Ein Machine-Vision-Ansatz für Transmissionselektronenmikroskopie-Workflows, Ergebnisanalyse und Datenmanagement

Transmissionselektronenmikroskope (TEMs) und ihre Fähigkeiten haben enorm von den Fortschritten bei Kameras, Detektoren, Probenhaltern und Computertechnologien profitiert. Diese Fortschritte werden jedoch durch unzusammenhängende Datenströme, Einschränkungen der menschlichen Bedienung und umständliche Datenanalyse behindert ^1,2. Darüber hinaus adaptieren In-situ- und Operando-Experimente TEMs in Echtzeit-Labore im Nanomaßstab, so dass Proben in gasförmigen oder flüssigen Umgebungen untersucht werden können, während gleichzeitig eine Reihe externer Reize angewendet werden ^3,4,5. Die Einführung solch komplexer Workflows hat diese Einschränkungen nur noch verstärkt, und die daraus resultierende Zunahme der Größe und Komplexität dieser Datenströme ist ein Bereich, der zunehmend Anlass zur Sorge gibt. Daher wird immer mehr Wert auf die Nutzung maschineller Handlungsfähigkeit gelegt, um Daten zu finden, darauf zuzugreifen, zu interagieren und wiederzuverwenden, eine Praxis, die als FAIR-Prinzipien⁶ bekannt ist. Die Veröffentlichung von Forschungsdaten in Übereinstimmung mit dem Konzept der FAIR-Prinzipien hat von Regierungsbehörden auf der ganzen Welt positive Aufmerksamkeit erhalten^7,8, und die Anwendung der FAIR-Prinzipien mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware ist ein wichtiger Schritt bei ihrer Einführung.

Eine Softwareplattform für die Synchronisierung des maschinellen Sehens (MVS) wurde als Antwort auf die spezifischen Probleme entwickelt, die mit der Durchführung und Analyse komplexer, metadatenintensiver TEM-Experimente (insbesondere In-situ - und Operando-Experimente^{) verbunden} sind9. Nach der Installation auf dem TEM stellt die MVS-Software eine Verbindung, Integration und Kommunikation mit der Mikroskopsäule, den Detektoren und den integrierten In-situ-Systemen her. Dies ermöglicht es, kontinuierlich Bilder zu sammeln und diese Bilder mit ihren experimentellen Metadaten abzugleichen, wodurch eine umfassende, durchsuchbare Datenbank entsteht, eine Zeitleiste des Experiments von Anfang bis Ende (Abbildung 1). Diese Konnektivität ermöglicht es der MVS-Software, Algorithmen anzuwenden, die eine Region of Interest (ROI) intelligent verfolgen und stabilisieren, selbst wenn Proben morphologischen Veränderungen unterliegen. Die Software nimmt bei Bedarf Anpassungen an Bühnen-, Strahl- und Digitalkorrekturen vor, um den ROI durch die Funktionen Drift Control und Focus Assist zu stabilisieren. Neben der Anreicherung der Bilder mit den Rohmetadaten, die von den verschiedenen experimentellen Systemen erzeugt werden, kann die Software mithilfe von Bildanalysealgorithmen neue, computergestützte Metadaten erstellen, um Variablen zwischen den Bildern zu berechnen, die es ihr ermöglichen, Probendrift oder Fokusänderungen automatisch zu korrigieren.

TEM-Bilder und die dazugehörigen Metadaten, die durch die MVS-Software gesammelt werden, sind als experimentelle Zeitleiste organisiert, die von jedem über die kostenlose Offline-Version der Analysesoftware Studio (im Folgenden als Analysesoftware bezeichnet) geöffnet und angesehen werden ^kann10. Während eines Experiments synchronisiert und zeichnet die MVS-Software drei Arten von Bildern von der Kamera oder dem Detektor des Mikroskops auf, die oben auf der Zeitleiste unter dem Bildbetrachter angezeigt werden: Einzelaufnahme (einzelne Einzelaufnahmebilder, die direkt von der TEM-Software aufgenommen wurden), Rohbilder (Bilder aus dem Detektor-/Kamera-Livestream, auf die keine digitalen Driftkorrekturen angewendet wurden; diese Bilder können physisch über B. Tischbewegung oder Strahlverschiebung) und driftkorrigiert (Bilder aus dem Detektor-/Kamera-Livestream, die digital driften). Daten, die während eines Experiments oder einer Sitzung gesammelt werden, können in kleinere Abschnitte oder Datenausschnitte, die als Sammlungen bezeichnet werden, weiter verfeinert werden, ohne dass eingebettete Metadaten verloren gehen. Aus der Analysesoftware können Bilder, Bildstapel und Metadaten direkt in eine Vielzahl von Bildern und Tabellenkalkulationen im offenen Format exportiert werden, um sie mit anderen Tools und Programmen zu analysieren.

Der Rahmen der Mikroskopsteuerung, Stabilisierung und Metadatenintegration, der durch die MVS-Software ermöglicht wird, ermöglicht auch die Implementierung zusätzlicher Bildverarbeitungsprogramme oder -module, die entwickelt wurden, um Einschränkungen in den aktuellen TEM-Arbeitsabläufen zu verringern. Eines der ersten Module, das entwickelt wurde, um die Vorteile dieser Synchronisationsplattform zu nutzen, ist die Kalibrierung der Elektronendosis und die räumliche Verfolgung von strahlexponierten Bereichen innerhalb der Probe. Alle TEM-Bilder entstehen aus der Wechselwirkung zwischen der Probe und dem Elektronenstrahl. Diese Wechselwirkungen können jedoch auch zu negativen, unausweichlichen Auswirkungen auf die Probe führen, wie z. B. Radiolyse und Folgeschäden 11,12, und erfordern ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen der Anwendung einer ausreichend hohen Elektronendosis zur Erzeugung des Bildes und der Minimierung der resultierenden Strahlschädigung ^13,14.

Obwohl sich viele Anwender auf Schirmstrommessungen verlassen, um die Elektronendosis abzuschätzen, hat sich gezeigt, dass diese Methode den tatsächlichen Strahlstrom weitgehend unterschätzt¹⁵. Qualitative Dosiswerte können über den Rasterstrom auf demselben Mikroskop mit den gleichen Einstellungen ermittelt werden, aber die Reproduktion dieser Dosisbedingungen mit unterschiedlichen Mikroskopen oder Einstellungen ist sehr subjektiv. Darüber hinaus erfordern alle Anpassungen der Bildgebungsparameter, die der Benutzer während des Experiments vornimmt, wie z. B. Spotgröße, Blende, Vergrößerung oder Intensität, eine separate Messung des Bildschirmstroms, um die resultierende Dosis zu berechnen. Der Benutzer muss entweder die Bildgebungsbedingungen, die während eines bestimmten Experiments verwendet werden, streng einschränken oder jede verwendete Linsenbedingung akribisch messen und aufzeichnen, wodurch das Experiment erheblich erschwert und über das hinausverlängert wird, was für den normalen Betrieb des Mikroskops machbar ist^16,17.

Dose, für dieses Protokoll als Dosissoftware bezeichnet, ist ein Dosiskalibrierungssoftwaremodul, das einen speziellen Kalibrierhalter verwendet, der automatisierte Strommessungen ermöglicht. Ein Faraday-Becher, der Goldstandard für die genaue Strahlstromkalibrierung¹⁵, ist in die Spitze des Kalibrierhalters integriert. Die MVS-Software führt eine Reihe von Kalibrierungen des Strahlstroms und der Strahlfläche für jeden Objektivzustand durch und bettet diese Werte auf Pixelebene in die Bilder ein.

In diesem Videoartikel werden MVS-Softwareprotokolle, die entwickelt wurden, um alle Bereiche des TEM-Arbeitsablaufs zu verbessern, anhand repräsentativer Nanomaterialproben vorgestellt. Eine strahlempfindliche Zeolith-Nanopartikelprobe¹⁴ wird verwendet, um die Arbeitsabläufe bei der Kalibrierung und dem Dosismanagement zu demonstrieren. Wir führen ein repräsentatives in situ Erwärmungsexperiment mit einer Au/FeO_{x Nanokatalysator} ^18,19 Probe durch^, die beim Erhitzen signifikante morphologische Veränderungen erfährt. Dieses In-situ-Experiment unterstreicht die Stabilisierungsalgorithmen der Software und ihre Fähigkeit, mehrere Ströme von Metadaten zusammenzuführen, was eine inhärente Herausforderung für In-situ- und Operando-Studien darstellt. Obwohl im Protokoll nicht beschrieben, diskutieren wir aufgrund ihrer einzigartigen Elektronendosisempfindlichkeit repräsentative Beispiele für den Nutzen der Software für Flüssig-EM-Studien (für die Protokolle bereits in der Literatur^20,21,22 berichtet wurden) und wie diese Techniken angewendet werden können^, um das Verständnis der Wirkung der Dosis auf Flüssig-EM-Experimente zu verbessern. Schließlich zeigen wir, wie die Datenanalyse mithilfe der Offline-Analysesoftware optimiert wird, um eine Vielzahl von Bild-, Video- und Datendateien zu visualisieren, zu filtern und in andere zugängliche Formate zu exportieren.

Abbildung 1: Beispiele für Benutzeroberflächen für MVS und Analysesoftware. (A) Bildanzeigebereich und Bedienfeld der Synchronisierungssoftware. Eine Verbindung zwischen dem TEM und der Synchronisationssoftware wird durch Betätigen der Schaltfläche Verbinden hergestellt, die die Bilder und Metadaten vom Mikroskop in die Synchronisationssoftware streamt. Über den Bildbetrachter kann der Bediener eine Vielzahl von bildverarbeitungsgestützten Vorgängen ausführen, wie z. B. Driftkorrektur und Fokus-Assistent. Es bietet auch die Möglichkeit, Tag-Bilder und Überprüfungssitzungen anzuwenden, ohne die Datenerfassung zu unterbrechen. (B) Screenshot der Bildanalysesoftware, in dem die Position des Bildansichtsfensters, der Zeitleiste und des Bedienfelds "Metadaten und Analyse" hervorgehoben ist. Die Analysesoftware kann jederzeit während eines Experiments aufgerufen werden, um die bis zu diesem Zeitpunkt aufgenommenen Bilder über die Schaltfläche "Review Session" zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Methode 1: Dosiskalibrierung des Transmissionselektronenmikroskops für TEM- und Raster-TEM-Bildgebungsmodi (STEM)

1. Schalten Sie das Pikoamperemeter ein und lassen Sie es mindestens 30 Minuten lang aufwärmen, bevor Sie mit der Dosiskalibrierung beginnen. Setzen Sie den Dosiskalibrierhalter in das TEM ein und verbinden Sie den Kalibrierhalter mit dem Pikoamperemeter über das Schnellanschlusskabel.
2. Öffnen Sie bei einem Mikroskop im TEM-Modus die Säulenventile und suchen Sie die 35-μm-Passerbohrung am Dosishalter (Abbildung 2). Starten Sie die MVS-Softwareanwendung und wählen Sie Dose (Calibration Automation) aus den Experimentoptionen aus.
   HINWEIS: Die Position der Passerbohrung wird von der Software nach der ersten Kalibrierung gespeichert, sodass die Software ihre Position für zukünftige Kalibrierungen automatisch lokalisieren kann.
3. Klicken Sie auf das Symbol Verbinden (Abbildung 1A) und wählen Sie das Mikroskop aus, um die Verbindung zwischen dem TEM und der MVS-Software zu aktivieren. Sobald die Verbindung hergestellt ist, werden die Bilder der Kamera/des Detektors im Bildbetrachter der Software angezeigt.
   Anmerkungen: Es ist nicht erforderlich, die euzentrische Höhe zu optimieren, und der Rand des Passerbohrungslochs kann aufgrund der Dicke der Spitze verschwommen erscheinen. Dies hat keinen Einfluss auf die aktuellen Messungen.
4. Navigieren Sie zur Registerkarte " Dosis " und dann zu "Dosiskalibrierung". Wählen Sie Dosisbereichskalibrierung aus, befolgen Sie die Anweisungen der Software und geben Sie die angeforderten, vom Benutzer konfigurierbaren Werte ein (z. B. die Einstellungen für Blende und Monochromator). Nachdem die Kalibrierung des Dosisbereichs abgeschlossen ist, wählen Sie den Prozess der Dosisstromkalibrierung aus und befolgen Sie die Anweisungen der Software.
5. Wiederholen Sie den Kalibrierungsvorgang (Schritt 1.4) für jede Spotgröße, Blende oder Monochromatoreinstellung, die während des Experiments verwendet werden kann.
6. Wenn der Kalibrierungsprozess für den TEM-Modus abgeschlossen ist, kalibrieren Sie die Elektronendosis für den STEM-Modus , indem Sie Schritt 1.4 wiederholen.
   Anmerkungen: Im STEM-Modus muss die Dosisbereichskalibrierung nicht durchgeführt werden.
7. Wenn alle gewünschten Kalibrierungen abgeschlossen sind, klicken Sie auf Sitzung schließen, entfernen Sie den Dosiskalibrierungshalter und kehren Sie zum Startbildschirm der MVS-Software zurück.

2. Methode 2: Bestimmung der Dosisschwelle mit Hilfe des MVS und der Dosissoftware

1. Laden Sie ein Standard-TEM-Gitter mit einer Probe (in diesem Beispiel wurden handelsübliche ZSM-5-Zeolith-Nanopartikel verwendet) in einen Standard-TEM-Halter. Setzen Sie die Halterung in das TEM ein und lokalisieren Sie einen Bereich von Interesse (kristalline Zeolith-Nanopartikel).
2. Öffnen Sie die MVS-Softwareanwendung, und wählen Sie Andere aus.
   HINWEIS: Zusätzliche Informationen über die Probe (z. B. Probenkennung und -beschreibung, Name des Bedieners und Anmerkungen zu den Versuchsangaben) können dem Feld für die Versuchsparameter hinzugefügt werden.
3. Wiederholen Sie Schritt 1.3, um eine Verbindung zur MVS-Software herzustellen, und navigieren Sie zur Registerkarte "Bildmetadaten" in der Benutzeroberfläche der MVS-Software, um die folgenden Metadaten auszuwählen, die über den in der Live-Anzeige angezeigten Bildstream gelegt werden sollen: Vergrößerung, Maximale Dosis und Dosisleistung. Andere Metadaten können auf Wunsch des Benutzers eingefügt werden. Ein Screenshot der MVS-Softwareschnittstelle, der die Steuerelemente für das Dosismanagement zeigt, ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.
4. Öffnen Sie die Registerkarte "Dosis" und wählen Sie "Dosismanagement" und "Dosisüberwachung aktivieren", um die automatische Verfolgung der Elektronendosis zu aktivieren. Wählen Sie Dosisebene anzeigen aus, um die Dosisfarbüberlagerung anzuzeigen.
5. Stellen Sie die Werte für die hohe Dosis und die hohe Dosisleistung ein und klicken Sie auf Speichern (in diesem Beispiel wurden Werte von 60.000 e-/Å 2 bzw. 500 e^-/Å ²·s verwendet).
6. Navigieren Sie zur Registerkarte Einstellungen , wählen Sie Dosis aus, und legen Sie die Werte für die Deckkraft der Dosisnavigationskarte und die Deckkraft der Bildüberlagerung für die Dosis fest (in diesem Beispiel wurden Werte von 0,50 bzw. 0,30 verwendet).
7. Aktivieren Sie im Live Image Viewer-Fenster die Driftkorrektur, indem Sie auf Driftkorrektur klicken.
8. Navigieren Sie zur Registerkarte Datenansicht , und zeichnen Sie die Metadatenwerte Unschärfe und Fokusquotient auf der Y-Achse.
   HINWEIS: Jeder der verfügbaren Metadatenwerte kann während des Experiments in Echtzeit aus der Datenansichtstabelle dargestellt werden.
9. Aktivieren Sie den Fokus-Assistenten, und wählen Sie dann Fokus kalibrieren aus, um die automatische Kalibrierung des Fokus-Assistenten auszuführen. Sobald die Routine "Fokus kalibrieren" abgeschlossen ist, schließen Sie die Registerkarte "Datenansicht".
10. Öffnen Sie die Registerkarte Bildanalyse in der MVS-Software und aktivieren Sie die Optionen Live-FFT und Quadranten 1 & 2 .
11. Stellen Sie mit den Softwaresteuerungen des Mikroskops die Strahlbedingungen so ein, dass der Elektronenfluss ~500 e-/Ų·s beträgt, und bewegen Sie sich zu einem neuen Bereich in der Probe und zentrieren Sie den ROI der Probe in der ^{Live-Ansicht der MVS-Software}.
    HINWEIS: Bei großen Bühnenbewegungen werden die Driftsteuerung und der Fokusassistent automatisch deaktiviert und müssen wieder aktiviert werden, sobald der neue ROI ausgewählt wurde.
12. Notieren Sie sich die Dosisbedingungen in der Software mit der Tag-Funktion . Markieren Sie das Tag-Symbol und geben Sie den gewünschten Text ein, um eine bestimmte Reihe von Bildern innerhalb der Zeitleiste zu kennzeichnen. Bilder werden mit diesem Text versehen, bis das Tag-Symbol deaktiviert wird.
13. Halten Sie eine konstante Dosisleistung aufrecht, während Sie kontinuierlich den gleichen ROI abbilden, bis die Peaks, die der atomaren Struktur im FFT-Diagramm entsprechen, verschwunden sind.
14. Verringern Sie die Vergrößerung, öffnen Sie die Registerkarte "Dosismanagement" und aktivieren Sie "Dosisebene anzeigen", um eine farbcodierte Dosiskarte zu überlagern.
    HINWEIS: Diese Funktion bietet eine visuelle Referenz der Bereiche der Probe, die dem Elektronenstrahl ausgesetzt wurden, und ihrer relativen Dosisexposition. Wenn Sie diese Bereiche in einzelnen Bildern mit dem Cursor markieren, werden die jeweiligen Dosiswerte angezeigt.
15. Trennen und beenden Sie die Sitzung, indem Sie die Option "Verbinden" deaktivieren und dann " Sitzung schließen" auswählen. Speichern Sie eine Kopie der Sitzungsdaten in einer externen Quelle, um zu verhindern, dass die in der MVS-Software gespeicherten Daten bei nachfolgenden Experimenten überschrieben werden (Ergänzungsdatei 2).

3. Methode 3: Metadaten- und Trendanalyse und Datenexport mit Hilfe der Analysesoftware

1. Starten Sie die Analysesoftware (die Offline-Software zum Anzeigen der vollständig synchronisierten Datasets), und öffnen Sie die Experimentsitzungsdatei, indem Sie sie aus der Dateibibliothek auswählen.
   HINWEIS: Benutzer können während eines Experiments auch über das Symbol "Überprüfungssitzung " in der MVS-Software auf die Analysesoftware zugreifen.
2. Zeigen Sie die driftkorrigierten Bilder an, indem Sie die Registerkarte DC unter dem Bildansichtsfenster aktivieren, und wählen Sie die gewünschten Datenüberlagerungen aus, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen Überlagerungsdaten auf der Registerkarte Bildmetadaten aktivieren (in diesem Beispiel wurden Mikroskop, Datum/Uhrzeit, Dosisleistung, maximale Dosis und Vergrößerung verwendet). Andere Metadaten können nach Belieben des Benutzers dargestellt werden.
3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitachse für Maximale Dosis und Dosisleistung, um der Zeitachse ein grafisches Diagramm dieser Werte hinzuzufügen. Markieren Sie diese grafischen Diagramme oder scrollen Sie durch sie, um das im Ansichtsfenster angezeigte Bild zu aktualisieren. Greifen Sie über die Registerkarten "Notizen", "Bildanalyse", "Toolbox" und "Datenansicht" auf eine Vielzahl von Werkzeugen zu.
   1. Greifen Sie über die Registerkarte Bildanalyse auf die FFT für jedes Bild zu und klicken Sie auf Live-FFT , um die FFT zu aktualisieren, während Sie durch die Bilder scrollen.
   2. Verwenden Sie das Ausbleichen der FFT-Peaks, um den Zeitpunkt zu bestimmen, an dem die Zeolithstruktur an Kristallinität verliert. Notieren Sie den maximalen Dosiswert, der mit diesem Bild aufgezeichnet wurde.
4. Verwenden Sie die Option Filter , um große Datasets einfach in kleinere, gemeinsam nutzbare Datasets zu filtern, ohne die zugehörigen Metadaten zu verlieren. Öffnen Sie das Filterfenster und stellen Sie die Schieberegler so ein, dass nur Daten mit einer Dosisleistung von ~500 e^-/Ų·s oder mehr ausgewählt werden, und speichern Sie die neue Sammlung unter dem Namen Dosisschwellenstudie.
   HINWEIS: Filter können für jeden der zugeordneten Metadatentypen angewendet werden.
5. Exportieren Sie die Bilder und Metadaten aus der Sitzung in andere Dateitypen, die mit Maßstabsleisten und Metadatenüberlagerungen angereichert sind.
   1. Markieren Sie die Sammlung im Bibliotheksbereich, und wählen Sie Veröffentlichen aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Auswahl klicken. Wählen Sie im Fenster Veröffentlichen die gewünschten Optionen für den Dateityp Export aus.
   2. Wählen Sie die Registerkarte Driftkorrigierte Daten aus, und wenden Sie Überlagerungen aller gewünschten Metadaten und der FFT an (positionieren Sie die FFT-Überlagerung wie gewünscht; Beispiele für Bilder, die mit der FFT exportiert wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt).
6. Exportieren Sie die Bildserie als Filmdatei mit derselben Option "Veröffentlichen ". Wählen Sie die Bilder aus, indem Sie sie in der Zeitleiste markieren, die Filteroptionen verwenden oder die vollständige Datenbankdatei exportieren. Wählen Sie das gewünschte Filmformat, die Bildrate und den Dateispeicherort aus. Ein Film des Zeolith-Abbauexperiments, das mit einem 200-kV-TEM aufgenommen wurde, ist in der Zusatzdatei 3 enthalten.
7. Exportieren Sie die Metadaten separat von den erfassten Bildern als CSV-Datei, indem Sie bei der Veröffentlichung die Option Metadaten (CSV) auswählen.
   HINWEIS: RAW- und driftkorrigierte Bilder werden als separate CSVs exportiert (Ergänzungsdatei 4 und Ergänzungsdatei 5).

4. Methode 4: In-situ-Erhitzungsuntersuchung von Gold auf Eisenoxid-Nanopartikeln

1. Gießen Sie einen in Ethanol suspendierten Nanokatalysator (Au/FeO_x) auf einen In-situ-Heizer-E-Chip, einen mikroelektromechanischen (MEM) Probenträger, und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Montieren Sie die Probe in den In-situ-Heizhalter, setzen Sie den Halter mit der Probe in das TEM ein und schließen Sie den Halter mit dem mitgelieferten Kabel an die Stromversorgung an. Suchen Sie einen Beispiel-ROI mit den TEM-Steuerelementen.
   HINWEIS: Bei diesem Experiment wurde ein Heizhalter verwendet, der vollständig in die MVS-Software integriert ist, sodass Temperaturmetadaten in die Bilder eingebettet werden können.
2. Wählen Sie die entsprechende Workflow-Option aus der MVS-Software aus (in diesem Beispiel wurde der Fusion-Workflow verwendet, aber es können auch Heizhalter anderer Hersteller verwendet werden, indem Sie Andere auswählen).
3. Befolgen Sie die Anweisungen des Arbeitsablaufs, um die elektrische Verbindung zwischen dem Halter und dem Heiz-E-Chip zu bestätigen, indem Sie die Kalibrierungsdatei laden und eine Geräteprüfung durchführen.
4. Verbinden Sie das Mikroskop mit der MVS-Software, wie zuvor in den Schritten 2.3 bis 2.10 gezeigt (in diesem Beispiel wurden die Metadatenwerte für Dosisleistung, maximale Dosis, Übereinstimmungskorrelation, Driftrate und Kanal-A-Temperatur ausgewählt), und zentrieren Sie den ROI der Probe im Sichtfeld.
5. Öffnen Sie die Registerkarte Fusion AX , und richten Sie eine Temperatur ein und wenden Sie sie an.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Channel A Setup , um auf die Einstellungen für die Temperaturregelung zuzugreifen. Wählen Sie die Funktion Temperatur und den Modus Manuelle Steuerung.
7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment, um auf die experimentellen Steuerelemente zuzugreifen. Stellen Sie die Rampenrate auf 10 °C/s und das Ziel auf 600 °C ein. Klicken Sie auf Übernehmen , um das Experiment zu starten.
   HINWEIS: Das Experiment kann jederzeit über die Schnellzugriffsschaltflächen in der unteren rechten Ecke der MVS-Software angehalten oder gestoppt werden, ohne die Registerkarte Fusion AX zu öffnen.
8. Nachdem die eingestellte Temperatur von 600 °C erreicht ist, öffnen Sie die Registerkarte Fusion AX und wählen Sie Experimentieren. Ändern Sie die Rampenrate auf 2 °C und das Ziel auf 800 °C. Klicken Sie auf Übernehmen , um das Experiment zu starten.
   Anmerkungen: Das Verfahren zum Anbringen einer Heizrampe hängt vom verwendeten In-situ-Heizsystem ab. Die oben beschriebenen Schritte zum Anwenden der Temperaturrampe gelten für das in diesem Beispiel verwendete System.
9. Markieren Sie alle Ereignisse oder Points of Interest während des Experiments mithilfe der Tagging-Funktion, wie in Schritt 2.10 gezeigt. Fahren Sie mit der Abbildung der Probe fort und passen Sie das Temperaturprofil wie gewünscht an. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Sitzung beenden und speichern Sie die Datendatei mit der Analysesoftware (ein Teil der Datenbankdatei, die in den repräsentativen Ergebnissen besprochen wird, wird als Ergänzungsdatei 6 bereitgestellt).
10. Öffnen Sie die Analysesoftware, um die Sitzung zu überprüfen. Zeichnen Sie die Temperatur, den Template-Morphing-Faktor, die Dosisleistung und die kumulative Dosis in der Zeitleiste auf. Exportieren Sie Bilder und Filme wie gewünscht, indem Sie die in Schritt 3.6 und 3.7 beschriebenen Schritte ausführen. Bilder und Filme können mit oder ohne Dosiskarten-Überlagerungen exportiert werden (Abbildung 4).

Diese Arbeit unterstreicht den Nutzen der Datenerfassung mit MVS-Software für TEM-Bildgebung und In-situ-Experimente. Die Ausrichtung des Mikroskops und die Zustandseinstellung wurden mit den Standardsteuerungen des TEM-Herstellers durchgeführt und ausgewählt. Nach der Ersteinrichtung wurden die in diesem Videoartikel vorgestellten Protokolle über die MVS-Software durchgeführt. Für alle Experimente, die im Videoprotokoll und in repräsentativen Daten dargestellt wurden, wurde ein 300-kV-TEM verwendet, mit Ausnahme der Zeolith-Vergleichsdaten, die mit einem 200-kV-Kalt-FEG aufgenommen wurden (Abbildung 3D-F und Tabelle 1). Alle Metadaten wurden von der MVS-Software automatisch gesammelt und mit den jeweiligen Bildern abgeglichen.

Nach dem Start der Software und der Auswahl des entsprechenden Workflows aus dem Menü wird eine Verbindung zum Mikroskop hergestellt, indem die Schaltfläche Verbinden in der Symbolleiste ganz links im Bildbetrachter aktiviert wird, wie in Abbildung 1A dargestellt. Wenn die Schaltfläche " Verbinden" markiert ist, werden die Bilder und die zugehörigen Metadaten vom Mikroskop automatisch in die MVS-Software gestreamt und im Bildansichtsbereich angezeigt. Diese Bilder und die zugehörigen Metadaten werden chronologisch in einer Zeitleiste gespeichert, die geöffnet, überprüft und analysiert werden kann, ohne die Aufzeichnung neuer Daten in der Zeitleiste zu unterbrechen (Abbildung 1B). Das Streaming kann vom Nutzer jederzeit durch Deaktivierung des Connect-Icons unterbrochen werden.

Sobald die Verbindung aktiviert ist, kann auf andere Workflows zugegriffen werden, die vom MVS-Software-Framework abhängig sind. In den Beispielen, die in diesem Videoprotokoll gezeigt werden, muss eine Dosiskalibrierung durchgeführt werden, bevor die anderen Funktionen der MVS-Software verwendet werden können. Die Dosiskalibrierung ist ein automatisierter Prozess, der von der MVS-Software gesteuert wird. Es verwendet einen speziellen Faraday-Becherdosis-Kalibrierungshalter, um den Strom und die Fläche des Strahls für die Kombination von Parametern zu messen. Der in Abbildung 2 gezeigte Faraday-Becher-Kalibrierhalter wird an ein externes Pikoamperemeter angeschlossen, das den Strahlstrom präzise misst. Nach dem Einsetzen in das Mikroskop wird die Passermarkenausrichtungsbohrung zentriert und die gewünschten zu kalibrierenden Strahlbedingungen (Spotgrößen, Blenden und Vergrößerungen) in die Software eingegeben. Die Software führt für jede Kombination der ausgewählten Bedingungen eine Reihe von Kalibrierungsschritten durch. Während der Dosiskalibrierung bewegt sich der Halter automatisch zwischen dem integrierten Faraday-Stromabnehmerbecher und der Durchgangsbohrung. Die Strommessung für jede Kombination von Linsenbedingungen wird auf dem Faraday-Becher mit dem Pikoamperemeter gemessen. Dann übersetzt die Software den Tisch, um den Strahl in der Durchgangsbohrung zu zentrieren, und die Strahlfläche wird durch Bildverarbeitungsalgorithmen bestimmt. Diese Messreihe erstellt ein Profil des Zusammenhangs zwischen der Intensität/Helligkeit und der Strahlfläche. Dies ermöglicht es der Software, die Strahlfläche zu extrapolieren, wenn die Intensitäts-/Helligkeitseinstellung während eines Experiments unabhängig vom Sichtfeld angepasst wird. Anhand dieser Strahlstrom- und Strahlflächenmessungen werden Werte für die kumulative Dosis und die Dosisleistung berechnet und eine Dosiskalibrierungsdatei erstellt. Dieser Prozess definiert im Wesentlichen einen Dosis-"Fingerabdruck" für das TEM und seine individuellen Linsenbedingungen. Sobald die Dosis für das TEM kalibriert ist, kann der Benutzer normal arbeiten und die Vergrößerung und Intensität frei einstellen, ohne dass Dosisinformationen verloren gehen oder manuelle Notizen gemacht werdenmüssen 17. Nach Abschluss der Kalibrierung wird der Dosiskalibrierungshalter entfernt, sodass die Probe wie gewohnt eingesetzt werden kann. Der Kalibrierungsprozess sowohl für den TEM- als auch für den STEM-Modus dauert normalerweise weniger als 10 Minuten.

Nach der Kalibrierung der Dosisbedingungen wurde eine kommerziell erworbene Probe eines Zeolith-Nanopartikels (ZSM-5) unter Bedingungen mit hoher Dosisleistung abgebildet, um die (kumulative) Schwellendosis zu bestimmen, bei der die Probe zu geschädigt ist, um strukturelle Informationen zu liefern. Die ZSM-5 Nanopartikel wurden in Ethanol suspendiert und auf einem konventionellen Kupfer-TEM-Gitter tropfengegossen. Sie wurden kontinuierlich bei 300 kV im TEM-Modus mit einer Spotgröße von 3 und einer 100 μm Kondensatoröffnung abgebildet. Die von der MVS-Software gemessene Dosisleistung unter Bedingungen mit hoher Dosisleistung betrug 519 e-/Å2·s. Die Nanopartikel im Sichtfeld wurden kontinuierlich abgebildet, bis die Spitzen in der FFT verschwanden, was auf eine Verschlechterung der kristallinen Struktur hindeutet, wie in Abbildung 3A-C und Ergänzungsdatei 3 gezeigt. Überlagerungen (die während eines Live-Experiments oder nachträglich in der Analysesoftware hinzugefügt werden können) wurden auf die TEM-Bilder aufgebracht, um Datum und Uhrzeit, Dosisleistung, maximale (kumulative) Dosis und Vergrößerung anzuzeigen. Die Dosisleistung wurde während der Experimente konstant gehalten, wobei die kumulative Dosis (maximale Dosis) in Abhängigkeit von der Zeit zunahm. Die FFT-Peaks begannen nach 42 s kontinuierlicher Bildgebung zu verschwinden (Abbildung 3B). Nach 1 min und 20 s und einer kumulativen Dosis von ~60.000 e-/Å2 waren die FFT-Peaks vollständig verschwunden (Abbildung 3C).

Um zu zeigen, dass diese Kalibriermethode quantitative Dosismessungen erzeugt, die auf andere Mikroskope angewendet werden können, die unter anderen Einstellungen arbeiten, wurde derselbe Kalibrierprozess und das gleiche Zeolith-Abbauexperiment mit einer 200-kV-Kaltfeld-Emissionskanone (FEG) TEM und einer Spotgröße von 1 durchgeführt. Dieses Mikroskop wurde mit dem gleichen Verfahren kalibriert, das in Methode 1 beschrieben ist, und das gleiche Experiment, das in Methode 2 beschrieben ist, wurde mit den neuen Spotgrößen- und Blendeneinstellungen durchgeführt. Die Strahleinstellungen wurden so angepasst, dass der Unterschied in der angewandten Dosisleistung zwischen den beiden Experimenten vernachlässigbar war (499 e-/Å 2·s vs. 519 e-/Å 2·s). Wie in Abbildung 3D-F dargestellt und in Tabelle 1 zusammengefasst, verschwinden die FFT-Flecken nach 1 min und 50 s kontinuierlicher Bildgebung und einer kumulativen Dosis von 58.230 e-/Å2 vollständig, was mit den im ersten Experiment erzielten Werten übereinstimmt.

Ein Beispiel dafür, wie die MVS-Software von In-situ-Experimenten profitieren kann, wurde durch die Durchführung eines Erwärmungsexperiments gezeigt. Eine repräsentative Nanokatalysatorprobe, Au/FeOx (synthetisiert nach einem veröffentlichten Verfahren19), wurde als Beispielsystem ausgewählt, da sie bei hohen Temperaturen dynamischen morphologischen und strukturellen Veränderungen unterliegt. Diese temperaturinduzierte Beweglichkeit macht es schwierig, die ROI aufgrund der Eigenbewegung der Probe und der thermischen Ausdehnung des Probenträgers selbst bei Temperaturänderungen im Sichtfeld zu halten18. Mit aktivierten Funktionen "Driftkorrektur" und "Fokusassistent" wurde die Probe über einen Zeitraum von ~30 s bei 800 °C abgebildet. Bei erhöhten Temperaturen wanderten die Gold-Nanopartikel im Au/FeOx entlang der Oberfläche des Eisenoxidträgers und sinterten zu größeren Partikeln, wie in Abbildung 4 und als Film in Supplementary File 7 gezeigt. Abbildung 5 zeigt eine Reihe von TEM-Schnappschüssen (Abbildung 5A-F) eines porösen Bereichs innerhalb eines Au/FeOx Nanokatalysators, die zu verschiedenen Zeitpunkten (Abbildung 5G) während eines In-situ-Heizexperiments aufgenommen wurden. Der koordinierte Driftwert des ROI wurde von der Software automatisch berechnet. Die koordinierten Drift- und Temperaturwerte der Bilder im Verlauf der Serie sind in Abbildung 5G grafisch dargestellt. Wie erwartet, nimmt die koordinierte Drift der Probe mit zunehmendem Temperaturprofil zu, von einer Rate von ~9 nm/min auf ~62 nm/min, und beginnt in Richtung Nivellierung abzunehmen, wenn die Temperatur konstant gehalten wird. Trotz dieser hohen Driftrate und Veränderungen in der Morphologie der Probe lassen sich während des Temperaturanstiegs leicht hochauflösende Bilder erhalten, die Bewegungen innerhalb des porösen Bereichs aufzeigen, wie in der ergänzenden Datei 8 gezeigt. In der Zusatzdatei 9 finden Sie Download-Anweisungen und Computerspezifikationen.

Abbildung 2: Kalibrierung und Nachführung der Elektronendosis . (A) Die Dosis wird mit einem speziellen Probenhalter kalibriert, der einen Stromabnehmer enthält, der in der Probenebene für Strahlstrommessungen positioniert ist. (B) Illustration der Merkmale des Spitzendesigns: Links: Faradayscher Becher; Mitte: Passerbohrung; Rechts: Durchgangsbohrung (C). Die aufgebrachte Elektronendosis kann in der Software mit Hilfe von farbkodierten Karten visualisiert werden, um unterschiedliche Dosisexpositionen innerhalb eines Bildes zu kennzeichnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Elektronendosis-induzierte Degradation von Zeolith (ZSM-5) Nanopartikeln. (A-C) Schnappschüsse, die über einen Zeitraum von 1 Minute und 20 s aufgenommen wurden und Degradationsdaten zeigen, die mit einem 300 kV FEG und einer gemessenen Dosisleistung von 519 e-/Å2·s; Der Zeolith zerfällt innerhalb von 1 min und 20 s. (D-E) Schnappschüsse, die über einen Zeitraum von 1 min und 50 s aufgenommen wurden und Degradationsdaten zeigen, die mit einem 200 kV kalten FEG TEM und einer Elektronendosisleistung von 499 e-/Å2·s; Die Einschübe zeigen, dass der FFT-Spot mit der Zeit verblasst. Der Maßstabsbalken beträgt 60 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: AXON Synchronicity wendet Bildverarbeitungsalgorithmen an, um sich dynamisch entwickelnde Proben zu verfolgen und zu stabilisieren. Metadaten, die während des Experiments generiert werden, können entlang der Zeitachse dargestellt werden, sodass der Benutzer ein Bild schnell mit den zugehörigen Metadaten koppeln kann, während er durch die während des Experiments generierten Bildserien scrollt. (A-H) Bilder einer Nanokatalysatorprobe (Au/FeOx) bei 800 °C, aufgenommen über einen Zeitraum von 28 s sowohl mit (A-D) als auch ohne (E-H) der Dosiskartenüberlagerung. Rote Bereiche in der Überlagerung kennzeichnen Bereiche mit hoher kumulativer Dosisexposition, gelbe Bereiche zeigen Regionen mit geringerer Exposition an. Die Hervorhebung eines einzelnen Pixels gibt die kumulative Dosis für dieses Pixel an. Weiße Pfeile in den Feldern E-H zeigen zwei Teilchen an, die während des Experiments verschmelzen, und der orangefarbene Pfeil zeigt die Flugbahn eines sich bewegenden Goldpartikels an. (I) Die von der Analysesoftware generierte Experimentzeitleiste für die in A-H gezeigten Bildserien. Die orangefarbenen Punkte am oberen Rand der Timeline kennzeichnen rohe (nicht digital korrigierte) Bilder und die blauen Punkte kennzeichnen driftkorrigierte Bilder. Die orangefarbenen vertikalen Balken zeigen die Punkte auf der Zeitleiste an, die den gezeigten Bildern A-H entsprechen. Der Maßstabsbalken beträgt 40 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: TEM-Schnappschüsse eines porösen Bereichs innerhalb eines Au/FeOx-Nanokatalysators zu verschiedenen Zeitpunkten. Die MVS-Software stabilisiert und zentriert die Probe auch bei hohen Driftraten, wie sie während einer Temperaturrampe auftreten, durch die Anwendung von Tisch-, Strahlverschiebungs- und digitalen Korrekturen, wie sie durch Bildverarbeitungsalgorithmen angezeigt werden. (A-F) TEM-Schnappschüsse eines porösen Bereichs in einem Au/FeOx-Nanokatalysator, aufgenommen zu verschiedenen (G) Zeitpunkten während eines in situ Heizexperiments. Die Driftrate des ROI wird während eines Experiments von der MVS-Software automatisch berechnet und aufgezeichnet. Wie in (G) dargestellt, nimmt die Driftrate (orangefarbene Linie) zu, wenn das Temperaturprofil geändert wird (die blaue Linie), wenn die Temperatur steigt, und sinkt, wenn die Temperatur konstant gehalten wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammenfassender Vergleich der Zeolith-Abbauergebnisse verschiedener Mikroskope.

Ergänzende Datei 1: Screenshot der MVS-Softwareschnittstelle mit geöffneter Registerkarte für das Dosismanagement. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: MVS-Software-Datenbankdatei des strahlinduzierten Zeolith-Abbauexperiments. Diese Anzeige-/Analysesoftware steht kostenlos zum Download zur Verfügung. In der Zusatzdatei 9 finden Sie Anweisungen zum Herunterladen und die technischen Daten des Computers. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: Film des strahlinduzierten Zeolithabbaus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: CSV-Datei 1 (Zeolith-Abbau: Rohdaten [nur mechanische Korrektur]) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5: CSV-Datei (Zeolith-Abbau: driftkorrigiert [mechanische + digitale Korrektur]) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 6: MVS-Software-Datenbankdatei Nanokatalysator-In-situ-Heizexperiment . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 7: Film des Nanokatalysators bei 800 °C mit Dosisüberlagerungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 8: Film des Nanokatalysators während einer Temperaturrampe mit koordinierten Driftwerten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 9: Anleitung zum Herunterladen der kostenlosen Analysesoftware. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Protochips, Inc.