Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

Im Mai 2023 gab es nun mehr als 766 Millionen COVID-19-Fälle¹. Trotz weltweiter Impfkampagnen zirkuliert SARS-CoV-2 kontinuierlich und infiziert Menschen, was vor allem auf das Auftreten neuer Varianten wie Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) zurückzuführen ist, die neue Infektionswellen auslösen ^2,3,4. Da sich SARS-CoV-2 ständig weiterentwickelt, ist es wichtig, schnelle Assays zu entwickeln, die die Infektiosität neu auftretender Varianten und die Wirksamkeit von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern gegen diese Varianten genau messen können. Diese Assays sind für die Pandemieüberwachung und für die Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen und ihren variantenspezifischen Auffrischungsimpfungen unerlässlich.

Aufgrund der hochansteckenden Natur von SARS-CoV-2 verlangt das Center for Disease Control and Prevention (CDC), dass die Untersuchung von SARS-CoV-2 und seinen Varianten in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe (BSL) 3 durchgeführt wird ^5,6. Diese BSL-3-Anforderung schränkt die Verwendung lebender Viren zur Quantifizierung der Infektiosität von Virusvarianten und ihrer neutralisierenden Antikörper in gemeinsamen Forschungs- und klinischen Labors ein. Darüber hinaus sind herkömmliche SARS-CoV-2-Neutralisationsassays, wie z. B. die auf Plaques oder zytopathischer Wirkung basierenden Assays mit replikationskompetenten Lebendviren, zeitaufwändig und erfordern lange Inkubationszeiten⁷. Mehrere Spike-Protein-pseudotypisierte SARS-CoV-2-Pseudoviren wurden entwickelt, um die Wirksamkeit neutralisierender Antikörper^zu quantifizieren 8,9,10,11,12. Bei SARS-CoV-2 ist das S-Protein das Hauptprotein, das den Viruseintritt vermittelt¹³ und das Hauptantigen, das in SARS-CoV-2-Impfstoffen^{verwendet wird} 9,10,14,15,16. Die S-Protein-pseudotypisierten Virionen, wie die des vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) oder des Lentivirus, wurden zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper verwendet 17,18,19. Dennoch benötigt das Lentivirus-basierte Pseudovirus normalerweise 2 bis 3 Tage der Infektion, um Reportersignale zu quantifizieren. VSV-basierte Pseudovirussysteme enthalten häufig VSV-Restviren, die zu hohen Raten falsch-positiver Ergebnisse führen können und typischerweise 24 Stunden Infektion erfordern²⁰.

Ein neuartiges SARS-CoV-2-Pseudovirussystem, das hybride Alphavirus-SARS-CoV-2-Pseudovirus (Ha-CoV-2), wurde kürzlich von Hetrick et al.¹² entwickelt. Ha-CoV-2 bietet ein neues Werkzeug zur schnellen Quantifizierung der Virusinfektiösität und der Virusempfindlichkeit gegenüber neutralisierenden Antikörpern in gängigen BSL-2-Labors. Strukturell ähnelt Ha-CoV-2 dem SARS-CoV-2-Virionpartikel, das aus SARS-CoV-2-Strukturproteinen besteht, einschließlich des S-Proteins (S), der Membran (M), des Nukleokapsids (N) und der Hülle (E), und es gibt kein Strukturprotein von anderen Viren. Darüber hinaus enthält das Ha-CoV-2-Partikel ein schnell exprimierendes RNA-Genom aus einem Alphavirus für eine schnelle Reporterexpression in Zellen. Es wurde gezeigt, dass Ha-CoV-2 die neutralisierende Aktivität von Antikörpern in den Seren von geimpften und genesenen Personen schnell misst¹². Wie Hetrick et al. zeigten, exprimierte Ha-CoV-2 im Vergleich zu einem Lentivirus-basierten SARS-CoV-2-Pseudovirus in einem Zeitverlaufsassay den Luc-Reporter bereits 2-4 h nach der Infektion, während das Lentivirus-Pseudovirus Luc nach 24 h^exprimierte. Darüber hinaus wird die potenzielle Anwendung von Ha-CoV-2-Varianten zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper durch die Verwendung eines monoklonalen neutralisierenden Standardantikörpers, 27BV, weiter demonstriert (siehe ergänzende Abbildung 1)¹². In dieser Arbeit wird die Verwendung der Ha-CoV-2-Plattform zur schnellen Quantifizierung der Infektiosität von SARS-CoV-2-Varianten am Beispiel der Varianten Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) beschrieben. Darüber hinaus wird die potenzielle Anwendung von Ha-CoV-2-Varianten zur Quantifizierung neutralisierender Antikörper durch die Verwendung eines monoklonalen neutralisierenden Standardantikörpers, 27BV¹², weiter demonstriert.

1. Virus- und Viruspartikel-Assemblierung

1. Vektoren: Kaufen Sie Expressionsvektoren für SARS-CoV-2 M, E oder N sowie SARS-CoV-2 S (Wildtyp, Wt), Delta (B.1.617.2) und Omikron (B.1.1.529) kommerziell.
   HINWEIS: Proteinsequenzen der Expressionsvektoren sind in der Zusatzdatei 1 enthalten. Den Anbieter dieser Expressionsvektoren finden Sie auch unter der Materialtabelle.
2. Zellen und Zellkultur: Halten Sie HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.
   HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten müssen in einer Biosicherheitswerkbank mit laminarem Luftstrom durchgeführt werden. Die Transfektion von Polyethylenimin (PEI) erfordert typischerweise eine Inkubationszeit von 5-6 Stunden. Die Startzeiten müssen im Vorfeld genau abgewogen werden.
3. Virusassemblierung und PEI-basierte Kotransfektion: Assemblierung von Ha-CoV-2-Partikeln durch Kotransfektion HEK293T Zellen. Keimzellen in einer 10 cm Zellkultur-Petrischale (4-5 x 10⁶ Zellen pro Schale) in 10 ml vollständigem DMEM-Medium am Tag vor der Kotransfektion. Für diese Studie werden drei Petrischalen verwendet, um Zellen für den Zusammenbau von Ha-CoV-2-Wildtyp, Delta bzw. Omicron zu säen.
4. Petrischalen über Nacht in einem CO₂ -Inkubator bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie das Geschirr am nächsten Morgen, um sicherzustellen, dass die Zellen zu 80 % zusammenfließen. Entfernen Sie das gesamte Medium und ersetzen Sie es durch 9 ml DMEM-serumfreies Medium.
5. Bereiten Sie für jedes Gericht eine Cotransfektionsmischung mit jeweils 2,5 μg der SARS-CoV-2-Strukturproteinexpressionsvektoren (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-Genom) und 2,5 μg des S-Proteinexpressionsvektors, entweder der Delta- oder der Omicron S-Variante, und 45 μl PEI-basiertem Transfektionsreagenz zu. Lassen Sie die Cotransfektionsmischung durch 13 min Inkubation komplexe bilden (nicht länger als 30 min inkubieren).
6. Nach der Inkubation die Cotransfektionsmischung langsam und tropfenweise in jede Petrischale geben. Stellen Sie das Geschirr für 6 h bei 37 °C in einen CO₂ -Inkubator. Entfernen Sie nach 6 h serumfreies DMEM und ersetzen Sie es durch vollständiges DMEM-Medium. Ernte des Virus 48-60 Stunden nach der Kotransfektion.
7. Virusernte und -lagerung: Ernte der Partikel 48 Stunden nach der Kotransfektion. Trennen Sie die Zellen durch wiederholtes Pipettieren über die Oberfläche der Monoschicht und sammeln Sie Zellen aus jeder Schale, geben Sie sie in 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 x g . Der Überstand wird aufgefangen und durch einen 0,22-μM-Filter geleitet. Lagern Sie das Ha-CoV-2-Pseudovirus bei -80 °C.

2. Viraler Infektiositätstest

1. Zellen und Zellkultur: Halten Sie HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.
2. Aussaat HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen: Am Tag vor dem viralen Infektiositätstest HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in einer 96-Well-Platte in 50 μl vollständigem DMEM-Medium säen. Für jede 96-Well-Platte werden 2,5 x 10⁴ Zellen in jede Vertiefung gesät, und für eine Platte werden insgesamt 2,5 x 10⁶ Zellen benötigt. Stellen Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einen CO₂ -Inkubator.
3. Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Verwenden Sie Ha-CoV-2-Variantenpartikel, um HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen zu infizieren. Entfernen Sie am Morgen der Infektion 50 μl DMEM aus der vorgesäten 96-Well-Platte. Ersetzen Sie das Medium durch 50 μl Ha-CoV-2 Wildtyp, Delta oder Omikron für 18 Stunden bei 37 °C.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, bis die Infektion 18 Stunden Inkubationszeit erreicht hat und die Platte bereit ist, mit dem Luciferase-Assay analysiert zu werden. Der Erfolg der Infektion wird durch den Luziferase-Assay bestimmt, der aus dem in den infizierten Zellen exprimierten Luciferase-Reportergen resultiert, daher ist die Infektion der Ha-CoV-2-Variante umso erfolgreicher, je mehr Signal erzeugt wird.
4. Luciferase-Assay: Nach 18 Stunden Inkubation 7,5 μl Zelllysepuffer direkt in jede Vertiefung geben und 2 Minuten lang durch orbitales Schütteln mischen. Zellen in Lysepuffer für mindestens 5 min bei Raumtemperatur lysieren.
5. Bereiten Sie die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung vor, indem Sie die D-Luciferin-Lösung mit der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung im Verhältnis 1:50 mischen. Kombinieren Sie für eine ganze 96-Well-Platte 3 ml der Luciferase-Substratlösung mit 60 μl der D-Luciferin-Lösung mit 2940 μl der Firefly-Luciferase-Pufferlösung.
6. Geben Sie 25 μl der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den Zelllysaten und mischen Sie die Platte durch Orbitalschütteln für 1 Minute. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader.

3. RNA-Extraktion von Ha-CoV-2 und quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (RT-qPCR)

1. Extraktion viraler RNA: Extrahieren Sie die virale RNA aus Ha-CoV-2-Wildtyp- und Ha-CoV-2-Delta- und Omicron-Variantenpartikeln mit einem kommerziellen viralen RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lagern Sie die extrahierte virale RNA bei -80 °C oder verwenden Sie sie sofort für die RT-qPCR.
2. RT-qPCR: Führen Sie die RT-qPCR an viraler RNA mit einem einstufigen Mastermix durch. Führen Sie die Reaktion in einem handelsüblichen PCR-Gerät durch. Bitte beachten Sie, dass das Ziel der Amplifikation die genomische RNA von Ha-CoV-2 ist. Verwenden Sie Ha-CoV-2-Vektor-DNA als Standard für die Erstellung einer Standardkurve und die Berechnung der RNA-Kopienzahl jeder Variante.

4. Neutralisierender Antikörper-Assay

1. Aussaat HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen: Am Tag vor dem Assay HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen in einer 96-Well-Platte in 50 μl vollständigem DMEM-Medium säen. HEK293T (ACE2/TMPRSS2)-Zellen werden kommerziell gekauft.
2. Zum Zählen der Zellen werden 20 μl-Zellen aus einem T75-Kolben mit HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen entnommen und mit 20 μl Trypanblaulösung gemischt. Geben Sie 20 μl dieser Mischung in die Zellzählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml. Um eine 96-Well-Platte für die Infektion zu säen, verwenden Sie 2,5 x 10⁴ Zellen pro Well, und insgesamt werden 2,5 x 10⁶ Zellen benötigt. Die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einen CO₂ -Inkubator stellen.
3. Neutralisierender Antikörper-Assay: Bereiten Sie in einer sterilen 96-Well-Platte aus Polypropylen die standardmäßige Mischung aus neutralisierendem 27BV-Antikörper und Ha-CoV-2 vor. Geben Sie 8 μl 27BV (45 mg/ml) in die Platte und führen Sie serielle Verdünnungen des Antikörpers mit 6 μl serumfreiem DMEM durch.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Pipettenspitzen zwischen den Well-Transfers auszutauschen und sicherzustellen, dass der Antikörper und das serumfreie Medium gründlich gemischt sind, um genaue Ergebnisse zu erzielen.
4. Dem seriell verdünnten Antikörper werden 54 μl Ha-CoV-2-Partikel zugesetzt und das Virus und der Antikörper vermischt. Ha-CoV-2-Partikel mit seriell verdünntem 27BV 1 h bei 37 °C bei 5 % CO₂ vorinkubieren. Nach der 1-stündigen Inkubation werden 50 μl des Antikörper-Ha-CoV-2-Gemisches auf die 96-Well-Platte mit den am Vortag ausgesäten HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen (2,5 x 10⁴ Zellen pro Well) gegeben.
5. Lassen Sie für Kontrollen mindestens drei Vertiefungen, die nur die HEK293T (ACE2/TMPRSS2)-Zellen enthalten. Geben Sie 50 μl vollständiges Medium in diese Vertiefungen, die als nicht infizierte Vertiefungen für das Hintergrundsignal der Luciferase-Assay-Messwerte dienen.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, bis die Infektion 18 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C erreicht hat und die Platte dann für die Analyse mittels Luciferase-Assay bereit ist.
6. Luciferase-Assay: Nach 18 Stunden Inkubation 7,5 μl Lysepuffer direkt in jede Vertiefung geben und 2 Minuten lang durch orbitales Schütteln mischen. Zellen in Lysepuffer für mindestens 5 min bei Raumtemperatur lysieren.
7. Bereiten Sie die Firefly-Luciferase-Assay-Lösung vor, indem Sie die D-Luciferin-Lösung mit der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung im Verhältnis 1:50 mischen. Kombinieren Sie für eine ganze 96-Well-Platte 3 ml der Luciferase-Substratlösung mit 60 μl der D-Luciferin-Lösung mit 2940 μl der Glühwürmchen-Luciferase-Pufferlösung.
8. Geben Sie 25 μl der Firefly-Luciferase-Assay-Lösung zu den Zelllysaten und mischen Sie die Platte durch Orbitalschütteln für 1 Minute. Analysieren Sie die Luciferase-Aktivität mit einem handelsüblichen Luciferase-Mikroplatten-Reader.

5. Quantifizierung und statistische Analyse

1. Datenerhebung: Führen Sie Infektions- und Luciferase-Assays in dreifacher Ausführung durch, wie angegeben (Abbildung 1). Quantifizieren Sie die Luciferase-Expression mit Luciferase-Assay-Messwerten. Der Mittelwert ist der Durchschnittswert der drei Luciferase-Assay-Messwerte. Hintergrundsignalwerte aus nicht infizierten Vertiefungen werden von diesem Mittelwert abgezogen. Die Standardabweichung (SD) wird aus dem Durchschnittswert der Luciferase-Assay-Messwerte bestimmt.
2. Datenanalyse: Zeichnen Sie die Antikörperneutralisationsaktivität auf und berechnen Sie die ID_50-Werte (50% Hemmdosis) mit kommerzieller Grafiksoftware. Der_ID-50-Wert ist definiert als die Antikörper-inhibitorischen Verdünnungen, bei denen eine 50%ige Verringerung der Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen (basierend auf Luciferase-Assay-Messwerten) erreicht wird.

Ha-CoV-2-Partikel wurden mit fünf verschiedenen DNA-Vektoren zusammengesetzt, die das Ha-CoV-2-RNA-Genom und die Strukturproteine (M, N, E und S) von SARS-CoV-2 in HEK293T Zellen exprimieren. Der S-Protein-Vektor variiert je nach S-Variante. Das S-Protein aus dem ursprünglichen Ha-CoV-2-Wuhan-Stamm (Wildtyp, Wt) wurde als Positivkontrolle verwendet und zusammen mit dem S-Protein aus jeder der beiden anderen Varianten zusammengesetzt: Delta (B.1.617.2) oder Omikron (B.1.1.529). In allen Varianten wurden die gleichen M, N, E verwendet. Ha-CoV-2(Wt)- und Variantenpartikel wurden 48 Stunden nach der Kotransfektion gesammelt und dann zur Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen verwendet. Die Infektiosität wurde durch die Expression von Luciferase 18 h nach der Infektion gemessen. In diesem System spiegeln höhere Expressionsniveaus des Luciferase-Signals eine höhere Infektion der Zellen mit Ha-CoV-2 wider. Das Luciferase-Signal wurde mit genomischen RNA-Kopien durch RT-qPCR für jede Variante normalisiert. Wie in Abbildung 1 gezeigt, erzeugte die Ha-CoV-2-Omikron-Variante ein 4- bis 10-fach höheres Signal als die ursprüngliche Ha-CoV-2(Wt), was auf eine höhere Infektiosität hindeutet.

Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von 27BV zur Neutralisierung von HaCoV-2(Wt), Delta- und Omicron-Varianten quantifiziert. 27BV ist ein monoklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen die RBD-Domäne des SARS-COV-2 S1-Proteins entwickelt wurde. Für Neutralisationsassays wurden serielle Verdünnungen von 27BV in einer 96-Well-Platte durchgeführt, mit Ha-CoV-2 vorinkubiert und dann zu HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zielzellen hinzugefügt. Die Ergebnisse zeigten, dass 27BV eine neutralisierende Aktivität gegen alle getesteten Varianten aufwies (Abbildung 2). Interessanterweise war der ID50 von 27VB für Omicron etwa 10-mal weniger wirksam als der ID50 für Ha-CoV-2(WT) und Ha-CoV-2(Delta; Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ha-COV-2-Plattform als schnelle Methode zur Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in neu auftretenden Varianten eingesetzt werden kann.

Abbildung 1. Assemblierung und Quantifizierung von Ha-CoV-2-Varianten. (A) Illustration der Assemblierung des Ha-CoV-2 und der Variantenpartikel. Die Vektoren, die das Ha-CoV-2-Reportergenom und die Strukturproteine (M, S, N und E) exprimieren, werden in HEK293T Zellen kotransfiziert. Die Partikel wurden 48 Stunden nach der Kotransfektion geerntet (die Bildgebung von Virionpartikeln und HEK293T Zellen wurde mit Biorender.com erstellt). (B) Quantifizierung der Infektiosität von Ha-CoV-2-Varianten. Die relative Infektiosität der beiden Varianten (Delta und Omicron) wird anhand genomischer RNA-Kopien einzelner Ha-CoV-2 (Luc)-Varianten quantifiziert und normalisiert. Wildtyp ist der Ha-COV-2 (Wt), der als Kontrolle zum Vergleich verwendet wird. Infektions- und Luciferase-Assays wurden 3x durchgeführt. RU, relative Einheit. Der Mittelwert und die Standardabweichung (SD) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Quantifizierung der 27BV-Neutralisationsaktivität gegen Ha-CoV-2(Luc)-Varianten Die Neutralisationsaktivität von 27BV wurde 18 h nach der Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen analysiert. Die ID50 wurde anhand der relativen Infektionsrate (Luciferase-Aktivität) im Vergleich zur 27BV-Konzentration berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Infektion von HEK293T(ACE2/TMPRSS2) mit Ha-CoV-2(GFP). Ha-CoV-2(GFP)-Partikel wurden zusammengesetzt und dann verwendet, um HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-Zellen zu infizieren. Die GFP-Expression wurde 48 Stunden nach der Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Das weiße Feld infizierter Zellen ist links und die GFP-Bildgebung rechts dargestellt. Der weiße Balken steht für 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1. Grafische Zusammenfassung. Die Struktur und Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus. Mit Biorender.com erstelltes Bild. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1. Proteinsequenzen. Liste der Sequenzen der SARS-CoV-2 S-, M-, N- und E-Proteine. Zu den S-Protein-Sequenzen gehören auch die SARS-CoV-2-Varianten Omikron (B.1.1.529) und Delta (B.1.617.2). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ein Patent wurde von der George Mason University angemeldet und an Virongy Biosciences Inc. für die Produktentwicklung lizenziert. Y.W. ist Gründer und Mitglied des Beirats von Virongy Biosciences. B. H. ist derzeit CEO und Chief Scientific Officer von Virongy Biosciences. Die Autoren haben keine anderen Interessenkonflikte.