Curcuminoid-vermittelte antimikrobielle photodynamische Therapie an einem Mausmodell der oralen Candidiasis

Orale Candidiasis (OC) ist die Hauptpilzinfektion der Mundhöhle; es wird durch das Überwachsen von Candida spp. verursacht. Zu den prädisponierenden Faktoren für OC gehören endokrine Dysfunktion, der Einsatz von Breitbandantibiotika, Strahlen- und Chemotherapie, Ernährungsmängel, Xerostomie (niedriger Speichelfluss), Prothesengebrauch, schlechte Hygiene und insbesondere Immunsuppression¹. Unter den Candida-Arten ist Candida albicans die am weitesten verbreitete und virulente; Es kommt als kommensale Spezies im menschlichen Körper und als opportunistischer Krankheitserreger vor. C. albicans hat die Fähigkeit, seine Morphologie von kommensalen Hefen (Blastoporen) zu pathogenen Filamenten (Hyphen und Pseudohyphen) zu ^ändern2. Die fadenförmigen Formen, insbesondere die Hyphen, können durch Endozytose oder aktives Eindringen in das Wirtsepithel eindringen und eine Infektion^{verursachen 3}. Andere Virulenzfaktoren von C. albicans sind Adhäsion, Biofilmbildung und Sekretion von lipolytischen und hydrolytischen Enzymen und Toxinen wie Lipasen, Phospholipasen, Proteinasen und Candidalysin⁴.

OC-Behandlungen beinhalten die Verwendung von Antimykotika, insbesondere topischen Polyenen und Azolen (Nystatin und Miconazol)⁵. Sie zeigen jedoch nur eine kurzfristige Wirksamkeit, und es kommt häufig zu Rezidiven. Darüber hinaus hat der übermäßige Gebrauch von Antimykotika zu dem Problem der Entwicklung und Ausbreitung von Antimykotika geführt⁶. Daher sind alternative Therapien erforderlich, wie z. B. die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT), die einen Photosensibilisator (PS) und Licht mit einer geeigneten Wellenlänge (der gleichen wie die PS-Absorption) in Gegenwart von Sauerstoff kombiniert. PSs sind an Zellen gebunden oder werden von diesen aufgenommen und produzieren, wenn sie durch Licht aktiviert werden, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die für sensibilisierte Zellen toxisch sind⁷.

Bei der aPDT ist einer der verwendeten Photosensibilisatoren (PSs) Curcumin (CUR), eine natürlich vorkommende Verbindung, die aus den Rhizomen der Kurkumapflanze (Curcuma longa L.) gewonnen wird. Curcumin besitzt zahlreiche therapeutische Eigenschaften, darunter entzündungshemmende, antioxidative, krebshemmende und antimikrobielle Eigenschaften ^8,9. Eine frühere Untersuchung ergab, dass aPDT unter Verwendung von CUR C. albicans in einem Mausmodell der oralen Candidiasis effektiv verringerte, ohne das Gewebe des Wirts zu schädigen¹⁰. CUR ist das wichtigste Curcuminoid, das aus Kurkuma gewonnen wird, aber auch andere Polyphenole wie Demethoxycurcumin und Bis-Demethoxycurcumin sind in dieser Pflanze enthalten. Curcuminoid-vermittelte aPDT zeigte antibakterielle Aktivität gegen Biofilme von Staphylococcus aureus, die in Kathetern gezüchtet wurden¹¹. Nach unserem besten Wissen bleibt seine antimykotische Aktivität gegen C. albicans jedoch unklar. Daher haben wir in dieser Studie aPDT, die durch ein Curcuminoidsalz vermittelt wird, gegen C. albicans in einem Mausmodell von OC untersucht.

Das Forschungsprotokoll für die Verwendung von Mäusen wurde von der Ethikkommission für Tierverwendungen (Fallnummern 05/2008 und 09/2020) an der School of Dentistry, Araraquara, UNESP, genehmigt. C. albicans (ATCC 90028) wurde als Referenzstamm verwendet. Für die vorliegende Studie wurden sechs Wochen alte weibliche Schweizer Mäuse (n = 45) mit einem Bodymass-Bereich von 20-30 g verwendet. Die Tiere wurden von der São Paulo State University, UNESP, Botucatu, zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der PS und Auswahl der Lichtquelle für die aPDT

1. Bereiten Sie das PS gemäß den Spezifikationen für den zu prüfenden Stoff vor.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde eine wasserlösliche Mischung von Curcuminoiden (wasserlösliche Salzmischung¹² auf CUR-Basis) als PS verwendet (siehe Materialtabelle und Abbildung 1). Verdünnungen bei 20 μM, 40 μM und 80 μM (15,6, 29,2 bzw. 58,4 mg/l) wurden unmittelbar vor der Verwendung in Reinstwasser hergestellt und bei 5 °C aufbewahrt.
2. Wählen Sie ein Lichtgerät mit einer geeigneten Wellenlänge (die gleiche wie die der PS-Absorption), die in der Lage ist, das gesamte photosensibilisierte Ziel gleichmäßig und gleichzeitig zu beleuchten, ohne das Gewebe zu erhitzen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Handstück mit einer Leuchtdiode (LED, siehe Materialtabelle) verwendet, das am Instituto de Física de São Carlos (Universität von São Paulo, São Carlos, SP, Brasilien) entwickelt wurde. Die Ausgangsleistung des Lichts betrug 89,2 mW/^cm2 bei einer blauen Wellenlänge von ca. 455 nm.

2. Vorbereitung des C. albicans-Inokulums

1. Bewahren Sie den Referenzstamm C. albicans (ATCC 90028) bis zur Verwendung in Hefe-Pepton-Glukose (YEPD, siehe Materialtabelle) mit 50% Glycerin bei -80 °C auf.
2. Tauen Sie den gefrorenen Stamm bei Raumtemperatur auf, verteilen Sie ein 100-μl-Aliquot auf einer Petrischale mit Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) mit Chloramphenicol (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie ihn 48 h lang bei 37 °C.
3. Fünf Kolonien in 10 ml Hefestickstoffbrühe mit 2% Glukose (YNBg) Medium überführen und 16 h lang aerob bei 37 °C wachsen.
4. Die Hefekultur wird in frischem YNBg (1:10) verdünnt und aerob bei 37 °C inkubiert, bis die optische Dichte die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht.
   HINWEIS: Standardisieren Sie zuvor die mikrobielle Wachstumskurve für jedes Labor. In der aktuellen Forschung durften die Kulturen etwa 8 Stunden lang inkubieren, bis sie die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichten, die durch die optische Dichte bei 540 nm (OD₅₄₀) mit einem Mittelwert von 0,536 ± 0,062 beliebigen Einheiten (Mittelwert ± Standardabweichung [SD]) angezeigt wird.
5. Zentrifugieren Sie die Kultur 5 Minuten lang bei 5.000 x g bei Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit dem gleichen Volumen steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Verwenden Sie 100-μl-Aliquote für vier serielle 10-fache Verdünnungen in PBS, verteilen Sie Verdünnungen auf SDA-Platten und inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 37 °C für die Koloniezählung. Standardmäßig werden Pilzsuspensionen in Konzentrationen von ca. 4,5 × 10⁷ koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) verwendet.

3. Induktion von OC bei Mäusen

HINWEIS: Die folgende Methodik wurde zuvor von Takakura et ^al.13 beschrieben und von unserer Gruppe^10,14 mit einigen Modifikationen reproduziert.

1. Verteilen Sie Mäuse nach dem Zufallsprinzip in neun Gruppen (n = 5), was der gleichen Anzahl von Behandlungen entspricht (Ergänzungsdatei 1).
   HINWEIS: Die Mundhöhle von Mäusen sollte negativ für das Candida-Wachstum sein. Dies muss durch Abstrich der Mundhöhle und Plattieren der Probe auf SDA überprüft werden.
2. Halten Sie die Tiere in Propylenboxen¹⁰ (max. 5 Mäuse pro Box) mit Holzspänen als Bodenbelag in einem temperaturkontrollierten Vivarium bei 23 ± 2 °C in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12/12 h. Es muss keine spezielle Anreicherung bereitgestellt werden.
3. Halten Sie Mäuse mit extrudierter Mausdiät und gefiltertem Wasser ad libitum.
4. Das Immunsuppressivum Prednisolon (100 mg/kg Körpergewicht, siehe Materialtabelle) wird am ersten Tag zum ersten Mal subkutan an alle Mitglieder der Gruppen C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L-40, C+L-80, C-L+ und C-L- injiziert (Zusatzdatei 1).
   HINWEIS: Halten Sie Mäuse aus derselben Gruppe in derselben Box und überwachen Sie sie täglich auf Anzeichen von Stress und Gewichtsverlust. Suchen Sie tierärztlichen Rat für schmerzstillende oder veränderte Lebensmittel/Wasser, wenn Stress oder Gewichtsverlust festgestellt werden.
5. Ab dem ersten Tag und bis zum Ende des Experiments Tetracyclinhydrochlorid in einer Menge von 0,83 mg/ml¹³ im Trinkwasser bereitstellen.
6. Inokulieren Sie die Zungen von Mäusen am zweiten Tag, einschließlich der Gruppen C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L-20, C+L-40, C+L-80, C-L+ und C-L- (Zusatzdatei 1), mit dem C. albicans-Inokulum . Impfen Sie diese Mäuse aus der negativen Kontrollgruppe (NCtrl) nicht.
   1. Tiere durch intramuskuläre Injektion von 10 mg/kg Chlorpromazinchlorid (siehe Materialtabelle) auf jeden Oberschenkelmuskel vor der Inokulation sedieren.
   2. Führen Sie eine intraorale Inokulation der Mäuse durch, indem Sie einen sterilen Tupfer (einen pro Tier) in eine frisch zubereitete (d. h. unmittelbar vor der Inokulation zubereitete) standardisierte Suspension von C. albicans einweichen.
   3. Legen Sie sedierte Mäuse in Rückenlage. Ziehen Sie ihre Zunge vorsichtig mit einer sterilen Pinzette aus dem Mund. Reiben Sie die Zunge jeder Maus 30 s lang mit einem eingeweichten Tupfer ein. Überwachen Sie Mäuse, bis sie sich von der Sedierung erholt haben.
7. Verabreichen Sie am fünften Tag eine ergänzende subkutane Injektion von Prednisolon (100 mg/kg Körpergewicht), um die Immunsuppression aufrechtzuerhalten.
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist ausreichend, um die Infektion nach der intraoralen Impfung 7 Tage lang aufzubewahren. Die Zeitachse des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt.

4. Antimikrobielle photodynamische Therapie und Genesung von C. albicans von oralen Läsionen

1. Am siebten Tag vor der Behandlung werden die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg Körpergewicht) in Kombination mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) betäubt (siehe Materialtabelle).
2. Jedes Tier wird in Rückenlage auf eine Polstervorrichtung^14,15 gelegt^, die mit Edelstahldrähten ausgestattet ist, die um die Schneidezähne geschlungen werden können, um das Maul offen zu halten.
   HINWEIS: Isotherme Pads werden empfohlen, um die Mäuse während der Sedierung zu erwärmen, eine Unterkühlung bei Raumtemperatur zu verhindern und eine Mortalität im Zusammenhang mit der Anästhesie^{zu vermeiden 15}. Jedes betäubte Tier sollte durch das Fehlen eines Entzugsreflexes überwacht werden, wenn die Zehen eingeklemmt werden, um die Anästhesietiefe zu bestätigen. Eine Erhaltungsdosis Ketamin zu 1/3 der ursprünglichen Dosis (ohne Xylazin) kann bei Bedarf verabreicht werden.
3. Legen Sie die Zunge bei eingezogenem Unterkiefer und Wangen vorsichtig aus dem Mund.
4. Bei Mäusen aus C+L+-Gruppen pipettieren Sie 70 μl des PS auf den Zungenrücken (in einer der getesteten Konzentrationen). Halten Sie die Mäuse für eine Dauer von 20 Minuten als Vorbestrahlungszeit in einer dunklen Umgebung. Stellen Sie sicher, dass die Zunge jedes Tieres während dieser Zeit in der Mundhöhle positioniert bleibt, um zu verhindern, dass der Photosensibilisator (PS) verschluckt wird.
5. Ziehen Sie nach der Photosensibilisierungsphase die Zunge zur Beleuchtung aus dem Mund. Setzen Sie das LED-Gerät auf den Zungenrücken und leuchten Sie mit 37,5 J/cm² (7 min mit dem vorliegenden Gerät) (Abbildung 3).
6. Bei Tieren aus den C+L-Gruppen pipettieren Sie 70 μl des PS in einer der getesteten Konzentrationen auf dem Zungenrücken und lassen Sie diese Mäuse 27 Minuten lang im Dunkeln.
7. Bei Tieren aus der C-L+-Gruppe (mit Licht behandelt, ohne vorherige Photosensibilisierung) 70 μl sterile Kochsalzlösung auf den Zungenrücken pipettieren. Lassen Sie die Mäuse 20 Minuten lang im Dunkeln und beleuchten Sie dann ihre Zunge mit 37,5 J/cm² (7 Minuten mit dem vorliegenden Gerät).
8. Bei Mäusen aus der C-L-Gruppe (weder mit PS noch mit Licht behandelt) 70 μl sterile Kochsalzlösung auf den Zungenrücken pipettieren und 27 min im Dunkeln halten.
9. C. albicans sofort nach der Behandlung aus der Zunge aller Mäuse gewinnen. Tupfen Sie den Zungenrücken 1 Minute lang mit einem sterilen Wattestäbchen ab.
10. Legen Sie jeden Probentupfer in ein Röhrchen mit 1 ml steriler Kochsalzlösung und wirbeln Sie ihn 1 Minute lang auf, um die mikrobiellen Zellen zu resuspendieren.
11. Führen Sie sofort 10-fache serielle Verdünnungen in PBS durch und plattieren Sie 25-μl-Aliquots in doppelter Ausführung über SDA-Platten. Die Platten werden 48 h lang aerob bei 37 °C inkubiert.
12. Verwenden Sie nach 48 Stunden einen digitalen Koloniezähler (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der Hefekolonien zu bestimmen. Berechnen Sie die C. albicans-Belastung (KBE/ml) für jedes Tier.
13. Transformieren Sie KBE/ml-Werte in log₁₀ und analysieren Sie sie ordnungsgemäß gemäß dem Design des Experiments und den Datenannahmen.
    HINWEIS: In der vorliegenden Untersuchung wurde Welchs Einweg-ANOVA und der Games-Howell-Post-hoc-Test (α = 0,05)¹⁶ verwendet.

5. Histopathologische Analysen

1. Am achten Tag werden Mäuse mit Ketamin in einer Dosis von 100 mg/kg in Kombination mit Xylazin in einer Dosis von 10 mg/kg durch intraperitonielle Injektion betäubt und mit einer Überdosis Ketamin (200 mg/kg intraperiotonisch verabreicht) eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod, indem Sie auf das Fehlen von Atembewegungen (Apnoe) und das Fehlen von Herzschlag (Asystolie) prüfen.
2. Kneifen Sie die Zunge vorsichtig zusammen und ziehen Sie sie aus dem Maul des Tieres. Machen Sie mit einem manuellen Skalpell einen Schnitt vor den zirkumvallaten Papillen, um die gesamte Zunge chirurgisch zu entfernen, ohne Verletzungen im vorderen und mittleren Bereich zu verursachen.
3. Fixieren Sie die Zunge 24 h lang in 10% gepuffertem Formalin (pH 7,2-7,4) und waschen Sie sie 2 h lang unter fließendem Wasser.
4. Fahren Sie mit der Aufnahme in den Paraffinprozess fort: Dehydratisierung, Klärung und Imprägnierung^10,14.
5. Schneiden Sie serielle Schnitte (5 μm dick) mit einem Mikrotom und befestigen Sie die Schnitte dann auf Objektträgern. Fahren Sie fort, diese Schnitte mit periodischer Säure-Schiff und Hämatoxylin (PAS-H) für die histopathologische Untersuchung und die Identifizierung von Pilzen durch Beobachtung unter einem Lichtmikroskop zu färben.
6. Bitten Sie einen Pathologen, vorzugsweise blind für die untersuchten Gruppen, die Gewebereaktion aufgrund einer C . albicans-Infektion zu untersuchen.
7. Beschreiben Sie die histologischen Eigenschaften des Gewebes (Epithel und Bindegewebe), insbesondere lokale Entzündungsreaktionen unterschiedlicher Intensität.

Das Mausmodell der OC zeigte typische weiße Flecken und Pseudomembranen auf der Zunge aller infizierten Mäuse (Abbildung 4A). C. albicans , die von C-L-Tieren gewonnen wurden, bestätigten eine Gewebebesiedlung durch diesen Mikroorganismus (Werte lagen zwischen 1,62 x 104 und 4,80 x 105 KBE/ml). Wie erwartet zeigten die Tiere aus der NCtr-Gruppe nach der Probenahme keine Gewebeveränderungen oder Koloniewachstum (Abbildung 4B).

aPDT verringerte die Lebensfähigkeit von C. albicans , wenn Curcuminoide bei 80 μM zur Photosensibilisierung verwendet wurden (Abbildung 5). Die mittlereLog-10-Reduktion , die mit 80 μM PS-vermittelter aPDT erreicht wurde, betrug 2,47, verglichen mit der in der C-L-Gruppe (p = 0,008).

Die Anzahl der C. albicans-Kolonien , die aus Mäusezungen gewonnen wurden, unterschied sich nicht signifikant zwischen Mäusen, die mit Curcuminoiden ohne Beleuchtung behandelt wurden (C+L-Gruppen), Mäusen, die mit Licht, aber nicht zuvor photosensibilisiert wurden (C-L+-Gruppen), und unbehandelten Mäusen (C-L-Gruppe) (p ≥ 0,210).

Die histologischen Merkmale der Zungen nicht infizierter Tiere (NCtr) zeigten normales/gesundes Gewebe, einschließlich intakter Lamina propria, Basalmembran und fadenförmiger Papillen (Abbildung 6A). Im Gegensatz dazu war bei der Untersuchung der histopathologischen Bilder der Mäusezungen aus der C-L-Gruppe offensichtlich, dass Hefen und Filamente in der keratinisierten Schicht des Epithels vorhanden waren, obwohl keine Pilze infiltriert wurden. Im darunter liegenden Bindegewebe wurde eine leichte Entzündungsreaktion beobachtet, die hauptsächlich durch mononukleäre Zellen vermittelt wurde, und fadenförmige Papillen fehlten (Abbildung 6B). Die histologische Analyse der Zungen von Mäusen sowohl in der C+L- als auch in der C-L+-Gruppe zeigte ähnliche Merkmale. Im Gegensatz dazu zeigten die Zungenschnitte von Mäusen, die mit 80 μM Curcuminoid-vermittelter aPDT behandelt wurden, eine reduzierte Anzahl von Pilzzellen, die hauptsächlich auf die keratinisierte Schicht des Epithels beschränkt waren (Abbildung 6C).

Abbildung 1: Chemische Struktur des Photosensibilisators. Die chemische Struktur des als Photosensibilisator verwendeten wasserlöslichen Salzgemisches, das zu 53,4 % aus natürlichem Curcumin und zu 46,6 % aus anderen Curcuminoiden (Demethoxycurcumin und Bis-Demethoxycurcumin) besteht. Das endgültige durchschnittliche Molekulargewicht beträgt 730,32 g/mol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Protokollzeitleiste für das Mausmodell der oralen Candidiasis und aPDT. Eine Zeitleiste, die das Protokoll für das Mausmodell der oralen Candidiasis und der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) skizziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beleuchtung von Mäusezungen nach Photosensibilisierung. Nach der Photosensibilisierung (Inkubation des infizierten Gewebes mit dem Photosensibilisator) wurden die Zungen mit einem blauen (~455 nm) LED-Licht bei 37,5 J/cm2 beleuchtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Weiße Läsionen im murinen oralen Candidiasis-Modell. (A) Repräsentative Bilder, die die weißen Läsionen darstellen, die im Mausmodell der oralen Candidiasis beobachtet wurden. (B) Negative (nicht infizierte) Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Candida albicans , die sich von den Zungen von Mäusen erholt haben. Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von log10 (KBE/ml) aus den Behandlungsgruppen dar. Welchs Einweg-ANOVA zeigte, dass die Auswirkungen der Behandlungen zwischen den Gruppen statistisch signifikant unterschiedlich waren (p < 0,001). Verschiedene Kleinbuchstaben (a, b, c) neben den Mittelwerten weisen auf statistisch signifikante Unterschiede nach dem Games-Howell-Test hin (S≤ 0,030). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Repräsentative Bilder histologischer Schnitte von Mäusezungen. Histologische Schnitte von Mäusezungen wurden mit PAS-H gefärbt und die Bilder wurden bei 200x aufgenommen. (A) Negativkontrollmäuse ohne induzierte orale Candidiasis, Photosensibilisierung und Beleuchtung (NCtr-Gruppe). (B) Mäuse mit induzierter oraler Candidiasis, weder photosensibilisiert noch LED-Beleuchtung ausgesetzt (C-L-Gruppe). (C) Tiere mit induzierter oraler Candidiasis, die 80 μM Curcuminoide und 37,5 J/cm2 LED-Beleuchtung (C+L+ 80-Gruppe) ausgesetzt waren. Maßstabsleisten = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzungsdatei 1: Experimentelle Gruppen. Eine Auflistung der in der vorliegenden Studie verwendeten Versuchsgruppen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.