Charakterisierung der Gefäßmorphologie der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration durch Indocyaningrün-Angiographie

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine weit verbreitete Erkrankung, die bei älteren Menschen zu schwerem Sehverlust führt¹. Allein in den Vereinigten Staaten wird sich die Zahl der AMD-Patienten voraussichtlich verdoppeln und bis 2050 fast 22 Millionen erreichen, verglichen mit den derzeitigen 11 Millionen. Weltweit wird die geschätzte Zahl der AMD-Fälle bis 2040 voraussichtlich 288 Millionen erreichen².

Die choroidale Neovaskularisation (CNV), auch bekannt als "feuchte" oder neovaskuläre AMD, kann aufgrund der Bildung abnormaler Blutgefäße unter der zentralen Netzhaut verheerende Auswirkungen auf das Sehvermögen haben. Dies führt zu Blutungen, Netzhautexsudation und erheblichem Sehverlust. Die Einführung von Therapien mit antivaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), die auf extrazelluläres VEGF abzielen, hat die CNV-Behandlung revolutioniert. Trotz dieser Fortschritte zeigen jedoch bis zu 50 % der Patienten ein suboptimales Ansprechen auf diese Therapien, mit anhaltender Krankheitsaktivität wie Flüssigkeitsansammlung und ungelösten oder neuen Blutungen 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Klinische Studien haben gezeigt, dass die Anti-VEGF-Resistenz bei CNV-Patienten häufig dem Vorhandensein einer arteriolären CNV entspricht, die durch großkalibrige verzweigte Arteriolen, Gefäßschlingen und Anastomosenverbindungen gekennzeichnet^{ist 9}. Eine wiederholte Anti-VEGF-Behandlung kann zur Gefäßanomalisierung, zur Entwicklung einer arteriolären CNV und letztendlich zur Resistenz gegen Anti-VEGF-Therapien beitragen^14,15. Bei arteriolärem CNV ist ein anhaltender Flüssigkeitsaustritt wahrscheinlich auf eine erhöhte Exsudation zurückzuführen, die durch unzureichend ausgebildete Tight Junctions an arteriovenösen Anastomosenschleifen verursacht wird, insbesondere unter Bedingungen hoher Durchblutung⁹. Umgekehrt neigen Personen, die gut auf eine Anti-VEGF-Behandlung ansprechen, dazu, kapillares CNV zu zeigen.

In unseren Studien mit Tiermodellen haben wir gezeigt, dass laserinduziertes CNV bei älteren Mäusen arterioläre CNV entwickelt und eine Resistenz gegen eine Anti-VEGF-Behandlung zeigt^16,17. Umgekehrt führt laserinduziertes CNV bei jüngeren Mäusen zur Entwicklung von kapillarem CNV und zu einem hohen Ansprechen auf eine Anti-VEGF-Behandlung. Daher ist es sowohl für mechanistische als auch für therapeutische Untersuchungen von entscheidender Bedeutung, zwischen CNV-Gefäßtypen zu unterscheiden.

In klinischen Umgebungen wird CNV üblicherweise auf der Grundlage von Fluoreszenzangiographie (FA)-Leckagemustern (z. B. Typ 1, Typ 2) klassifiziert, die Fluoreszeinfarbstoff verwenden, um Exsudation zu verfolgen und Bereiche mit pathologischer Leckage zu identifizieren. In der AMD-Forschung wird CNV überwiegend mit FA in Tiermodellen untersucht. Die FA zeigt jedoch nicht die vaskuläre Morphologie von CNV. Darüber hinaus nimmt FA nur Bilder im sichtbaren Lichtspektrum auf und kann das Aderhautgefäßsystem unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE) nicht sichtbar machen. Im Gegensatz dazu erleichtert Indocyaningrün (ICG), das eine starke Affinität zu Plasmaproteinen aufweist, die vorherrschende intravaskuläre Retention und ermöglicht die Visualisierung der Gefäßstruktur und des Blutflusses⁹. Durch die Nutzung der Nahinfrarot-Fluoreszenzeigenschaft von ICG wird es möglich, das Netzhaut- und Aderhautpigment mittels ICG-Angiographie (ICGA) abzubilden. In diesem Zusammenhang wird ein Protokoll vorgestellt, das FA und ICGA kombiniert, um die Leckage und Gefäßmorphologie der laserinduzierten choroidalen Neovaskularisation (CNV) bei jungen und alten Mäusen zu untersuchen, bei denen kapillare und arterioläre CNV beobachtet werden.

Die in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) am Baylor College of Medicine genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden junge (7-9 Wochen) und alte (12-16 Monate) männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung des Bildgebungssystems

1. Positionieren Sie ein Heizkissen auf der Bildgebungsplattform (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Körpertemperatur der Maus während der Bildgebung aufrechterhalten wird. Aktivieren Sie das Heizkissen und stellen Sie die Temperatur auf 35 °C ein.
2. Entfernen Sie die Staubschutzhülle und schalten Sie das Laserscanning-Ophthalmoskop ein. Setzen Sie eine 55°-Linse auf die Maschine.
3. Richten Sie die Bildgebungssoftware ein (siehe Materialtabelle) und geben Sie wichtige Informationen ein, einschließlich Genotyp, Geschlecht, Alter usw. Wenn die Bildgebungssitzung beginnt, wählen Sie den IR (Infrarotkanal) für die Aufnahme von ICGA-Bildern.

2. Vorbereitung der Tiere vor ICGA und FA

1. Wiegen Sie die Maus, um die erforderliche Anästhesiemenge (Ketamin/Xylazin 70-100/2,5-10 mg/kg, siehe Materialtabelle) zu bestimmen.
   HINWEIS: Die Optimierung der Dosierung ist entscheidend, da das Stoffwechselprofil zwischen verschiedenen Mausstämmen variiert. Es ist wichtig, die geeignete Dosierung zu bestimmen, um zu vermeiden, dass die Maus vor Abschluss der Bildgebung aufwacht oder das Risiko einer Überdosierung und einer möglichen Tiersterblichkeit besteht.
2. Verwenden Sie eine sterile 1-ml-Spritze mit einer 30-32-G-Nadel, um eine Anästhesie durch intraperitoneale Injektion zu verabreichen. Kneifen Sie vorsichtig in eine der Pfoten der Maus, um zu überprüfen, ob die Maus ausreichend betäubt ist. Wenn das Tier eine Reaktion oder Bewegung zeigt, ist es ratsam, zusätzliche Zeit zu warten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. So kann sich das Tier einleben und sorgt für optimale Bedingungen für die nachfolgenden Eingriffe.
3. Verabreichen Sie 1% Tropicamid ophthalmische Lösungstropfen, um beide Augen der Maus zu erweitern. Warten Sie mindestens 30 s, bevor Sie 0,5% Proparacainhydrochlorid-Tropfen (siehe Materialtabelle) auf beide Augen auftragen, um Augenbewegungen und Blinzeln zu reduzieren. Anschließend Gleitaugengeltropfen auftragen.
   HINWEIS: Während der gesamten Dauer der Anästhesie ist es wichtig, das Problem der extremen Trockenheit in den Augen der Maus anzugehen, die zu einer Hornhauttrübung führen kann. Diese Opazität erschwert die spätere Bildgebung aufgrund der eingeschränkten Sicht. Um dies zu verhindern, ist es wichtig, kontinuierlich Gleitgeltropfen aufzutragen, um die Augen der Maus mit Feuchtigkeit zu versorgen.
4. Legen Sie die Maus auf ein Heizwasserpad.
   HINWEIS: Mäuse besitzen ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was zu einem erhöhten Wärmeverlust an die Umgebung führt. In Kombination mit dem durch die Anästhesie induzierten Temperaturabfall kann dies ein erhebliches Risiko für die Maus darstellen und möglicherweise zum Tod durch Unterkühlung führen. Es ist wichtig, die notwendigen Vorkehrungen zu treffen, um Unterkühlung zu verhindern und das Wohlbefinden der Maus während des Eingriffs zu gewährleisten.
5. Bereiten Sie eine 1:1-Volumenmischung aus 2 mg/ml ICG und 20 mg/ml Fluoresceinfarbstoff vor (siehe Materialtabelle). 250 μl der Mischung durch intraperitoneale Injektion mit einer 1-ml-Spritze und einer 32-g-Nadel verabreichen.
   1. Führen Sie die Nadel in den unteren linken Quadranten des Mausbauchs in der Nähe der Hinterbeine in einem Winkel parallel zur Haut der Maus ein, um eine Perforation von Organen zu vermeiden.
   2. Ziehen Sie den Kolben vorsichtig heraus und stellen Sie sicher, dass kein Blut in die Spritzenkappe eingedrungen ist. Fahren Sie fort, den Farbstoff langsam und gleichmäßig zu injizieren und dabei ein gleichmäßiges Tempo beizubehalten.
      HINWEIS: Der ICG-Farbstoff muss vor der Verwendung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter filtriert werden.

3. ICGA und FA

1. Legen Sie die Maus auf das Heizkissen der Bildgebungsplattform, um die Bildgebung zu starten.
2. Positionieren Sie das Gehäuse der Maus in einem 45-Grad-Winkel zur Kamera und drehen Sie den Kopf leicht nach unten. Dadurch kann der Sehnerv im Zentrum des Kamerafokus stehen.
3. Wischen Sie das Auge mit einem Wattestäbchen vorsichtig ab, um die Schicht der Gleitaugentropfen oder -gele auf dem zuerst abgebildeten Auge zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Gleitgeltropfen sofort nach Abschluss des bildgebenden Verfahrens auftragen.
   HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, das Auge länger als 1 Minute unter Narkose ohne Befeuchtung zu lassen.
4. Bewegen Sie die Kamera in Richtung des Mausauges. Wählen Sie den FA-Kanal aus dem Erfassungsmodul aus. Die vom FA-Kanal emittierte Lumineszenz kann verwendet werden, um sich in der Mitte der Maushornhaut zu positionieren, um eine schnellere Platzierung zu ermöglichen.
5. Positionieren Sie den Kopf der Maus so, dass der Sehnerv auf dem Bildschirm zentriert ist, ohne dass das Laserscanning-Ophthalmoskop schräg geneigt werden muss. Nehmen Sie geringfügige Anpassungen an der Kopfposition der Maus vor, um die gewünschte Ausrichtung zu erreichen.
6. Wählen Sie im Erfassungsmodul den ICGA-Kanal aus. Stellen Sie sicher, dass die Laserintensität auf 100 % eingestellt ist, und wählen Sie die Option 55°, die dem entsprechenden Objektiv entspricht. Dies gewährleistet optimale Einstellungen für das Laserscanning-Ophthalmoskop.
   HINWEIS: Um eine Übersättigung zu vermeiden, kann es erforderlich sein, bei der Bildgebung im Frühstadium eine niedrigere Laserintensität zu verwenden, typischerweise etwa 25 % bis 50 %. Die Einstellung der Laserintensität in diesem Bereich kann dazu beitragen, klare und genaue Bilder aufzunehmen, ohne eine Übersättigung zu verursachen.
7. Wenn das Auge den gesamten Bildschirm der Bildgebungssoftware einnimmt, nehmen Sie Anpassungen an den Empfindlichkeits- und Fokuseinstellungen vor, um ein möglichst klares Bild der CNV-Membran zu erhalten.
   1. Drehen Sie den runden schwarzen Knopf am Aufnahmemodul, um die Empfindlichkeit des Bildes anzupassen.
   2. Drehen Sie den Knopf am Ophthalmoskop, um den Fokus einzustellen. Der optimale Fokus für die Visualisierung des retinalen Gefäßsystems mit FA liegt typischerweise im Bereich von 35-45 dpt (Dioptrien). Andererseits liegt der ideale Fokus für die Visualisierung der Aderhaut mit ICGA im Allgemeinen zwischen 10-15 D.
      HINWEIS: Aufgrund der unterschiedlichen Größen der CNV-Membran kann es erforderlich sein, den Fokus in 10-30 D einzustellen, um eine optimale Abbildung der Gefäßmorphologie zu erhalten.
8. Nachdem der Fokus und die Empfindlichkeit eingestellt wurden, um das bestmögliche Bild zu erzielen, drücken Sie die runde schwarze Taste am Aufnahmemodul, um das Bild zu normalisieren. Sobald die Normalisierung abgeschlossen ist (alle Bilder erfasst), klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen " auf dem Touchscreen-Bedienfeld, um das Bild zu speichern. Es kann erforderlich sein, die Kamera zu bewegen, um CNV aus verschiedenen Blickwinkeln abzubilden. Die Maus kann auch in verschiedenen Positionen ausgerichtet werden, um das beste Bild der CNV-Läsion zu erhalten.
   HINWEIS: Möglicherweise muss der Fokus oder die Positionierung des Laserscanning-Ophthalmoskops neu eingestellt werden, wenn das Gefäßsystem weiter vom Sehnerv entfernt betrachtet wird.
9. Wechseln Sie mit dem Erfassungsmodul zurück zum FA-Kanal . Führen Sie die gleichen Schritte aus, die in den Schritten 3.6-3.7 aufgeführt sind, um die Empfindlichkeit und den Fokus jedes Bildes anzupassen und die Leckage der CNV-Läsion zu erfassen.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die richtige Empfindlichkeit ausgewählt ist, um eine Übersättigung der CNV-Leckage zu vermeiden und den Leckbereich künstlich zu vergrößern.
10. Stellen Sie sich die "frühe Phase" von ICGA und FA 3-4 Minuten nach der Injektion vor.
    HINWEIS: Die "frühe Phase" ist die Zeit, in der das Aderhautgefäßsystem klar und deutlich zu sehen ist. Während der mittleren Phase, die typischerweise zwischen 4 und 8 Minuten auftritt, sind die Netzhaut- und Aderhautgefäße viel stärker verblasst und diffus. Mit Beginn der Spätphase (>8-10 min) werden sowohl die Aderhaut- als auch die Netzhautgefäße nicht mehr zu erkennen. Hyperfluoreszierende CNV-Läsionen zeigen jedoch einen maximalen Kontrast gegen den verminderten Hintergrund. Diese genannten Zeitpunkte sind variabel und hängen von der Konzentration und Menge des injizierten ICG-Farbstoffs ab. Eine größere Menge an ICG-Farbstoff neigt dazu, die Zeitachse jeder Phase zu verlängern und deutlichere Gefäße zu erzeugen. Eine Phase sollte auf der Grundlage der oben aufgeführten Hauptmerkmale und nicht auf einer absoluten Zeit definiert werden.
11. Sobald alle Bilder aufgenommen wurden, tragen Sie ein Gel-Gleitmittel oder eine Salbe auf das Auge der Maus auf und überwachen Sie die Maus auf dem Heizkissen sorgfältig, um sich zu erholen. Normalerweise dauert es 1,5 Stunden, bis sich die Maus vollständig erholt hat.
12. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihre Käfige und den dafür vorgesehenen Haltebereich, sobald sie sich vollständig von der Narkose erholt haben und wach sind.
13. Exportieren Sie die Bilder vor dem Herunterfahren des Bildgebungssystems und des Lasers als TIFF- oder JPEG-Dateien für die anschließende Analyse.

4. RPE/Aderhaut-Flatmount und Färbung

1. Fixieren Sie die Augen über Nacht in 4% Paraformaldehyd. Waschen Sie die Augen dreimal mit PBS. Entfernen Sie die Linse und die Hornhaut.
2. Die Augen in Blockierungslösung (10 % Rinderserumalbumin, 0,6 % Triton X-100 in PBS) 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche dreimal.
3. Inkubieren Sie die Augen mit Isolektin GS-IB4 Alexa-Mehl 568 Konjugat und Anti-α-Glattmuskel-Aktin-Antikörper (siehe Materialtabelle) über Nacht in der Blockierungslösung.
4. Dreimal mit PBS waschen. Inkubieren Sie die Proben mit einem Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
5. Führen Sie 4 radiale Schnitte vom Rand bis zum Äquator durch. Entfernen Sie vorsichtig die Netzhaut¹⁷.
   HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass sich die neovaskuläre Membran nicht versehentlich löst.
6. Montieren Sie die flach montierte Aderhaut auf einem Glasobjektträger. Visualisieren Sie die CNV mit konfokaler Mikroskopie.

Gemäß dem Protokoll wurden ICGA und FA an laserinduzierter CNV bei jungen (7-9 Wochen) und alten (12-16 Monate) C57BL/6J-Mäusen durchgeführt. FA liefert Informationen über die Lage und Leckage der CNV-Läsionen (Abbildung 1, linke Felder), während ICGA die vaskuläre Morphologie der CNV-Läsionen zeigt (Abbildung 1, rechte Felder). Bei jungen Mäusen dominiert das kapillare CNV die CNV-Läsionen. Im Gegensatz dazu weisen alte Mäuse eine arterioläre CNV auf, die durch großkalibrige Gefäße, Gefäßschlingen und Anastomosenverbindungen gekennzeichnet ist. Sowohl junge als auch alte Mäuse zeigen eine deutliche Sichtbarkeit des retinalen Gefäßsystems bei FA (Abbildung 1, linke Felder). In den ICGA-Bildern junger Mäuse ist das retinale Gefäßsystem nicht sichtbar und die Aderhautgefäße erscheinen verblasst, was auf die mittlere Phase der ICGA mit dem Schwerpunkt auf dem Aderhautgefäßsystem hinweist. In den ICGA-Bildern alter Mäuse kann ein partielles retinales Gefäßsystem beobachtet werden, während die Aderhautgefäße verblasst erscheinen, was auf die mittlere Phase mit dem Fokus zwischen Netzhaut und Aderhaut aufgrund der größeren Größe des arteriolären CNV bei alten Mäusen hindeutet. Die arterioläre CNV bei alten Mäusen weist eine größere CNV-Größe auf (Abbildung 2) und signifikant mehr Leckage im Vergleich zur kapillaren CNV bei jungen Mäusen. Die Immunfärbung mit einem Aktin-Antikörper gegen die glatte Muskulatur markiert das CNV-Gefäßsystem bei alten Mäusen großflächig und bestätigt die arterioläre Morphologie (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu wird eine minimale Färbung mit α-glattem Muskelaktin in den Gefäßen der Läsionsstelle junger Mäuse beobachtet, was mit der Kapillarmorphologie übereinstimmt.

Abbildung 1: Vergleich von FA- und ICGA-Bildern, die laserinduziertes CNV bei jungen und alten Mäusen darstellen. Die FA-Bilder zeigen die Leckage von CNV-Läsionen, während ICGA die Gefäßmorphologie visualisiert. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Quantifizierung der Größe der CNV-Läsion bei jungen und alten Mäusen auf der Grundlage von ICGA-Bildern. Es wurden CNV-Bereiche gemessen, wobei insgesamt 26 bzw. 14 Laserspots bei jungen bzw. alten Mäusen analysiert wurden. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. Die statistische Analyse wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt. P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder von CNV-Läsionen bei jungen und alten Mäusen, co-markiert mit Alexa 568-Isolektin und Anti-α-Glattmuskel-Aktin-Antikörpern auf RPE/Aderhaut-Flat-Mounts. Die rote Farbe steht für Alexa 568-Isolektin, während die grüne Farbe für α-glattes Muskelaktin (SMA) steht. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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