bleibt.

  1. Ziehen Sie den Xiphoid-Prozess vorsichtig in eine kranioventrale Position, um die Gallenblase zu untersuchen.
    HINWEIS: Die Spannung am falciformen Band nimmt mit dieser Bewegung zu und die angeschlossene Gallenblase wird sichtbar.
    1. Führen Sie nur einen leichten Zug durch, um ein unkontrollierbares Reißen des falciformen Bandes zu vermeiden, das dazu führen könnte, dass die Gallenblase aus dem Gallengangssystem reißt. Lassen Sie den Zug des Xiphoid-Prozesses vor dem nächsten Schritt los.
  2. Ziehen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig nach unten, um das Gallengangssystem zu befreien.
    HINWEIS: Wenn die Spannung am hepatoduodenalen Band zunimmt, wird das Gallengangsgewebe sichtbar.

4. En-bloc-Resektion

  1. Führen Sie die untere en-bloc-Mobilisierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Identifizieren Sie die Zwölffingerdarmpapille, die das Gallengangssystem mit dem Zwölffingerdarm verbindet.
    2. Schneiden Sie durch den Zwölffingerdarm etwa 2 cm von der rechten seitlichen Seite der Papille.
    3. Schneiden Sie durch den Pylorusbereich. Stellen Sie sicher, dass der Mageninhalt im Pylorusbereich zwischen der Schnittstelle und der Zwölffingerdarmpapille vorhanden ist.
      HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt für die spätere Orientierungssicherheit für die korrekte Lokalisierung von oralen und aboralen Zwölffingerdarmteilen.
  2. Führen Sie die obere en-bloc-Mobilisierung durch.
    1. Ziehen Sie vorsichtig am Xiphoidfortsatz und erhalten Sie Zugang zum falciformen Band.
    2. Führen Sie einen 1 cm langen Schnitt durch das falciforme Band durch, so nah wie möglich am Xiphoidfortsatz, zwischen der Gallenblase und dem Xiphoidfortsatz. Achten Sie darauf, die Gallenblase nicht zu beschädigen.
    3. Durchschneiden Sie die folgenden Verbindungsstrukturen zwischen Leber und Thorax: Speiseröhre, Vena cava inferior, thorakale Aorta, alle Bänder, die den nackten Bereich der Leber umgeben, und alle dorsal verbleibenden Gewebeverbindungen.
      HINWEIS: Die en-bloc-Probe ist vollständig seziert. Es enthält die Leber, das Gallengangssystem und den Zwölffingerdarmkorpus, der mit der Pylorusregion des Magens verbunden ist.

5. Abschließende Gallenblasen- und Gallengangsdissektion

  1. Führen Sie die grobe Vorbereitung mit den folgenden Schritten durch.
    1. Legen Sie die en-bloc-Probe auf ein Schaumstoffpolster, das normalerweise zur Dehydratisierung verwendet wird. Verwenden Sie für diesen und die folgenden Schritte eine 20-fache mikroskopische Vergrößerung und zwei mikrochirurgische atraumatische Pinzetten mit einer maximalen Spitzengröße von 6 mm.
    2. Montieren Sie die Probe auf dem Schaumstoffpolster. Reorganisieren Sie die Probe in der richtigen anatomischen Position. Flachen Sie den oralen und aboralen Teil des Zwölffingerdarms ab und führen Sie eine sanfte Bewegung aus.
    3. Beginnen Sie die Bewegung an der Zwölffingerdarmpapille und fahren Sie mit einer traumatischen Pinzette zu den Schneidkanten fort. Glätten Sie den weißen breiigen Inhalt des Magens, der nur im oralen Teil des Zwölffingerdarms auftritt. Stellen Sie sicher, dass Sie den oralen und den aboralen Teil des Zwölffingerdarms identifizieren, um eine wahrscheinliche Gallengangsrotation auszuschließen.
    4. Schneiden Sie große Reste von Lebergewebe weg, um mit der Dissektion des Gallengangs zu beginnen.
  2. Führen Sie die abschließende Isolierung durch.
    1. Drücken Sie das restliche Lebergewebe vorsichtig in die Poren der Schaummatte. Stellen Sie sicher, dass die Schabenbewegungen vom Gallengangssystem ausgehen und zu den Lebergrenzen führen.
    2. Überführen Sie die Probe nach einigen Schabenbewegungen in verschiedene Richtungen in eine sauberere Position auf der Schaummatte. Nutzen Sie den Vorteil von weniger gequetschtem Lebergewebe im Hintergrund, um die Sicht für die bestmögliche Unterscheidung zwischen EBDS und unerwünschten Zellen zu optimieren. Kratzen Sie das Lebergewebe aus dem Gallengang, bis nichts oder so wenig wie möglich vom Lebergewebe übrig bleibt.
    3. Verarbeiten Sie das hepatoduodenale Band, bis das isolierte EBDS verbleibt. Entfernen Sie intraligamentöse Blutgefäße wie die Leberarterie, die Pfortader und kleine Reste. Entfernen Sie dieses empfindliche Filament mit einem sanften Zug und hoher Sorgfalt auf die linke seitliche Seite. Dieser Dissektionsschritt kann bereits während der vorherigen Entfernung von Lebergewebe unbeabsichtigt oder teilweise abgeschlossen begonnen haben, was letztendlich zum gleichen Ergebnis führt.
      HINWEIS: Die Blutgefäße treten als weißes und sehr empfindliches Filament etwa 3-5 mm oral der Zwölffingerdarmpapille auf und verbinden das Hepatoduodenalband von der linken lateralen Seite und sammeln sich mit dem Gallengang zur Glisson-Triade. Nach Abschluss dieses Schritts wird die endgültige Probe vollständig isoliert. Wenn eine Aufzeichnung erforderlich ist, können Bilder aufgenommen werden, nachdem die Gallengangsstrukturen in ihre anatomische Position gebracht wurden (Abbildung 1). Es wird empfohlen, die letzten Vorbereitungsschritte auf einer Schaumstoffmatte durchzuführen, da die Probe nicht so stark an der Oberfläche des Operationsfeldes haftet. Wenn die Poren nass sind, schwebt oder schwimmt der Gallengang. Beim Bewegen der Probe haftet sie nicht so fest wie bei der Vorbereitung auf dem Operationstuch, was zu keinem Reißen beim Bewegen der Probe führt.

6. Vorbereitung für die histologische Analyse

  1. Die isolierte Probe wird so bald wie möglich nach der Dissektion in eine gepufferte Lösung, ein spezielles Medium oder formalinhaltige Fixiermittel (siehe Materialtabelle) gegeben.
  2. Wählen Sie eine geeignete Lagerlösung in Abhängigkeit von weiteren geplanten Verarbeitungsschritten.
    VORSICHT: Verwenden Sie formalinhaltige Fixiermittel wegen akuter Toxizität, Korrosivität und verschiedener Gesundheitsgefahren nur unter einer Lüftungsöffnung.
    HINWEIS: In der vorgestellten Studie wurden die EBDS-Proben in Paraformaldehyd eingefügt, dehydriert und in Paraffin eingebettet. Sie wurden bei Raumtemperatur gelagert und vor dem Schneiden abgekühlt. In einem Wärmeschrank wurden 2 μm Scheiben über Nacht aufbewahrt und mit herkömmlichem Hämatoxylin und Eosin4 gefärbt (siehe Materialtabelle).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt das EBDS eines murinen Neugeborenen, das mit der beschriebenen Technik seziert wurde. Mikroskopisch ist kein weiteres Lebergewebe sichtbar. Das Lebergewebe wurde während der letzten Isolationsschritte des Protokolls entfernt und konnte in Farbe und Konsistenz leicht vom Gallengangsgewebe unterschieden werden. Abbildung 1B zeigt die isolierte Probe im Vergleich zu einer Millimeterskala. Die Länge des EBD (gemessen von der Gallenblase bis zur Zw...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Artikel berichtete und diskutierte die Entwicklung und Validierung eines neuen chirurgischen Ansatzes zur Entfernung des EBDS von euthanasierten Neugeborenenmäusen. Mikroskopische und histologische Befunde zeigen, dass der Ansatz EBDs schnell erkennt und sie in der Nähe der Ränder des Kanals seziert, selbst bei neugeborenen Mäusen. Für das beschriebene Protokoll werden lediglich chirurgische Instrumente und ein Mikroskop mit einer 20-fachen Vergrößerung benötigt. Darüber hinaus ermöglicht der Ansatz die Isolierung...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Autoren danken Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl und Magdalena Trochimiuk für ihre Beiträge. Hans Christian Schmidt wurde gefördert durch das iPRIME-Stipendium der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-PropanolCHEMSOLUTE11365000als Dehydratisierungsmittel 30
G KanüleB Braun/Sterican, Melsungen Deutschland4656300Kanüle zur Hydratation der Probe
EntlüftungC + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, DeutschlandTec-Ononmic AZ 1200hilft durch die Verwendung einer Entlüftungsöffnung, das Einatmen von formalinhaltigen Fixiermitteln
zu vermeiden Aqua ad injectabilia BraunB Braun, Melsungen, Deutschland2351744Kochsalzlösung; Behälter: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, steril
Größere mikrochirurgische PinzetteDIADUST von Aesculap, TrossingenDeutschland FD253Rgerade, 180 mm (7"), Plattformspitze, runder Griff, Breite: 0,800 mm, diamantstaubbeschichtet, unsteril, wiederverwendbares optionales Werkzeug für die Beobachtung und jeden Schritt der Vorbereitung außer der allerletzten Präparation; Teilung der Haut des Peritoneums
Kamera " SmartCAM 5"  Basler and Vision Engineering, Send, United KingdomEVC131Aoptionales Lynx Exo Kameramodul: Sensortyp: CMOS, Auflösung 2560 x 1920 Pixel, Sensorgröße: 1/2"; Einsatz für Videoproduktion und technische Auswertung
Dörrmaschine/Citadel 2000 Tissue ProcessorFisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland12612613zur automatischen Dehydrierung, Kurzprogramm (ca. 4,8 h)
Dörrschwamm Carl Roth, Karlsruhe, DeutschlandTT56.1Schwamm für den abschließenden Dissektionsschritt, andere Schwämme/Schaumstoffpads mit einer Mindestporengröße von 60 Poren pro Zoll sind ebenfalls geeignet, die Verwendung von zwei Schaumstoffpads pro Einbettkassette wird empfohlen, um die Probe von unten und oben abzudecken, um ein Verrutschen durch die Perforation der Einbettkassetten
zu verhindern Dulbecco´ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14190-144Akut; Sie enthalten Calzium oder Magnesium, 500 mL
EinbettkassettenEngelbrecht GmbH, Edermü nde, Deutschland17990
EosinMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Deutschland41-6660-00Färbelösung, gebrauchsfertig
Feinschere CeramaCutFST, Heidelberg Deutschland14959-09Spitzen: scharf-scharf, Legierung / Material: Keramikbeschichteter Edelstahl, gezahnt:, Ja; Feature: CeramaCut, Spitzenform: Gerade, Schneide: 22 mm, Länge: 9 cm; Hautschnitt, Schnitt des Peritonealfensters
Graefe PinzetteFST, Heidelberg Deutschland11051-10Länge: 10 cm, Spitzenform: gebogen, gezackt, Spitzenbreite: 0,8 mm, Spitzenmaße: 0,8 x 0,7 mm, Legierung / Material: Edelstahl
HämatoxylinMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Deutschland41-5130-00Färbelösung, gebrauchsfertig
Highresolotion MikroskopVision Engineering, Send United KingdomEVO503 Kann bis zu 60-fache Vergrößerung vergrößert werden, es wurden nur 6- bis 20-fache Vergrößerungen verwendet.
MikroskopOlympus Optical CO, Ltd., Hamburg, DeutschlandBX60F5
Mikroskopabdeckung GläserMarienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland10124460 mm breit, aus SCHOTT D 263 Glas
ObjektträgerR. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Deutschland03-0060
MikrotomLeica, Nuß loch, DeutschlandSM2010RWerkzeug zum Schneiden (2 & Mikro; M-Scheiben) 
Omnifix-F 1 mL SpritzeB Braun, Melsungen, Deutschland9161406VSpritze ohne Kanüle
ParaffinSakura Finetec, Torrance, USA4511Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, ohne DMSO
Paraffin EinbettmaschineMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, DeutschlandTES 99Die in dieser Studie verwendete Einbettungsmaschine enthielt die folgenden drei Einzelmodule: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. Die Probe sollte direkt nach der Dehydrierung in Paraffin eingebettet werden, es sollte keine Zwischenlagerung im Kühlschrank wegen möglicher Schrumpfung und Feuchtigkeit im Kühlschrank durchgeführt werden
Paraformaldehyd (PFA)Morphisto1176201000Bereiten Sie 1 mL Aliquots in 2 mL konischen Eppendorf Röhrchen für Leberproben und 0,5 mL Aliquots in 1 mL konischen Eppendorf Röhrchen für extrahepatische Gallengangsproben vor, 4% in PBS ph 7,4 
Kleine mikrochirurgische ZangeEPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Deutschland(00)165Runder Griff, gerade, 0,3 mm Spitze, Werkzeug zur Beobachtung und für jeden Schritt der Vorbereitung, besonders nützlich in der Endvorbereitung
Edelstahl-LinealAgntho's AB, Lidingö, Schweden30085-15150mm mit metrischer & Zoll-Graduierungen
Chirurgische Schere – Scharf-stumpf für die EnthauptungFST, Heidelberg Deutschland14001-14Vorrichtung für die Enthauptung
WärmeschrankHaraeus, Hanau, DeutschlandT 6060Die geschnittenen Proben sollten im Wärmeschrank aufbewahrt werden, um die Befestigung der Probe auf den Objektträgern zu gewährleisten

Referenzen

  1. Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
  2. Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
  3. Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369(2015).
  4. Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
  5. Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621(2014).
  6. Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
  7. Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
  8. Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
  9. de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
  10. Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
  11. Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
  12. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226(2015).
  13. Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
  14. Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
  15. Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
  16. Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Murine NeonatenGallengangisolierungEn bloc ResektionDissektion des GallengangsystemsCholangiozytenisolierunghistologische Untersuchungatraumatische PinzettenLigamentum hepatoduodenale

Verwandte Artikel