Verwendung des Gehirns von Kükenembryonen als Modell für in vivo und ex vivo Analysen des Verhaltens menschlicher Glioblastomzellen

Summary

Kükenembryonen werden zur Untersuchung von humanen Glioblastom-Hirntumoren (GBM) in ovo – und in ex vivo-Hirnschnitt-Kokulturen verwendet. Das Verhalten von GBM-Zellen kann durch Zeitraffermikroskopie in ex vivo Kokulturen aufgezeichnet werden, und beide Präparate können am experimentellen Endpunkt durch detaillierte konfokale 3D-Analyse analysiert werden.

Abstract

Der Kükenembryo ist ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung von Wirbeltieren, insbesondere für experimentelle Manipulationen. Die Verwendung des Kükenembryos wurde erweitert, um die Bildung von humanen Glioblastom-Hirntumoren (GBM) in vivo und die Invasivität von Tumorzellen in das umliegende Hirngewebe zu untersuchen. GBM-Tumoren können durch Injektion einer Suspension fluoreszenzmarkierter Zellen in den E5-Mittelhirnventrikel (optisches Tectum) in der Ovozelle gebildet werden.

Abhängig von den GBM-Zellen bilden sich nach dem Zufallsprinzip kompakte Tumore in der Herzkammer und innerhalb der Hirnwand, und Gruppen von Zellen dringen in das Hirnwandgewebe ein. Dicke Gewebeschnitte (350 μm) von fixierten E15-Tecta mit Tumoren können immungefärbt werden, um zu zeigen, dass eindringende Zellen häufig entlang von Blutgefäßen wandern, wenn sie durch 3D-Rekonstruktion von konfokalen z-Stapelbildern analysiert werden. Lebende E15-Mittelhirn- und Vorderhirnschnitte (250-350 μm) können auf Membraneinsätzen kultiviert werden, wo fluoreszenzmarkierte GBM-Zellen an nicht-zufälligen Stellen eingeführt werden können, um Ex-vivo-Kokulturen zur Analyse der Zellinvasion, die auch entlang von Blutgefäßen auftreten kann, über einen Zeitraum von etwa 1 Woche bereitzustellen. Diese ex vivo Co-Kulturen können mittels Weitfeld- oder konfokaler Fluoreszenz-Zeitraffermikroskopie überwacht werden, um das Verhalten lebender Zellen zu beobachten.

Kokultivierte Scheiben können dann fixiert, immungefärbt und durch konfokale Mikroskopie analysiert werden, um festzustellen, ob die Invasion entlang von Blutgefäßen oder Axonen erfolgte oder nicht. Darüber hinaus kann das Co-Kultursystem zur Untersuchung potenzieller Zell-Zell-Interaktionen verwendet werden, indem Aggregate verschiedener Zelltypen und -farben an verschiedenen präzisen Orten platziert und Zellbewegungen beobachtet werden. Medikamentöse Behandlungen können an Ex-vivo-Kulturen durchgeführt werden, wobei diese Behandlungen nicht mit dem In-ovo-System kompatibel sind. Diese beiden komplementären Ansätze ermöglichen detaillierte und präzise Analysen des Verhaltens menschlicher GBM-Zellen und der Tumorbildung in einer hochgradig manipulierbaren Gehirnumgebung von Wirbeltieren.

Introduction

In-vitro-Studien des Verhaltens von Krebszellen werden häufig verwendet, um potenzielle Mechanismen zu analysieren, die während des komplexeren Verhaltens wirken, das während der Tumorbildung und Zellinvasion in In-vivo-Xenotransplantatmodellen beobachtet wird. Zum Beispiel haben In-vitro-Studien beim Glioblastom (GBM) Mechanismen aufgedeckt, wie L1CAM möglicherweise während der Tumorbildung und der Gehirninvasion in einem neuartigen Kükenembryo-Xenotransplantat-Hirntumormodell^{wirkt 1,2,3,4,5}. Obwohl sich In-vitro– und In-vivo-Experimente auf nützliche Weise ergänzen, hinterlassen sie eine erhebliche Lücke in der Korrelation der Ergebnisse. Zum Beispiel sind mechanistische Analysen der GBM-Zellmotilität auf einer Schale eine hochgradig künstliche Situation, und In-vivo-Xenograft-Modelle können nur statische Zeitpunkt– oder Endpunktanalysen der Tumorbildung und des Zellverhaltens aufdecken. In-vivo-Studien mit Nagetieren oder Kükenembryonen eignen sich nicht ohne weiteres zur Überwachung des Zellverhaltens, während die Zellen in diesen Xenotransplantatmodellen in Hirngewebe eindringen. Nichtsdestotrotz hat das Xenotransplantatmodell des Kükenembryos gezeigt, dass das Adhäsionsprotein L1CAM eine stimulierende Rolle bei der Invasionsfähigkeit menschlicher T98G-GBM-Zellen spielt ^2,5.

Eine geeignete Lösung für dieses Problem kann durch die Überbrückung sowohl von In-vivo- als auch von In-vitro-Methoden unter Verwendung eines organotypischen Hirnschnittkulturmodells, einem sogenannten Ex-vivo-Modell, erreicht werden. In diesem Ex-vivo-Modell kann lebendes Hirngewebe bis zu einigen Wochen in einer Dicke von mehreren hundert Mikrometern gehalten werden, was es ermöglicht, Krebszellen zu implantieren, ihr Verhalten im tatsächlichen Gewebe im Laufe der Zeit zu beobachten und dann am Endpunkt des Experiments eine detailliertere Markeranalyse durchzuführen.

Eine beliebte organotypische Schnittkulturmethode besteht darin, eine mehrere hundert Mikrometer dicke Hirnscheibe auf einer durchscheinenden oder transparenten porösen Membran zu kultivieren, wobei das Gewebe der Luft ausgesetzt bleibt und dennoch Nährmedien das Gewebe von unterhalb der Membran erhalten können (siehe Stoppini et ^al.6). Verschiedene Variationen dieser Methode wurden für verschiedene Studien verwendet, einschließlich der Verwendung unterschiedlicher Medien oder unterschiedlicher Membraneinsätze. Zu den verschiedenen Membraneinsätzen gehören ein poröser (0,4 μm) Membraneinsatz mit 30 mm Durchmesser in einer 35-mm-Kulturschale⁶ und Zellkultureinsätze (0,4 μm) für 6-Well-Platten⁷. Zu den verschiedenen Medien gehören 50 % MEM/HEPES + 25 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum + 25 % Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)⁸, 50 % reduzierte Serummedien + 25 % Pferdeserum + 25 % HBSS⁹ sowie andere. Wenn eine transluzente oder transparente Membran zusammen mit fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen verwendet wird, können solche Kulturen von unten mit einem inversen Weitfeld- oder konfokalen Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden 10,11,12,13,14,15.

Während viele in vivo orthotope Hirntumor-Xenotransplantate und ex vivo organotypische Hirnschnittkulturmodelle mit Nagetieren etabliert wurden, wurde der Kükenembryo (Gallus gallus) für diese Zwecke nicht ausreichend genutzt. Es wurde jedoch gezeigt, dass der Kükenembryo als orthotopes Xenotransplantatmodell in vivo für die Untersuchung der Invasion von Gliomen beim Menschen und bei Ratten verwendet werden kann ^1,2,5. Xenotransplantierte Zellen in das Gehirn von Kükenembryonen zeigten ähnliche Invasionsmuster wie in Nagetiermodellen, was die Verwendung von Kükenembryonen als In-vivo-Modell für die Analyse von GBM-Tumorzellen weiter unterstützt. Kükenembryonen sind auch kostengünstig, können leichter gepflegt werden als Nagetiere (d. h. in ihren Eierschalen in einem Laborinkubator) und sind viel einfacher zu verarbeiten, was sie zu einer attraktiven Option für kurzfristige In-vivo-GBM-Studien macht. In einem kürzlich erschienenen Artikel wurde die Verwendung von Gehirnschnittkulturen aus Kükenembryonen für die Bildung und das Wachstum von Axonen während der normalen Gehirnentwicklung beschrieben, bei denen die Schnitte mindestens 7 Tage lang lebensfähig waren¹⁶. Die Verwendung solcher Kükenembryonen-Hirnschnittkulturen für die ex vivo Analyse des Verhaltens von GBM-Zellen in einer Gewebeumgebung fehlt jedoch. In diesem Artikel wird sowohl die Transplantation von humanen GBM-Zellen und GBM-Stammzellen (GSCs) in das Gehirn des frühen Kükenembryos in vivo beschrieben, als auch die Einführung von GBM-Zellen in lebende Kükenembryonen-Hirnschnittkulturen ex vivo. Einige repräsentative Beispiele für die resultierenden Tumore und Zellinvasionsmuster, die aus diesen Präparaten gewonnen werden, werden ebenfalls bereitgestellt.

Protocol

Für die Durchführung dieser Arbeiten war keine Freigabe oder Genehmigung an der University of Delaware erforderlich.

1. Injektion von GBM-Zellen in das optische Tectum des Kükens

1. Vorbereitung von GSCs und GBM-Zellen für die Injektion
   1. Kultivieren von GSCs in GSC-Medien (Tabelle 1). Kultivierte GBM-Zelllinien in GBM-Medien (Tabelle 1).
   2. Spülen Sie die Zellen auf Tellern mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab und geben Sie 1 ml Trypsinlösung in eine 10-cm-Schale. 2-3 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator ruhen lassen, bis sich die Zellen zu lösen beginnen.
   3. Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 ml geeignetes serumhaltiges Nährmedium in die 10-cm-Schale geben und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren lösen. Legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 ml.
   4. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 800 × g für 5 min bei 4 °C pelletiert.
   5. Saugen Sie das Medium aus dem Zellpellet mit einer Einweg-Feinglaspipette ab, die an einem Seitenarmkolben und einer Vakuumpumpe befestigt ist. Resuspendieren Sie die Zellen in geeigneten Nährmedien auf eine Konzentration von 10.000 Zellen pro Mikroliter und legen Sie sie in ein Mikrofugenröhrchen oder ein kleines Schraubröhrchen auf Eis.
   6. Mischen Sie die Zellen mit einer kleinen Menge sterilem 1% Fast Green FCF-Farbstoff (verwenden Sie ein Verhältnis von 5 μl Farbstoff zu 100 μl Zellsuspension).
2. Injektion von GBM-Zellen in das E5-optische Tectum in ovo. Siehe ergänzende Abbildung 1.
   1. Die befruchteten Hühnereier werden in einem befeuchteten Ei-Inkubator mit dem spitzen Ende nach unten bei 37,5 °C bebrütet (der 1. Bruttag ist der Embryonaltag 0 [E0]). Am 6. Tag der Inkubation (E5) sterilisieren Sie die Eierschale durch Besprühen mit 70%igem Ethanol.
   2. Zeichnen Sie mit einem Ei-Kerzen mit einem Bleistift den Umfang des Luftraums über dem Embryo nach und bedecken Sie den umrissenen Bereich mit transparentem Klebeband.
   3. Schneiden Sie mit einer gebogenen Schere vorsichtig um den nachgezeichneten Bereich herum, achten Sie darauf, nicht in die embryonalen Membranen oder Blutgefäße zu schneiden, und entsorgen Sie die Oberseite der Eierschale.
   4. Geben Sie ein paar Tropfen Kochsalzlösung oder Zellkulturmedien auf die Luftraummembran, um sie zu benetzen, damit sie sich leicht lösen kann. Stechen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig in die Luftraummembran über der Oberseite des Embryos, entfernen Sie sie und lokalisieren Sie den Kopf des Kükenembryos.
   5. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die transparente Amnionmembran zu greifen, die den Embryo unmittelbar umgibt, um den Kopf so zu positionieren, dass das optische Tectum mit Zellen injiziert werden kann. Halten Sie sich mit einer Hand mit der feinen Pinzette am Amnion fest, um den Kopf während des Injektionsvorgangs an Ort und Stelle zu halten. Achten Sie darauf, die extraembryonalen Blutgefäße in der chorioallantoischen Membran auf dem Eigelb nicht zu beschädigen.
      HINWEIS: Das obige Verfahren erfordert etwas Übung, um die durchsichtige Amnionmembran, die den Embryo innig umgibt, effizient greifen zu können, da sie unsichtbar ist, bis sie gegriffen und gezogen wird. Üben Sie mit einer feinen Pinzette, um das klare Amnion zu greifen, das den Embryo unmittelbar umgibt.
   6. Halten Sie den Kopf ruhig, indem Sie die Amnionmembran mit einer feinen Pinzette greifen. Injizieren Sie mit einer Glasmikropipette und einer pneumatischen Picopumpe ca. 50.000 Zellen in 5 μL geeignetem Zellkulturmedium in das optische Tectum (5 μL entsprechen ca. 1/2 einer gefüllten Mikropipette).
      HINWEIS: Siehe Cretu et ^al.1 für ein Bild eines E5-Embryos, dem GBM-Zellen injiziert wurden, die mit Farbstoff gemischt wurden.
   7. Geben Sie ein paar Tropfen 50 mg/ml Ampicillin auf den Embryo.
   8. Decken Sie das Loch in der Oberseite der Eier mit durchsichtigem Klebeband ab und lassen Sie es zum Sezieren bis E15 im Luftbefeuchter.

2. Präparation von Hirnregionen aus E15-Embryonen

ANMERKUNG: Die Dissektion von E15-Gehirnen hier zur Fixierung ähnelt der in Schritt 8.2 beschriebenen für lebende Hirnschnitte, aber die Dissektion hier muss nicht unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Schneiden Sie das Klebeband um die Oberseite der Schale ab, um den Zugang zum Embryo zu ermöglichen.
2. Enthaupten Sie den Embryo am Hals und legen Sie den Kopf in eine 10-cm-Schale mit steriler kalzium- und magnesiumfreier Tyrode-Lösung (CMF Tyrode). Siehe ergänzende Abbildung 2.
3. Ziehen Sie mit einer feinen Pinzette die Haut ab, die das Gehirn bedeckt, um die darunter liegende Dura mater freizulegen. Entfernen Sie die sich bildenden Schädelknochen auf der linken und rechten Seite des Gehirns. Die sich bildenden Schädelknochen bedecken noch nicht den größten Teil des Gehirns.
4. Reißen Sie vorsichtig mit einer feinen spitzen Pinzette durch die Hirnhäute, die über der Mitte des Gehirns liegen, und ziehen Sie sie zu jeder Seite ab, um das Gehirn freizulegen.
5. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um das Gehirn von unten zu schöpfen und es vorsichtig aus seiner Höhle zu ziehen.
6. Zerlegen Sie das Gehirn in seine Teile: Vorderhirn, Tecta, Kleinhirn.
7. Entfernen Sie die darüber liegende Pia mater mit einer feinen Pinzette aus der Tecta. Beachten Sie, dass sich die Pia leicht von der Tecta trennt, aber nicht vom Vorderhirn oder Kleinhirn. Entfernen Sie die Pia aus dem Vorderhirn, indem Sie sie berühren oder auf einem kleinen Stück Filterpapier rollen.
8. Die präparierten Hirnregionen in eine kleine Schüssel geben.
9. Legen Sie die Hirnregionen zur Fixierung in eine 24-Well-Plattenvertiefung und fixieren Sie sie in 2%igem Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer. Mindestens 24 h bei 4 °C ruhen lassen.
10. Spülen Sie das Gewebe nach der Fixierung mindestens 1 Stunde lang in 3x PBS aus, bevor Sie es in Agar einbetten.

3. Einbetten und Schneiden von geernteten Hirnregionen

1. Eine Lösung aus 3,5 % Agar und 8 % Saccharose in PBS vorwärmen, bis sie geschmolzen ist, und bei Schmelztemperatur halten.
2. Nehmen Sie mit einer gebogenen Pinzette als Schaufel vorsichtig entweder das optische Tectum oder die Vorderhirnregion des Gehirns des Kükenembryos auf und tupfen Sie es leicht auf Filterpapier ab, um zusätzliche Flüssigkeit zu entfernen und die Haftung des Agars an der äußeren Gehirnoberfläche sicherzustellen.
3. Füllen Sie die Form mit einer sterilen Transferpipette mit Agarlösung.
   Anmerkungen: Eine einfache Form kann hergestellt werden, indem Aluminiumfolie um ein Objekt geeigneter Größe geformt wird, z. B. kleine rechteckige vibrierende Gewebeschneideblöcke aus Metall.
4. Legen Sie die Gehirnregion in Agar und lassen Sie den Agar vollständig erstarren.
5. Entfernen Sie die Alufolie um das eingebettete Gehirn herum und schneiden Sie überschüssiges Agar mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell an den Seiten ab.
6. Geben Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf das Edelstahlquadrat der Schneideschale, legen Sie den Agaroseblock mit dem Gehirn auf den Kleber und lassen Sie den Kleber 1 Minute lang einwirken. Setzen Sie die Schale in das Spannfutter für vibrierende Tissue-Aufschnittmaschinen ein, ziehen Sie sie fest und füllen Sie die Schale mit genügend PBS, um die Oberseite des Agarblocks zu bedecken.
7. Schneiden Sie die Gehirnschnitte auf einem 350 μm dicken Vibrationsgewebeschneider mit einer Rasierklinge aus Stahl.
8. Wenn die Hirnscheiben geschnitten sind und frei in die Schneideschale schwimmen, verwenden Sie einen Spatel, um die Scheiben aufzunehmen und aus der Schale zu nehmen. Schieben Sie den Abschnitt vorsichtig vom Spatel und in eine beschriftete 10-cm-Petrischale mit PBS, damit die Abschnitte frei schwimmen.
   Anmerkungen: Der Agar, der den Hirnschnitt umgibt, kann sich lösen, wenn das Gehirn nicht ausreichend mit Filterpapier abgetupft wird, um überschüssige Flüssigkeit vor dem Einbetten zu entfernen. In diesem Fall kann das Hirngewebe schonend aus dem erstarrten Agar entfernt und nach ordnungsgemäßem Abtupfen der überschüssigen Flüssigkeit wieder eingebettet werden.

4. Immunfärbung von Hirnschnitten mit Tumorzellen

1. Untersuchen Sie mit einem Stereomikroskop, das mit Epifluoreszenz ausgestattet ist, einzelne Schichten in der 10-cm-Schale nacheinander auf das Vorhandensein oder Fehlen von Tumorzellen.
2. Bereiten Sie eine ausreichende Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Triton X-100 und 5 % normalem Ziegenserum (PBSTG) (siehe Tabelle 1) für die Immunfärbung vor und spülen Sie die zu immunfärbenden Scheiben ab.
3. Füllen Sie die Vertiefungen zur Hälfte in eine 24-Well-Platte, die für die Färbung von Gehirnschnitten mit PBS verwendet wird.
4. Schneiden Sie die Ecken des Agars um die Hirnscheiben herum mit der Kante eines Spatels oder Skalpells ab und legen Sie sie vorsichtig in die Vertiefungen, die PBS enthalten.
5. Das PBS wird abgesaugt und durch 350 μl primäre Antikörper-Färbelösung in PBSTG ersetzt (z. B. 2 μg/ml UJ127 in PBSTG).
6. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem Kühlraum unter sanftem Rühren, so dass sich die Scheibe frei in der Vertiefung bewegen kann.
7. Nach 24 h wird die primäre Antikörperlösung entfernt und 3 x 1 h mit PBSTG in einem Kühlraum mit Rühren gespült.
8. Nach dem Spülen in 350 μl/Well sekundärer Antikörper-Färbelösung in PBSTG inkubieren (z. B. 1/200 Verdünnung von Biotin-GAM in PBSTG). 20 h in einem Kühlraum mit Rühren inkubieren.
   Anmerkungen: Wenn Sie auf den tertiären Schritt verzichten und in diesem Schritt mit dem fluorochromhaltigen Sekundärantikörper inkubieren, decken Sie den Deckel ab sofort ab, um sich während der Inkubation vor Licht zu schützen, und fahren Sie dann mit Schritt 4.11 fort.
9. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und spülen Sie 3 x 1 h in PBSTG in einem Kühlraum mit Rühren.
10. Entfernen Sie das PBSTG und inkubieren Sie es in der tertiären Lösung (z. B. 1:250 Verdünnung von Alexa Fluor 647 Streptavidin in PBSTG). Falls gewünscht, färben Sie die Kerne in diesem Schritt, indem Sie der Mischung 0,1 μg/ml Bisbenzimid hinzufügen. 20 h in einem Kühlraum mit Rühren inkubieren.
11. Entfernen Sie die Tertiärlösung und spülen Sie 3 x 1 h in PBSTG in einem Kühlraum mit Rühren.
12. In PBS belassen, bis es auf Objektträgern montiert werden kann.

5. Scheiben auf Objektträger montieren

1. Bereiten Sie so viele Objektträger vor, wie es zu montierende Abschnitte gibt.
2. Legen Sie für jeden Objektträger einen 50 mm langen Streifen mit 10 mil (254 μm) dickem Vinyl-Isolierband auf ein Stück Parafilm.
3. Stanzen Sie mit einem quadratischen Locher von 1 cm x 1 cm ein Loch durch die Mitte des Isolierbandes und des Parafilms.
4. Ziehen Sie das Klebeband vom Parafilm ab und legen Sie es auf den Objektträger, wobei Sie Platz für das Beschriftungsband auf dem Objektträger lassen.
5. Geben Sie mit einer Mikropipette ein oder zwei Tropfen des lichtbeständigen Eindeckmediums in das quadratische Loch in der Mitte des Isolierbandes.
6. Verwenden Sie einen gebogenen Spatel, um den gewünschten vibrierenden Tissue-Slicer-Abschnitt vom PBSTG abzuheben und Feuchtigkeit mit einem sauberen Labortuch oder einem Stück Filterpapier gründlich abzuleiten.
7. Berühren Sie den Rand der Scheibe mit dem Tropfen Eindeckmittel und schieben Sie den Abschnitt mit einem anderen Spatel vorsichtig in das Eindeckmedium.
8. Decken Sie den Abschnitt mit ein paar weiteren Tropfen Eindeckmittel ab und legen Sie vorsichtig ein 24 mm x 30 mm (#1,5 Dicke) Deckglas auf den Abschnitt und das Eindeckmittel.
9. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack, um es an Ort und Stelle zu halten.

6. Konfokale Mikroskopie festsitzender Hirnschnitte

1. Verwenden Sie Weitfeldfluoreszenz, um fluoreszierende Tumore in der montierten Hirnschicht zu finden, indem Sie die entsprechenden Objektivlinsen und Filtersätze verwenden.
   HINWEIS: Einige Tumore können ziemlich groß sein und sind mit dem 4x-Objektiv leicht sichtbar, während einzelne Zellen das 10x-Objektiv erfordern können.
2. Wechseln Sie zur konfokalen Mikroskopie mit einem geeigneten Objektiv, Lasern, Lochblendengröße und Detektoreinstellungen. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie ein 20-fach-Objektiv (numerische Apertur [N.A.] = 0,75) für die Routinebildgebung und ein 60-faches Ölobjektiv (N.A. = 1,40) für hochauflösende Bildgebung.
3. Legen Sie obere und untere Grenzen der z-Achse und der Schrittweite (für die spezifische Situation gemäß den Anweisungen des Herstellers des konfokalen Mikroskops) für die Aufnahme optischer Schnitte fest. Erfassen Sie einen Z-Stapel optischer Schnitte.
4. Verwenden Sie die konfokale Mikroskopsoftware, um ein 3D-Volumen-Rendering des Tumors gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erstellen.

7. Sphäroid-Präparation

1. Herstellung von Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)-Platten (Poly-HEMA)
   1. Stellen Sie eine Lösung aus 10 μg/ml Poly-HEMA in 95%igem Ethanol her und beschichten Sie 35-mm-Petrischalen (oder Zellkulturschalen) mit 1 ml dieser Lösung.
   2. Lassen Sie das Geschirr über Nacht bei Raumtemperatur auf einer unbedeckten Wippe stehen, um eine Beschichtung der Schalenoberfläche zu entwickeln.
      Anmerkungen: Das Lösungsmittel verdunstet und hinterlässt eine durchscheinende Beschichtung auf der Schale, die ungleichmäßig erscheinen kann, aber dies hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit, Zellsphäroide zu bilden.
   3. Nach dem Trocknen sterilisieren Sie das offene Geschirr unter UV-Licht in einer Biosicherheitswerkbank für 1 h. Setzen Sie die Deckel nach der Sterilisation wieder auf. Die beschichteten Schalen sind nun gebrauchsfertig.
2. Fluoreszenz-DiD-Färbung für die Zeitraffermikroskopie
   HINWEIS: Dieser Abschnitt ist für die Färbung einzelner Zellen mit DiD-Fluoreszenzfarbstoff vorgesehen, der zur Herstellung von Sphäroiden verwendet wird, wodurch die Visualisierung der Zellmotilität für Live-Zeitrafferaufnahmen optimiert wird.
   1. Suspendieren Sie die Zellen in einem serumfreien Nährmedium.
   2. Fügen Sie 5 μl DiD-Stamm / ml Zellsuspension hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. 20 min bei 37 °C inkubieren.
   3. Die markierte Zellsuspension wird bei 800 × g bei 5 °C für 5 min zentrifugiert.
   4. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in warmen Medien, um sie zu spülen.
   5. Wiederholen Sie diese Zentrifugation und spülen Sie den Schritt noch zwei weitere Male.
      Anmerkungen: Falls gewünscht, fahren Sie mit Schritt 7.3.6 fort, um sofort nach diesem Vorgang Sphäroide zu erstellen.
3. Herstellung von Zellsphäroiden
   1. 0,25%ige Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung auf 37 °C erwärmen.
   2. Kultivieren Sie GSCs in GSC-Medien¹⁷ (Tabelle 1) und U-118-Malignomgloima (MG)-Zellen in U-118-Nährmedium (siehe Tabelle 1). Verwenden Sie eine konfluente 10-cm-Schale für die Zubereitung einer 35-mm-Platte mit Sphäroiden. Die Wachstumsfaktoren bFGF (10 ng/ml Endkonzentration) und TGF-α (20 ng/ml Endkonzentration) werden zunächst und dann alle 3 Tage zu den GSCs gegeben.
      HINWEIS: Die in der aktuellen Studie verwendeten Zellen waren grünes GSC15-2/K72, grünes GSC16-4/K72, rotes U-118/L1LE/mCherry2x und rotes U-118/1879/mCherry2x. Eine Platte mit Sphäroiden sollte für zwei 6-Well-Platten mit Hirnschnitten auf Membraneinsätzen ausreichen.
   3. Spülen Sie die Zellen auf den Platten mit sterilem PBS ab und geben Sie 1 ml Trypsinlösung auf eine 10-cm-Schale. Für 2-3 min in den Zellkultur-Inkubator geben, bis sich die Zellen zu lösen beginnen.
   4. Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 ml geeignetes serumhaltiges Nährmedium in die 10-cm-Schale geben und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren lösen. Legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 ml.
   5. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 800 × g für 5 min bei 4 °C pelletiert.
   6. Saugen Sie das Medium aus dem Zellpellet ab und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Medien.
   7. Geben Sie 2 ml Zellsuspension auf jede 35-mm-Poly-HEMA-beschichtete Schale und fügen Sie weitere 2 ml des geeigneten Mediums hinzu, um 4 ml Gesamtmedium pro Schale zu erhalten. Wenn Sie GSCs verwenden, fügen Sie Wachstumsfaktoren hinzu.
   8. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator, bis die Aggregate eine Größe von 100-200 μm erreichen, was je nach Dichte der beschichteten Zellen 1-2 Tage dauern kann.

8. Sektion des Gehirns von lebenden Küken und Schneiden von vibrierenden Gewebeschneidemaschinen

1. Vorbereitung auf die Präparation
   1. Bereiten Sie eine 6-Well-Polyestermembran-Einlegeplatte mit 1 ml Hirnschnitt-Nährmedium (siehe Tabelle 1) unter dem Membraneinsatz vor.
   2. Sterilisieren Sie den Arbeitsbereich und die Werkzeuge mit 70 % Ethanol.
   3. Legen Sie die 6-Well-Einlegeplatte während der Präparation auf Eis.
   4. Bereiten Sie 100 ml vibrierendes Tissue-Slicer-Schneidemedium vor (Tabelle 1) und legen Sie es auf Eis.
   5. Eine Durchstechflasche mit 4 % niedrig schmelzender Agarose in PBS in ein Wasserbad stellen, bis sie zu einer Flüssigkeit schmilzt (ca. 50 °C).
   6. Füllen Sie die Wanne des vibrierenden Taschentuchschneiders mit Eis.
2. Aseptische E14/15 Gehirndissektion des Kükenembryos
   1. Zeichnen Sie mit einer Eikerze mit einem Bleistift den Umfang der Lufttasche über dem E14- oder E15-Embryo nach und bedecken Sie den umrissenen Bereich mit transparentem Klebeband.
   2. Schneiden Sie mit einer gebogenen oder feinen Schere vorsichtig um den nachgezeichneten Bereich herum, achten Sie darauf, nicht in die Embryomembran oder die Blutgefäße zu schneiden, und werfen Sie das obere Stück der Schale weg.
   3. Entfernen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Luftraummembran über der Oberseite des Embryos und lokalisieren Sie den Kopf des Kükenembryos.
   4. Enthaupten Sie den Embryo und legen Sie den Kopf in eine 10-cm-Schale mit kalter, steriler CMF-Lösung. Siehe ergänzende Abbildung 2.
   5. Ziehen Sie mit einer sterilen, feinen Pinzette die Haut ab, die das Gehirn bedeckt, um die darunter liegende Dura mater freizulegen. Entfernen Sie die sich bildenden Schädelknochen auf der linken und rechten Seite des Gehirns. Die sich bildenden Schädelknochen bedecken noch nicht den größten Teil des Gehirns.
   6. Reißen Sie vorsichtig mit einer feinen spitzen Pinzette (#5 oder #55) durch die Hirnhäute, die über dem Zentrum des Gehirns liegen, und schälen Sie sie zu jeder Seite, um das Gehirn freizulegen.
   7. Schöpfen Sie das Gehirn mit einer fein gebogenen Pinzette von unten nach oben und ziehen Sie es vorsichtig aus seiner Höhle.
   8. Zerlegen Sie das Gehirn in seine drei Hauptteile: Vorderhirn, Mittelhirn (optische Tecta), Kleinhirn. Konsultieren Sie bei Bedarf einen Atlas der Kükenentwicklung.
   9. Entfernen Sie die darüber liegende Pia mater mit einer feinen Pinzette aus der Tecta.
      ANMERKUNG: Die Pia löst sich leicht von der Tecta, aber nicht vom Vorderhirn oder Kleinhirn. Die Pia kann aus dem Vorderhirn entfernt werden, indem man sie berührt oder auf steriler Gaze rollt.
   10. Legen Sie die präparierten Gehirnregionen in eine kleine sterile Schale auf Eis.
3. Das Gehirn einbetten und in Scheiben schneiden
   1. Nehmen Sie mit einer gebogenen Pinzette als Schaufel vorsichtig entweder das optische Tectum oder die Vorderhirnregion auf und tupfen Sie sie leicht auf sterile Gaze, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und die Haftung der Agarose an der äußeren Gehirnoberfläche sicherzustellen.
   2. Füllen Sie die Form mit einer sterilen Transferpipette mit niedrig schmelzender Agarose. Bereiten Sie eine einfache Form vor, indem Sie Aluminiumfolie um ein Objekt entsprechend großer Größe formen. Der kleine rechteckige vibrierende Gewebeschneideblock aus Metall wird routinemäßig als Objekt verwendet. Siehe ergänzende Abbildung 3.
   3. Legen Sie die Gehirnregion schnell in Agarose und lassen Sie sie auf Eis erstarren (ca. 4-5 Minuten).
      Anmerkungen: Das Gehirn kann auf den Boden des Schimmelpilzes sinken, bevor die Agarose aushärtet. Warten Sie in diesem Fall 1 Minute, bis der Agar fest wird, und legen Sie dann die Gehirnregion in die Agarose. Versuchen Sie, die Hirnregion direkt in der Mitte der Agarose aufzuhängen.
   4. Entfernen Sie die Aluminiumfolie um das eingebettete Gehirn herum in der verfestigten Agarose und schneiden Sie überschüssige Agarose mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell an den Seiten ab.
   5. Geben Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf das Edelstahlquadrat der Schneideschale/des Tabletts, legen Sie den Agaroseblock mit dem Gehirn und lassen Sie den Kleber 1 Minute lang einwirken. Legen Sie die Schale/das Tablett in das Spannfutter des Vibrationstuchschneiders, ziehen Sie es fest und füllen Sie das Tablett mit Schneidemedien, um die Oberseite des Agaroseblocks zu bedecken.
   6. Schneiden Sie die Abschnitte auf einem vibrierenden Gewebeschneider bei 250-350 μm mit einem Saphirmesser ab, von dem berichtet wurde, dass es zu weniger Schäden an lebendem Gewebe führt als eine Rasierklinge aus Stahl.
   7. Wenn die Hirnscheiben geschnitten sind und frei in die Schneideschale schwimmen, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um die Scheibe aufzunehmen und aus der Schale zu nehmen. Schieben Sie den Abschnitt vorsichtig vom Spatel ab und auf einen Membraneinsatz mit einem anderen sterilen Spatel.
      HINWEIS: Normalerweise können auf Wunsch zwei oder drei Hirnschnitte auf jeden Membraneinsatz gelegt werden. Die Agarose, die den Hirnschnitt umgibt, kann sich lösen, wenn das Gehirn nicht ausreichend mit steriler Gaze abgetupft wird, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Tritt dies nach ausreichendem Blotting vor dem Einbetten immer noch auf, nehmen Sie die Scheibe ohne die umgebende Agarose vorsichtig auf und schieben Sie sie auf den Membraneinsatz.
   8. Legen Sie die 6-Well-Platte mit Hirnschnitten auf Membraneinsätze in den Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
   9. Verwenden Sie am Tag nach dem Plattieren eine sterile Pasteurpipette, um das Medium von unterhalb des Einsatzes abzusaugen (an den Seiten der Einsätze befinden sich Lücken, damit eine Pipette Zugang zu dem darunter liegenden Medium erhält). Geben Sie 1 ml frisches Schneidemedium in jede Vertiefung unter dem Membraneinsatz. Wechseln Sie danach jeden zweiten Tag das Medium.
   10. Warten Sie ein paar Tage, bis die Hirnschnitte fest an den Membraneinsätzen haften und sich etwas abzuflachen scheinen. Dies ist ein Zeichen dafür, dass die Scheiben lebensfähig und bereit für die Einführung von GBM-Zellen sind.

9. GBM-Zelleinschleusung in Hirnschnitte

1. Sphäroid-Methode
   1. Nachdem die Zellsphäroide eine Größe von 150-200 μm erreicht haben, verwenden Sie eine 20-μl-Mikropipette, die auf 5 μl eingestellt ist, um ein bis mehrere Sphäroide aus ihrer Kulturschale zu entfernen. Siehe ergänzende Abbildung 3.
   2. Stoßen Sie das Medium vorsichtig mit Sphäroiden auf die gewünschte Hirnscheibe aus.
      Anmerkungen: Die Zellkugeln sollten in der Pipettenspitze sichtbar sein. Wenn Sie eine durchsichtige Pipettenspitze verwenden, sind sie in der Spitze leichter zu erkennen. Wenn das Sphäroid bei der Freisetzung der Flüssigkeit von der Hirnscheibe abfällt, sollte eine ethanolsterilisierte Wimper verwendet werden, die auf einen dünnen Holzapplikatorstab geklebt ist, um das Sphäroid vorsichtig wieder auf die Hirnscheibe zu schieben.
   3. Lassen Sie die Sphäroide 2-5 Tage lang auf den Hirnschnitten kultivieren.
      HINWEIS: Die Einschränkung scheint hier der eventuelle Abbau von Blutgefäßen und Gehirnzellen in der Scheibe zu sein. Abgebaute Blutgefäße erscheinen als diskontinuierliche Kugeln in der Scheibe, wenn sie für Laminin gefärbt werden.
2. Biopsie-Stanz-Methode
   1. Lassen Sie die Hirnschnitte anhaften, indem Sie sich auf dem Membraneinsatz abzuflachen scheinen (kann in Kultur 2-5 Tage dauern).
   2. Tauen Sie die Zellmatrix auf Eis auf.
   3. Schließen Sie in der Biosicherheitswerkbank für Zellkulturen eine sterile Biopsiestanze mit einem Durchmesser von 1 mm an ein Vakuum-Aspiratorrohr an.
   4. Berühren Sie die Hirnscheibe vorsichtig mit der Biopsiestanze, um ein 1 mm großes Loch in der Mitte der Hirnscheibe zu erzeugen.
      HINWEIS: Das Gewebe in der Biopsiestanze wird durch das Vakuum in die Stanze abgesaugt.
   5. Bereiten Sie eine Zellmatrixsuspension vor, indem Sie eine 60%-70% konfluente 10-cm-Schale mit Zellen trypsinieren und in 10 ml Medium resuspendieren; Mischen Sie dann 1 ml dieser Suspension mit 100 μl Matrix.
   6. Geben Sie mit einer 20-μl-Mikropipette 1 μl der Zellmatrixmischung in jedes Loch in den Hirnschnitten.
   7. Nachdem die Platzierung der Zellmischung abgeschlossen ist, stellen Sie die Schale mit den Hirnschnitten mit eingebetteten Zellen zurück in den Inkubator und lassen Sie die Matrix erstarren und die Zellen möglicherweise in den umgebenden Gehirnschnitt eindringen.

10. Weitfeld-Fluoreszenz-Zeitraffermikroskopie

1. Legen Sie abnehmbares Klebeband um den Rand der 6-Well-Platte, um ein Verdampfen des Mediums zu verhindern, und lassen Sie auf einer Seite einen kleinen Spalt für den Gasaustausch.
2. Platzieren Sie die Platten in einer maßgeschneiderten Kulturkammer auf einem einstellbaren automatisierten Tisch auf einem inversen Epifluoreszenzmikroskop.
   HINWEIS: Die Kammer wurde mit einem Gasinjektionsregler unter atmosphärischen Bedingungen von 5 % CO₂ und 95 % Luft gehalten, und die Temperatur wurde mit einem Warmlufttemperaturregler und einem temperaturgesteuerten Tischeinsatz auf 37 °C gehalten. Siehe Fotos et ^al.18 für Details über das hier verwendete System.
3. Erstellen Sie mit einer geeigneten Mikroskopsteuerungssoftware einen Zeitraffer-Aufnahmeplan, der 20 Stunden lang alle 10 Minuten Fluoreszenzbilder der interessierenden Bereiche aufnimmt.
   HINWEIS: Wenn in Zellen eine grün fluoreszierende Markierung verwendet wird (z. B. grün fluoreszierendes Protein [GFP]), verwenden Sie die minimale Menge an blauem Anregungslicht, die zur Visualisierung der Zellen erforderlich ist, um Phototoxizität zu vermeiden. Rote (z. B. mCherry) und dunkelrote (z. B. DiD) Markierungen scheinen dieses potenzielle Problem aufgrund der Anregung längerer Wellenlängen nicht zu haben.

11. Immunfärbung von Hirnschnitten nach Zeitraffermikroskopie

HINWEIS: Dieses Immunfärbeprotokoll ist für die Färbung von Blutgefäßen mit Laminin und Zellkernen mit Bisbenzimid optimiert. Verwenden Sie geeignete Antikörper für das/die gewünschte(n) Molekül(e) von Interesse.

1. Saugen Sie das Medium mit einer Pasteurpipette von unterhalb des Membraneinsatzes ab und geben Sie 1 ml 2%iges PFA in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer unter den Einsatz und 1 ml auf den Einsatz, um die Hirnscheibe zu bedecken. Die Scheiben über Nacht bei 4 °C fest werden lassen.
2. Entfernen Sie das Fixiermittel von der Unterseite des Membraneinsatzes und alle Fixiermittel, die auf der Hirnscheibe verbleiben (das Fixiermittel neigt dazu, durch den Membraneinsatz in die darunter liegende Vertiefung zu gelangen).
3. Nehmen Sie den Einsatz mit den Scheiben aus der 35-mm-Vertiefung und legen Sie sie in eine größere Plastikschale.
4. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie 350 μl PBS in so viele Wells geben, wie Hirnschnitte vorhanden sind (eine Scheibe/Well bei Immunfärbung).
   1. Entfernen Sie die Agarose vorsichtig mit einem dünnen Spatel um die Hirnscheibe herum, ohne die Hirnscheibe vom Membraneinsatz zu lösen. Achten Sie darauf, dass sich die Agarose leicht vom äußeren Rand des Hirnschnitts löst. Wenn nicht, lassen Sie die Agarose an der Gehirnscheibe haften.
   2. Schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell durch die Membran um den Hirnschnitt, bis der Schnitt mit der darunter liegenden Membran frei vom Rest des Einsatzes ist. Nehmen Sie die Membran mit dem angebrachten Hirnschnitt auf, greifen Sie die Membran mit einer feinen Pinzette und legen Sie sie in eine Vertiefung der 24-Well-Platte in PBS.
5. Spülen Sie die Scheiben 3x mit PBS über 1 h im Kühlraum unter ständigem sanftem Rühren oder Schaukeln, so dass sich die Scheibe innerhalb der Vertiefung bewegt.
6. Bereiten Sie während des Spülens die primäre Antikörperlösung vor.
   1. Antilaminin in PBSTG auf 2 μg/ml verdünnen (siehe Tabelle 1).
7. Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und inkubieren Sie es über Nacht in primärer Antikörperlösung in einem Kühlraum unter sanftem Rühren.
8. Nach mindestens 20 h Inkubation wird die primäre Antikörperlösung abgesaugt und die Abschnitte 3x für 1 h in PBSTG gespült.
9. Bereiten Sie während des Spülens die sekundäre Antikörperlösung vor.
   1. Verdünnen Sie Fluoreszenz-GAM mit dem spezifischen Fluorochrom, das für eine Verdünnung von 1:200 in PBSTG zusammen mit einer Bisbenzimidkonzentration von 0,1 μg/ml benötigt wird.
   2. Entfernen Sie PBSTG und inkubieren Sie es über Nacht in einem Kühlraum unter Rühren in der fluoreszierenden sekundären Antikörperlösung.
   3. Entfernen Sie den Sekundärantikörper und spülen Sie ihn 2x über 1 h in PBSTG und 1x über 1 h in PBS aus.
   4. Lassen Sie es in PBS, bis Sie bereit sind, es auf Objektträger (Abschnitt 5) zu montieren und zu betrachten.

Representative Results

Discussion

Zu den kritischen Schritten des Protokolls für die Injektion von Zellen in den Ventrikel des Mittelhirns (optisches Tectum) gehört, dass die Blutgefäße in der Chorioallantoikummembran in der Eizelle oder in der Umgebung des Embryos vor und während der Injektion nicht beschädigt werden, obwohl die Amnionmembran, die den Embryo unmittelbar umgibt, sanft gezogen und gehalten werden kann, um den Kopf zu positionieren, wenn die Zellen in das Mittelhirn injiziert werden. Das Amnion ist relativ zäh und kann mit einer feinen Pinzette gezogen werden, um den Kopf zu positionieren und mit einer Hand ruhig zu halten, um mit der anderen Hand Zellen in das optische Tectum zu injizieren, das ist die große, runde Struktur in der Mitte des Gehirns. Im Allgemeinen liegt die Lebensfähigkeit von injizierten Embryonen zwischen 25% und 75%, abhängig von unbekannten Faktoren, und praktisch jeder Embryo, der überlebt, enthält mindestens einen kleinen Tumor im optischen Tectum. Zu den entscheidenden Schritten bei der Erzeugung lebensfähiger Hirnschnitte gehört das Abtupfen des Gewebes von überschüssiger Flüssigkeit, damit die Agarose während des Schneidens am Gehirn haftet, und um Gewebe und Schnitte kalt zu halten, bis sie auf den Membraneinsatz gelegt werden. Da verschiedene Zelltypen unterschiedlich viele Sphäroide bilden (in Geschwindigkeit und Größe), sollten die plattierte Zelldichte auf Poly-HEMA-Platten und die Zeitspanne bis zur Ernte von Sphäroide für jeden Zelltyp optimiert werden.

Die Arbeit hier wurde keiner formalen Längsschnittstudie zur Lebensfähigkeit von Hirnschnitten unterzogen. Yang et al. verwendeten Kükenembryonen-Hirnschnittkulturen, die den hier verwendeten ähnlich waren, und zeigten eine gute Lebensfähigkeit der Schnitte für mindestens 7 Tage¹⁶. Frühere Arbeiten zeigten, dass, wenn OT-Gewebe in suboptimalen Medien gehalten wurde, viele pyknotische Kerne im Gewebe auftraten, die in den Schnitten in der vorliegenden Arbeit nicht auftraten. Wenn Schnitte unter suboptimalen Bedingungen degenerieren, fragmentieren sich die Blutgefäße und erscheinen als Reihen von Laminin-positiven Kugeln (nicht gezeigt). Obwohl die Viabilität hier nicht durch Methoden wie Elektrophysiologie oder aktive Caspase-3-Expression überprüft wurde, trat hier keiner der Indikatoren für Zelltod auf, die unter suboptimalen Kulturbedingungen beobachtet wurden.

Der OT wurde für In-vivo-Hirntumorexperimente in Betracht gezogen, da er die am leichtesten injizierbare Region mit dem größten Ventrikel ist. Bei E5, dem spätesten Tag, an dem der Embryo klein genug ist, um auf dem Eigelb zugänglich zu bleiben, müssen Injektionen in einen Ventrikel vorgenommen werden, da alle Gehirnregionen nichts anderes als eine dünne ventrikuläre Zone sind. Nichtsdestotrotz führen diese Injektionen erfolgreich zu eingebetteten Tumoren mit Zellen, die in das Hirnparenchym eindringen. Manchmal finden sich daraus resultierende Tumore im Vorderhirn oder Kleinhirn, was jedoch nicht häufig vorkommt. Ex vivo Scheiben des E15 opticutischen Tectums wurden hier primär für Experimente verwendet, so dass die ex vivo Co-Kulturergebnisse mit den in vivo Injektionsexperimenten korreliert werden können. Es sind jedoch auch Vorderhirnschnitte geeignet, die im Vergleich zum optischen Tectum eine größere Oberfläche und einen sehr dünnen Ventrikel aufweisen, wodurch das Vorderhirn möglicherweise besser für ex vivo Co-Kulturen geeignet ist, die nicht mit In-vivo-Injektionen korreliert werden.

Hier konnte gezeigt werden, dass In-vivo-Injektionen , gefolgt von Gewebefixierung, vibrierendem Gewebeschnitt und Immunfärbung für Laminin und andere Marker, zu hochauflösenden Bildern von GBM-Zellen und GSCs in Hirngewebe in unmittelbarer Nähe von Blutgefäßen führten. Die Möglichkeit, die Beziehungen zwischen Tumorzellen und Blutgefäßen zu bestimmen, wurde durch die Erstellung von 3D-Volumen-Renderings aus Z-Stapeln konfokaler optischer Schnitte unter Verwendung der konfokalen Software und der Anweisungen des Herstellers erheblich erleichtert. Zeitrafferaufnahmen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie von GFP-, mCherry- und DiD-markierten Zellen waren möglich; Wandernde Zellen, die sich in unmittelbarer Nähe der stark fluoreszierenden Sphäroide befanden, wurden jedoch manchmal durch das “Leuchten” des Sphäroids verdeckt. Dieser unerwünschte Effekt kann durch eine sorgfältige Anpassung der Belichtungszeiten für die Aufnahme von Weitfeldbildern etwas minimiert werden. Zeitrafferaufnahmen mit konfokalen Z-Stapeln über die Zeit (4D) eliminierten das unscharfe Leuchten der Sphäroide und führten zu scharf definierten wandernden Zellen mit dunklem Hintergrund. Dies wurde im Protokoll nicht beschrieben, sondern ähnlich wie bei der Weitfeld-Zeitrafferaufnahme durchgeführt, die durchgeführt wurde, während sich Gehirnschnitte auf den transparenten Membraneinsätzen in einer 6-Well-Kunststoffplatte befanden. Obwohl die konfokale Zeitrafferaufnahme zu deutlich klareren Bildern einzelner Zellen und ihres Verhaltens führt, ist ein Mehrpunkt-Zeitrafferexperiment, bei dem Z-Stapel von 10 Z-Ebenen/Punkt in 10-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 20 Stunden gesammelt werden, eine umfangreiche Verwendung der Scankopf-Galvanometer. Da dies die Lebensdauer der Galvanometer erheblich verkürzen könnte, wird diese Methode mit Bedacht eingesetzt.

Obwohl das Kükenembryosystem sowohl für In-vivo-Injektions- als auch für Ex-vivo-Co-Kulturexperimente, die das Verhalten von GBM-Zellen untersuchen, sehr gut geeignet ist, gibt es einige Einschränkungen für dieses Modellsystem. Wie bei jedem Xenotransplantat-System ist die Umgebung, in der menschliche Zellen implantiert werden, nicht das menschliche Gehirn, aber das Verhalten der GBM-Zellen scheint das in Nagetiermodellen und bei menschlichen Patienten nachzuahmen. Nach Durchführung von In-vivo-Injektionsexperimenten an E5 werden Tumore normalerweise 10 Tage lang bis E15 gebildet. Dies ist eindeutig nicht genug Zeit, um alle Aspekte der Tumorentstehung und Zellinvasion zu untersuchen. Hier konnte jedoch gezeigt werden, dass sich im Hirnparenchym solide Tumore bilden, Zellen interagieren und sich innerhalb des Tumors neu anordnen und innerhalb dieses relativ kurzen Zeitraums eine signifikante Hirninvasion sowohl entlang der Blutgefäße als auch diffus auftritt. Eine weitere Einschränkung des In-vivo-Kükenembryosystems besteht darin, dass es aufgrund des großen Dotters und des extraembryonalen Kreislaufsystems, das während der Entwicklung des Kükenembryos arbeitet, nicht für Medikamente oder andere Behandlungen geeignet ist. Topische flüssige medikamentöse Behandlungen würden zu einer sehr variablen und unbekannten Konzentration im Gehirn führen, die auf die Diffusion vom Embryo weg in die viel größere Dottermasse zurückzuführen ist. In ähnlicher Weise würde die intravenöse Injektion von Medikamenten in das sehr empfindliche extraembryonale Kreislaufsystem aus den Blutgefäßen austreten oder diffundieren und ebenfalls zu unbekannten Konzentrationen im Gehirn führen. Dies ist einer der Hauptgründe für die Einführung der Ex-vivo-Schnittkulturmethode , damit nicht nur das Zellverhalten beobachtet und mittels Zeitraffermikroskopie verfolgt werden konnte, sondern auch, damit Behandlungen, die das Verhalten von GBM-Zellen in einer Schale erfolgreich verändert haben⁴ , in einer relevanteren Hirngewebeumgebung getestet werden konnten.

Die Entwicklung des orthotopen Hirntumormodellsystems für Kükenembryonen wird als eine bedeutende Ergänzung zu den Systemen und Werkzeugen angesehen, die für die Untersuchung der GBM-Tumorbildung und des invasiven Zellverhaltens zur Verfügung stehen. Befruchtete Hühnereier sind wahrscheinlich in den meisten Gebieten leicht verfügbar, sie sind im Vergleich zu Nagetieren kostengünstig, es fallen keine Kosten für die Tierpflege an, die Embryonen sind sehr widerstandsfähig und resistent gegen Infektionen (d. h. die meiste Arbeit wird auf einer Arbeitsplatte durchgeführt), die Embryonen sind hochgradig manipulierbar und können in schalenloser Kultur gezüchtet werden¹⁹, und Kükenembryonen gelten nicht als Wirbeltiere und benötigen daher keine IACUC-Zulassung nach NIH-Richtlinien (institutionelle Anforderungen kann variieren). Diese vielfältigen Vorteile machen das Kükenembryosystem sehr attraktiv, wenn man seine Fragen und Experimente auf diejenigen beschränkt, die in seine Grenzen fallen. Mehrere GBM-Zellstudien wurden von anderen mit dem Kükenembryo durchgeführt, aber diese haben fast ausschließlich die Chorioallantoismembran (CAM) des Embryos 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 und die Gliedmaßenknospe ³⁰ verwendet, und nicht das Gehirn. Es wurde auch berichtet, dass auf E2³¹ ein Medulloblastom in das Kükenhirn implantiert wurde. Zweifelsohne sollte die hier beschriebene Verwendung des Kükenembryos als orthotopes Xenotransplantat-Modellsystem zu Ergebnissen führen, die für die Biologie des humanen GBM-Tumors viel aussagekräftiger sind als Studien mit dem CAM.

Obwohl diese Studien gerade erst begonnen haben, das Gehirntumor-Modellsystem für Kükenembryonen für Studien des Verhaltens menschlicher GBM-Zellen und des GSC vollständig zu nutzen, besteht die Hoffnung, dass andere die Anwendungen erweitern und weitere potenzielle Anwendungen finden werden. Man könnte sich vorstellen, dass dieses System nicht nur Mechanismen aufdeckt, die die GBM-Tumorbildung und das Zellverhalten regulieren, sondern auch die präklinische Erprobung bestimmter Medikamente und Substanzen an bestimmten Patientenzellen ermöglicht. Wenn beispielsweise im Voraus Hirnschnittkulturen angelegt würden, könnten Tumorzellen, Stücke aus chirurgischen Tumorresektionen oder von Patienten stammende GBM-Organoide³² direkt in eine Ex-vivo-Kokultur eingebracht werden, und verschiedene Behandlungen könnten innerhalb weniger Tage bewertet werden. In ähnlicher Weise könnten dissoziierte Patientenzellen direkt in das E5-Mittelhirn in ovo injiziert werden, um ihre Fähigkeit zu beurteilen, Tumore zu bilden und in das Hirnparenchym einzudringen. Es ist daher zu hoffen, dass die Beschreibungen der Methoden und die repräsentativen Ergebnisse hier den verstärkten Einsatz dieses stark untergenutzten Systems für die Hirntumorforschung erleichtern und fördern.

Materials

1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO<sub>2</sub> incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 &micro;m)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.&nbsp; Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-&alpha;	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 &micro;L)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 &micro;L)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> + H<sub>2</sub>O	Fisher Scientific	S369
NaHCO<sub>3</sub>	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)&nbsp; (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.&nbsp; Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices