Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

Zusammenfassung

Für die Beobachtung von neonatalen Gallengangsstörungen der Maus sind ein intakter Gallengang und eine effiziente Vorbereitung erforderlich. Daher wurde erfolgreich ein neuer Ansatz zur Isolierung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems bei murinen Neugeborenen unter Beibehaltung der Integrität des Gallengangs entwickelt.

Zusammenfassung

Die Dissektion der neonatalen Gallengänge von Mäusen wurde als schwierig beschrieben. Das Hauptziel der beschriebenen Standardarbeitsanweisung ist die Isolierung des extrahepatischen Gallengangs (EBD) bei Mausneugeborenen, ohne den Gallengang während der Präparation zu schädigen. Aufgrund seiner außergewöhnlich engen Präparation im Vergleich zur Cholangiozyten-Zelllinie und der Gewinnung des gesamten extrahepatischen Gallengangssystems (EBDS) ist der beschriebene Ansatz äußerst nützlich bei der Erforschung von Tiermodellen neugeborener Gallengangserkrankungen, wie z.B. der Gallenatresie. Nach der Euthanasie wurde die Peritonealhöhle betreten und Gallengangssystem, Zwölffingerdarm und Leber mit der einzigartigen En-bloc-Resektion (EbR) extrahiert. Die extrahierte Probe wird auf eine Schaumstoffmatte gelegt, und das EBD wird ohne notwendige Berührung atraumatisch von kontaminierenden Zellen seziert. Die Dissektion des gesamten EBDS ist ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Aufgrund der geringen Größe und Menge an Gallengangsgewebe ist Vorsicht geboten. Mit der beschriebenen Technik gibt es keine Schädigung der Cholangiozyten. Weiterhin ist die Reinheit der Technik reproduzierbar (n = 10). So können optimal vergleichbare Proben entnommen werden. Darüber hinaus wird kein Gallengangsgewebe geschädigt, da jeder Kontakt mit dem Gallengangssystem während der Präparation vermieden werden kann und die Gallenflüssigkeit in der Gallenblase verbleibt. Am wichtigsten ist, dass bei der Durchführung der abschließenden Gallenblasen- und Gallengangsdissektion atraumatische Mikroinstrumente nur geringfügig seitlich des Gallengangs verwendet wurden, ohne ihn zu quetschen. Dies ist der Schlüssel zu einer sauberen und intakten Probe und unerlässlich für weitere histologische Untersuchungen oder die Isolierung von Cholangiozyten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene innovative Dissektionstechnik es besonders unerfahrenen Bedienern ermöglicht, das EBDS möglichst sauber zu isolieren.

Einleitung

Die Entstehung und das Fortschreiten von Cholangiopathien wie Gallenatresie, primär sklerosierender Cholangitis (PSC) und primärer biliärer Cholangitis (PBC) sind entweder unbekannt oder unvollständig ^1,2. Das begrenzte Verständnis der Entstehung und des Verlaufs dieser Krankheiten führt zu einem Mangel an Therapieoptionen³. Das schwierigste Hindernis bei der Untersuchung neonataler Gallengangserkrankungen ist das molekulare Verständnis der Pathophysiologie. Einer der wesentlichen Schlüssel zum besseren Verständnis der molekularen Pathologie ist die bestmögliche Beobachtung des betroffe....

Protokoll

Nach der ethischen Zulassung (N045/2021) wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse bis zum Alter von 9 Tagen beobachtet. Die Tiere wurden von der Tiereinrichtung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland geboren und zu Versuchszwecken zur Verfügung gestellt. Die Neugeborenen wurden zusammen mit ihren Elterntieren in einem Käfig untergebracht. Die Umgebungsbedingungen wurden in Temperatur (20-24 °C), 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus und relativer Luftfeuchtigkeit von 40%-70% kontrolliert.

1. Versuchsvorbereitung

1. Bereiten Sie die erforderliche Ausrüstung für den chirurgischen Eingriff vor, einsc....

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt das EBDS eines murinen Neugeborenen, das mit der beschriebenen Technik seziert wurde. Mikroskopisch ist kein weiteres Lebergewebe sichtbar. Das Lebergewebe wurde während der letzten Isolationsschritte des Protokolls entfernt und konnte in Farbe und Konsistenz leicht vom Gallengangsgewebe unterschieden werden. Abbildung 1B zeigt die isolierte Probe im Vergleich zu einer Millimeterskala. Die Länge des EBD (gemessen von der Gallenblase bis zur Zw.......

Diskussion

Dieser Artikel berichtete und diskutierte die Entwicklung und Validierung eines neuen chirurgischen Ansatzes zur Entfernung des EBDS von euthanasierten Neugeborenenmäusen. Mikroskopische und histologische Befunde zeigen, dass der Ansatz EBDs schnell erkennt und sie in der Nähe der Ränder des Kanals seziert, selbst bei neugeborenen Mäusen. Für das beschriebene Protokoll werden lediglich chirurgische Instrumente und ein Mikroskop mit einer 20-fachen Vergrößerung benötigt. Darüber hinaus ermöglicht der Ansatz die Isolierung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	als Dehydratisierungsmittel 30
G Kanüle	B Braun/Sterican, Melsungen Deutschland	4656300	Kanüle zur Hydratation der Probe
Entlüftung	C + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Deutschland	Tec-Ononmic AZ 1200	hilft durch die Verwendung einer Entlüftungsöffnung, das Einatmen von formalinhaltigen Fixiermitteln
zu vermeiden Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Deutschland	2351744	Kochsalzlösung; Behälter: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, steril
Größere mikrochirurgische Pinzette	DIADUST von Aesculap, Trossingen	Deutschland FD253R	gerade, 180 mm (7"), Plattformspitze, runder Griff, Breite: 0,800 mm, diamantstaubbeschichtet, unsteril, wiederverwendbares optionales Werkzeug für die Beobachtung und jeden Schritt der Vorbereitung außer der allerletzten Präparation; Teilung der Haut des Peritoneums
Kamera " SmartCAM 5"	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optionales Lynx Exo Kameramodul: Sensortyp: CMOS, Auflösung 2560 x 1920 Pixel, Sensorgröße: 1/2"; Einsatz für Videoproduktion und technische Auswertung
Dörrmaschine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland	12612613	zur automatischen Dehydrierung, Kurzprogramm (ca. 4,8 h)
Dörrschwamm	Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland	TT56.1	Schwamm für den abschließenden Dissektionsschritt, andere Schwämme/Schaumstoffpads mit einer Mindestporengröße von 60 Poren pro Zoll sind ebenfalls geeignet, die Verwendung von zwei Schaumstoffpads pro Einbettkassette wird empfohlen, um die Probe von unten und oben abzudecken, um ein Verrutschen durch die Perforation der Einbettkassetten
zu verhindern Dulbecco´ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190-144	Akut; Sie enthalten Calzium oder Magnesium, 500 mL
Einbettkassetten	Engelbrecht GmbH, Edermü nde, Deutschland	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Deutschland	41-6660-00	Färbelösung, gebrauchsfertig
Feinschere CeramaCut	FST, Heidelberg Deutschland	14959-09	Spitzen: scharf-scharf, Legierung / Material: Keramikbeschichteter Edelstahl, gezahnt:, Ja; Feature: CeramaCut, Spitzenform: Gerade, Schneide: 22 mm, Länge: 9 cm; Hautschnitt, Schnitt des Peritonealfensters
Graefe Pinzette	FST, Heidelberg Deutschland	11051-10	Länge: 10 cm, Spitzenform: gebogen, gezackt, Spitzenbreite: 0,8 mm, Spitzenmaße: 0,8 x 0,7 mm, Legierung / Material: Edelstahl
Hämatoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Deutschland	41-5130-00	Färbelösung, gebrauchsfertig
Highresolotion Mikroskop	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Kann bis zu 60-fache Vergrößerung vergrößert werden, es wurden nur 6- bis 20-fache Vergrößerungen verwendet.
Mikroskop	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Deutschland	BX60F5
Mikroskopabdeckung Gläser	Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Deutschland	101244	60 mm breit, aus SCHOTT D 263 Glas
Objektträger	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Deutschland	03-0060
Mikrotom	Leica, Nuß loch, Deutschland	SM2010R	Werkzeug zum Schneiden (2 & Mikro; M-Scheiben)
Omnifix-F 1 mL Spritze	B Braun, Melsungen, Deutschland	9161406V	Spritze ohne Kanüle
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, ohne DMSO
Paraffin Einbettmaschine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Deutschland	TES 99	Die in dieser Studie verwendete Einbettungsmaschine enthielt die folgenden drei Einzelmodule: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. Die Probe sollte direkt nach der Dehydrierung in Paraffin eingebettet werden, es sollte keine Zwischenlagerung im Kühlschrank wegen möglicher Schrumpfung und Feuchtigkeit im Kühlschrank durchgeführt werden
Paraformaldehyd (PFA)	Morphisto	1176201000	Bereiten Sie 1 mL Aliquots in 2 mL konischen Eppendorf Röhrchen für Leberproben und 0,5 mL Aliquots in 1 mL konischen Eppendorf Röhrchen für extrahepatische Gallengangsproben vor, 4% in PBS ph 7,4
Kleine mikrochirurgische Zange	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Deutschland	(00)165	Runder Griff, gerade, 0,3 mm Spitze, Werkzeug zur Beobachtung und für jeden Schritt der Vorbereitung, besonders nützlich in der Endvorbereitung
Edelstahl-Lineal	Agntho's AB, Lidingö, Schweden	30085-15	150mm mit metrischer & Zoll-Graduierungen
Chirurgische Schere – Scharf-stumpf für die Enthauptung	FST, Heidelberg Deutschland	14001-14	Vorrichtung für die Enthauptung
Wärmeschrank	Haraeus, Hanau, Deutschland	T 6060	Die geschnittenen Proben sollten im Wärmeschrank aufbewahrt werden, um die Befestigung der Probe auf den Objektträgern zu gewährleisten