Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Stephanie Ibrahim; Catherine Robert; Camille Humbert; Clotilde Ferreira; Gwenaëlle Collod; Sonia Stefanovic

doi:10.3791/65328

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Methodenartikel

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

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DOI:

10.3791/65328

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12. Mai 2023

Stephanie Ibrahim¹ , Catherine Robert² , Camille Humbert² , Clotilde Ferreira¹ , Gwenaëlle Collod² , Sonia Stefanovic¹

¹Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, ²Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zusammenfassung

Das sich entwickelnde Herz ist eine komplexe Struktur mit verschiedenen Vorläuferzellen, die von komplexen Regulationsmechanismen gesteuert werden. Die Untersuchung der Genexpression und des Chromatinzustandes einzelner Zellen ermöglicht die Identifizierung des Zelltyps und -zustands. Einzelzell-Sequenzierungsansätze haben eine Reihe wichtiger Merkmale der kardialen Vorläuferzellheterogenität aufgezeigt. Diese Methoden sind jedoch in der Regel auf frisches Gewebe beschränkt, was Studien mit unterschiedlichen Versuchsbedingungen einschränkt, da das frische Gewebe im selben Durchlauf auf einmal verarbeitet werden muss, um die technische Variabilität zu reduzieren. Daher werden in diesem Bereich einfache und flexible Verfahren zur Datengewinnung aus Methoden wie der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und dem Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (snATAC-seq) benötigt. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur schnellen Isolierung von Zellkernen für nachfolgende Single-Nuclei-Dual-Omics (kombinierte snRNA-seq und snATAC-seq) vor. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Zellkernen aus gefrorenen Proben kardialer Vorläuferzellen und kann mit Plattformen kombiniert werden, die mikrofluidische Kammern verwenden.

Einleitung

Unter den Geburtsfehlern sind angeborene Herzfehler (KHK) am häufigsten und treten jedes Jahr bei etwa 1 % der Lebendgeburten^auf ^1,2. Genetische Mutationen werden nur in einer Minderheit der Fälle identifiziert, was darauf hindeutet, dass andere Ursachen, wie z. B. Anomalien in der Genregulation, an der Ätiologie der KHK beteiligt sind ^2,3. Die kardiale Entwicklung ist ein komplexer Prozess verschiedener und interagierender Zelltypen, was die Identifizierung kausaler nicht-kodierender Mutationen und ihrer Auswirkungen auf die Genregulation schwierig ma....