Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Harte Zecken (Ixodidae: Acari) sind obligat blutsaugende Ektoparasiten, die weltweit vorkommen und in der Lage sind, eine Vielzahl von Krankheitserregern zu übertragen, darunter Bakterien, Viren und Parasiten, die von großer medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung sind. Ixodid-Zecken müssen tagelang an den Wirt gebunden bleiben, um eine Blutmahlzeit zu vervollständigen, und sie haben die Fähigkeit, an der Haut zu haften, ohne erkannt zu werden, die lokale Blutgerinnung zu verhindern und eine langfristige Fütterung zu erleichtern ^1,2,3. Tierversuche haben gezeigt, dass nicht-permissive Wirte bei wiederholter Zeckenexposition eine Resistenz gegen Zeckenstiche entwickeln, was zu einer verminderten Fähigkeit zur Übertragung eines Krankheitserregers führen kann, während Zecken freizügige Wirte wiederholt parasitieren können. Die erworbene Zeckenresistenz hängt von der Art der Immunantwort des Wirts^ab 4,5,6,7.

Durch Zecken übertragene Krankheiten stellen in den Vereinigten Staaten (USA) eine zunehmende Bedrohung dar, wobei sich die Zahl der gemeldeten Fälle zwischen 2004 und 2016 mehr als verdoppelt^{hat 8,9}. Aufgrund des Klimawandels erweitern sich die geografischen Verbreitungsgebiete der verschiedenen Zecken weiter^10,11. Zu den führenden durch Zecken übertragenen Krankheiten in den USA gehören Lyme-Borreliose, Anaplasmose, Ehrlichiose, Fleckfieber-Rickettsiose, Babesiose, Tularämie und die Powassan-Viruskrankheit⁸. Die Lyme-Borreliose, die durch eine Infektion mit Borrelia burgdorferi sensu lato verursacht wird, ist die häufigste durch Zecken übertragene Krankheit in den USA und Europa¹². Mit etwa 476.000 Menschen, bei denen jährlich in den USA Lyme-Borreliose diagnostiziert wird, stellt dies sowohl eine Belastung für die öffentliche Gesundheit als auch für die Wirtschaft für den Einzelnen und die Gesellschaft dar 13,14,15.

Ixodes scapularis (die schwarzbeinige oder Hirschzecke) ist der primäre Vektor für Lyme-Borreliose sowie für Anaplasmose, Babesiose, Borrelia miyamotoi-Krankheit und Powassan-Viruskrankheit in den USA. Weitere medizinisch wichtige Zeckenarten in den USA sind Amblyomma americanum (einsame Sternzecke), Dermacentor variabilis (amerikanische Hundezecke), Ixodes pacificus (Westliche schwarzbeinige Zecke), Dermacentor andersoni (Rocky-Mountain-Holzzecke), Ixodes cookei (Murmeltierzecke), Dermacentor occidentalis (Zecke von der Pazifikküste), Rhipicephalus sanguineus (braune Hundezecke) und Amblyomma maculatum (Zecke von der Golfküste)¹⁶.

Die Entwicklung einer Methode, um freiwillige Forscher Zeckenstichen auszusetzen, unterstützt Studien, die den natürlichen Vektor verwenden, um nach Anzeichen einer Infektion zu suchen, ein Verfahren, das als Xenodiagnose bekannt ist 17,18,19,20,21, und um mehr über die durch die Exposition gegenüber Zecken induzierte Immunität zu erfahren, was zur Entdeckung eines Anti-Zecken-Impfstoffs beitragen kann ^5,6,7. Das hier beschriebene Verfahren wurde in der ersten Forschungsstudie am Menschen mit im Labor gezüchteten Ixodes scapularis-Larven zur Xenodiagnostik einer B. burgdorferi-Infektion nach Antibiotikatherapie (NCT01143558) entwickelt und eingesetzt, die 2014^{veröffentlicht wurde 19}. Das System wurde erfolgreich in einer Phase-2-Studie eingesetzt, in der untersucht wurde, ob eine positive Xenodiagnose mit dem Fortbestehen der Symptome nach einer antibiotischen Behandlung der Lyme-Borreliose korreliert (NCT02446626) und in einer Studie zur Untersuchung der Reaktion des Wirts auf Zeckenstiche (NCT05036707).

Dieses Verfahrensprotokoll beschreibt den Prozess zur Erstellung des Containment-Verbandes, das Zeckenplatzierungsverfahren und das Zeckenentfernungsverfahren sowie die Pflege der Stelle, die zur Aufrechterhaltung des Containment-Verbandes erforderlich ist. Die Einzelheiten zu der erregerfreien Zeckenkolonie I. scapularis und den Zeckenexpositionsverfahren, die für die oben zitierten Studien verwendet wurden, wurden bereits beschrieben^19,22. Diese Methodik bietet ein flexibles Forschungsinstrument, das angepasst werden kann, um verschiedene Aspekte der Reaktion des menschlichen Wirts auf Zeckenstiche, die Wirksamkeit von Medikamenten zur Zeckenprävention sowie die Lyme-Borreliose und andere durch Zecken übertragene Krankheiten zu untersuchen.

Die Exposition von Freiwilligen gegenüber Zeckenstichen ist eine experimentelle Methode und muss im Rahmen eines klinischen Forschungsprotokolls durchgeführt werden, das von den zuständigen Zulassungsbehörden genehmigt wurde. Die klinischen Studien (NCT01143558, NCT02446626 und NCT05036707) wurden von den jeweiligen institutionellen Prüfgremien genehmigt, unter Ausnahmegenehmigungen für Prüfprodukte durchgeführt, die von der US-amerikanischen Food and Drug Administration erteilt wurden, und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Guten Klinischen Praxis durchgeführt. Zusätzlich wurden diese Studien bei ClinicalTrials.gov registriert, und es wurde eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Teilnehmern eingeholt.

1. Vorbereitung des Containment-Verbandes

1. Um eine Messvorlage zu erstellen, fotokopieren Sie den 3" x 3" großen Hydrokolloid-Containment-Verband entlang der Seite der Messlinien (Abbildung 1A und Materialtabelle).
2. Schneiden Sie die fotokopierte Vorlage entlang der 1-Zoll-Linie aus. Schneiden Sie dann entlang der 2-Zoll-Linie und erstellen Sie einen 2-Zoll-Kreis mit einem 1-Zoll-Mittelpunkt (Abbildung 1B).
3. Schneiden Sie mit dieser Schablone den nicht klebenden Schaumstoffverband so aus, dass ein 2-Zoll-Kreis mit einem 1-Zoll-Mittelpunkt entsteht (Abbildung 2A, B und Materialtabelle).
4. Schneiden Sie mit der gleichen Schablone einen 2-Zoll-Kreis in die Mitte des 4" x 4" extradünnen Hydrokolloidverbands (Abbildung 2C,D).
5. Schneiden Sie die Hydrokolloidschicht des 3" x 3" Containment-Verbandes an der 11/2"-Linie ab.
6. Ziehen Sie die Papierauskleidung der Hydrokolloidschicht des Containment-Verbandes zurück, um den Klebstoff freizulegen. Platzieren Sie den geschnittenen Schaumverband innerhalb des 2-Zoll-Kreises des Klebstoffs (Abbildung 3A). Dadurch wird sichergestellt, dass der Schaumverband über die Öffnung des Containment-Verbandes hinausragt. Setzen Sie den Liner wieder auf die Hydrokolloidschicht des Verbandes (Abbildung 3B).
   HINWEIS: Diese Messungen wurden für Studien mit bis zu 10 Larven I . scapularis-Zecken verwendet. Für Studien mit bis zu 30 Larven von I. scapularis-Zecken wurde die Schablone für die Schaummitte zwischen den 1"- und 11/2"-Markierungen geschnitten, um eine größere Fläche für die Platzierung zu ermöglichen. Die Maße des Containment-Verbandes können entsprechend dem Studiendesign angepasst werden.

2. Platzierung der Häkchen

1. Aufbewahrung von Zecken
   1. Lagern Sie die Larven der I . scapularis-Zecken in einem medizinischen Kühlschrank mit einer Temperatur von 9-10 °C.
   2. Bewahren Sie die Zecken in einem Fläschchen auf, das mit einer Netzkappe bedeckt ist, um eine ausreichende Luftzirkulation zu ermöglichen. Verpacken Sie das Fläschchen mit den Zecken in einer verschließbaren Plastiktüte mit einem leicht angefeuchteten Schwamm, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten und ein Austrocknen zu verhindern.
2. Platzieren der Häkchen
   1. Nehmen Sie die Zecken aus dem Kühlschrank, damit sie sich auf Raumtemperatur erwärmen können. Die Zecken können außerhalb des Kühlschranks in nur 15 Minuten aktiv werden.
   2. Positionieren Sie ein weißes Blatt um den Platzierungsbereich, um versehentlich abgelegte Häkchen leicht zu visualisieren.
   3. Befeuchten Sie ein 4 x 4 Zoll großes Mullkissen mit sauberem Wasser oder Kochsalzlösung und reinigen Sie damit die Haut der Platzierungsstelle. Die Stelle sollte trocken getupft oder an der Luft trocknen gelassen werden.
      HINWEIS: Berücksichtigen Sie bei der Auswahl der Körperstelle für die Platzierung der Zecke Bereiche, die die täglichen Aktivitäten des Freiwilligen nicht einschränken und in denen die Unversehrtheit des Verbandes vom Teilnehmer leicht überwacht werden kann. Platzieren Sie Zecken nicht an Stellen, an denen sie durch direkten Druck zerquetscht werden könnten (z. B. auf dem Rücken). Beurteilen Sie die Körperbehaarung des Teilnehmers und schneiden Sie gegebenenfalls überschüssige Körperbehaarung vorsichtig mit einer Schere an der Stelle des Klebstoffs ab, um Schäden an der Haut zu vermeiden. Vermeiden Sie die Verwendung eines Rasierers zur Haarentfernung, da dies das Risiko von Hautverletzungen und Infektionen erhöhen kann.
   4. Sobald die Haut trocken ist, entfernen Sie die Klebefolie von der Hydrokolloidseite des vorbereiteten Verbandes und befestigen Sie sie an der Platzierungsstelle fest auf der Haut, wobei Sie darauf achten, dass die Netzschicht offen bleibt.
   5. Brechen Sie den Holztupfer (siehe Materialtabelle) in zwei Hälften, um gezackte Enden freizulegen.
   6. Öffnen Sie vorsichtig die Durchstechflasche mit den Zecken.
   7. Übertragen Sie mit dem gezackten Ende des Holztupfers aktive Zecken aus dem Fläschchen und legen Sie sie auf die Haut innerhalb des Containment-Verbandes (Abbildung 4A). Lassen Sie ein zusätzliches Teammitglied die Zeckenplatzierungsstelle überwachen, um sicherzustellen, dass die Zecken im Containment-Verband bleiben. Verwenden Sie Klebeband, um Zecken einzufangen, die während dieses Vorgangs aus dem Fläschchen entweichen.
      HINWEIS: Das Brechen eines Holztupfers und die Verwendung des gezackten Endes ist wirksam für die Manipulation und Übertragung von Zecken, ohne die Zecken zu beschädigen. Eine kleine Bürste mit weichen Borsten in einer hellen Farbe eignet sich auch zum Übertragen von Zecken aus dem Behälter auf die Hautstelle.
   8. Sobald die angegebene Anzahl von Zecken für die Studie platziert ist, entfernen Sie die Klebefolie von der Netzschicht des Containment-Verbandes und schließen Sie sie über der Öffnung.
   9. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass der Klebstoff sicher befestigt ist, tragen Sie den vorbereiteten 4" x 4" extradünnen Hydrokolloidverband über den Containment-Verband auf, um zusätzliche Sicherheit zu gewährleisten (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Weitere Informationen zur erregerfreien Zeckenkolonie I. scapularis und zur Dauer der in den zitierten Studien angewandten Zeckenexpositionsverfahren finden Sie in den Methodenabschnitten der veröffentlichten Studien^19,22.

3. Pflege der Website

1. Stellen Sie dem Forschungsteilnehmer eine Wasserbarriereabdeckung und ein hypoallergenes 2-Zoll-Klebeband (siehe Materialtabelle) zur Verfügung.
2. Geben Sie Anweisungen zur Pflege der Zeckeneindämmungsstelle.
   1. Überprüfen Sie regelmäßig den Verband und überwachen Sie die Ränder auf eine sichere Haftung auf der Haut. Bringen Sie bei Bedarf zusätzliches Klebeband an, um die Abrichtkanten zu verstärken.
   2. Kratzen Sie nicht an der Verbandstelle und unterlassen Sie es, den Verband während des Studienzeitraums zu öffnen oder zu entfernen.
   3. Vermeiden Sie es, zu baden oder in Wasser einzuweichen. Vermeiden Sie außerdem heiße Duschen und begrenzen Sie die Dauer des Duschens. Schützen Sie vor dem Duschen den Containment-Verband mit der mitgelieferten Wassersperrabdeckung und entfernen Sie diese nach Beendigung der Dusche. Tupfen Sie den Verband vorsichtig trocken und inspizieren Sie ihn, um sicherzustellen, dass er fest sitzt.
   4. Vermeiden Sie Aktivitäten, die zu starkem Schwitzen führen und die Unversehrtheit des Verbandes beeinträchtigen können (z. B. Aerobic-Übungen, ausgedehnte Wanderungen).

4. Zeckenentfernung

1. Vorbereitung der Sammelfläschchen
   1. Beschriften Sie die Zeckensammelfläschchen mit den gewünschten Identifikatoren (z. B. Studiencode, Datum).
   2. Wenn die Konservierung lebender Zecken erforderlich ist, stechen Sie mit einer 20-G-Nadel Löcher in die Kappe der Durchstechflaschen. Verwenden Sie eine Schicht Nylon- oder Polyesternetz zusammen mit der Kappe, um das Fläschchen abzudichten. Legen Sie ein kleines Stück feuchten Schwamm in einen verschließbaren Beutel mit dem Fläschchen mit Zecken, um die Feuchtigkeit zu erhalten.
2. Entfernen der Zecken
   1. Legen Sie weiße Tücher um die Verbandsstelle und stellen Sie sicher, dass ein Auffangbecken in Reichweite ist.
   2. Entfernen Sie mit Alkoholtupfern vorsichtig den Verband von der Haut.
   3. Legen Sie den Verband nach dem vollständigen Entfernen in das Auffangbecken und untersuchen Sie ihn auf abgelöste Zecken.
   4. Beurteilen Sie die Platzierungsstelle auf angehängte Zecken. Zecken, die sich bis zur Sättigung gefressen haben, lösen sich ab (Abbildung 5A). Verwenden Sie für die verbleibenden anhaftenden Zecken eine Pinzette mit feiner Spitze zum Entfernen (Abbildung 5B).
   5. Reinigen Sie die Haut mit Alkoholtüchern oder Wasser und Seife.

Die Studie zeigte, dass das Verfahren sicher und gut verträglich ist, wobei das primäre unerwünschte Ereignis ein leichter Juckreiz an der Stelle der Bisse ist, der bei 58 % der Eingriffe beobachtet wird. Es gab keine schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse im Zusammenhang mit dem Verfahren bei der Verwendung von sauberen, im Labor gezüchteten Larven I. scapularis Zecken19. In den 43 durchgeführten Verfahren betrug der mittlere Prozentsatz der Wiederfindung von anhaftenden Zecken im Vergleich zu platzierten Zecken 45 % ± 27 % (SD), mit einem medianen Prozentsatz von 40 % (Abbildung 6).

Die genaue Dauer, bis sich Larven I. scapularis-Zecken an den Menschen anheften, bleibt unklar, da die Zeit von der Platzierung der Zecke bis zum Anheften der Zecke nicht routinemäßig beobachtet wurde. In einem Fall, in dem ein Freiwilliger 21/2 Stunden lang beobachtet wurde, hatte sich am Ende des Zeitraums keine der Zecken festgesetzt. Es dauert 4 bis 5 Tage von der Platzierung der Larven I. scapularis-Zecken , um bis zur Sättigung zu fressen19.

Abbildung 1: Messungen des Containment-Verbandes. (A) Eine Fotokopie des Containment-Verbandes. (B) Die Messvorlage für den Containment-Verband, die durch Schneiden der Fotokopie an den gewünschten Markierungen erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Herstellung von nichtadhäsiven und hydrokolloidartigen Verstärkungsverbänden. (A) Verwendung der Messschablone für den Containment-Verband zum Schneiden des Schaumverbandes. (B) Ein 2-Zoll-Kreis mit einem 1-Zoll-Schaumstoffverband in der Mitte. (C) Verwendung der Messschablone für den Containment-Verband, um den Hydrokolloid-Verband zu schneiden. (D) Ein 4" x 4" Hydrokolloidverband mit einem 2" Zentrum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Containment-Verband. (A) Der Schaumverband auf der Klebeseite der Hydrokolloidschicht des Containment-Verbandes. (B) Containment-Verband, der für die Zeckenfütterung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Platzierung der Zecken. (A) Übertragung der Zecken auf den freiwilligen Forschungsfreiwilligen. (B) Sicherung des Containment-Verbandes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Sammlung von Zecken. (A) Abgelöste Zecken. (B) Entfernung von anhaftenden Zecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Wiederfindung von geschwollenen Ixodes scapularis-Larven . Jeder Punkt stellt den Prozentsatz der geschwollenen I . scapularis-Larven dar, die nach dem beschriebenen Protokoll geborgen wurden. Der durchschnittliche Prozentsatz der wiedergefundenen Zecken lag bei 45 ± 27 (SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dr. Adriana Marques hat ein Patent US 8,926,989 B2; und ist unbezahlter wissenschaftlicher Berater der Global Lyme Alliance und der American Lyme Disease Foundation. Siu Ping Turk und Aleah Eschman haben keine Verbindung, die einen Interessenkonflikt darstellen könnte. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.