Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.
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Methodenartikel
Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neutrophile sind Zellen der myeloischen Linie, die einen entscheidenden Teil des angeborenen Immunsystems bilden. Das letzte Jahrzehnt hat zusätzliche Schlüsselrollen aufgezeigt, die Neutrophile bei der Pathogenese von Krebs, Autoimmunerkrankungen und verschiedenen akuten und chronischen Entzündungszuständen spielen, indem sie durch mehrere Mechanismen zur Initiierung und Aufrechterhaltung von Immundysregulation beitragen, einschließlich der Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile, die für die antimikrobielle Abwehr entscheidend sind. Einschränkungen bei den Techniken zur unvoreingenommenen, reproduzierbaren und effizienten Quantifizierung der NET-Bildung haben unsere Fähigkeit eingeschränkt, die Rolle von Neutrophilen bei Gesundheit und Krankheiten besser zu verstehen. Wir beschreiben eine automatisierte Echtzeit-Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung von Neutrophilen, die sich in der NET-Bildung befinden, unter Verwendung einer Lebendzell-Bildgebungsplattform in Verbindung mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz unter Verwendung von zwei verschiedenen DNA-Farbstoffen zur Abbildung intrazellulärer und extrazellulärer DNA. Diese Methodik ist in der Lage, die Physiologie von Neutrophilen zu bewerten und Moleküle zu testen, die auf die NET-Bildung abzielen können.
Einleitung
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind netzartige Chromatinstrukturen, die als Reaktion auf verschiedene Entzündungsreize aus Neutrophilen extrudiert werden. NETs bestehen aus DNA, Histonen und verschiedenen antimikrobiellen Proteinen/Peptiden, die infektiöse Krankheitserreger einfangen und abtöten und Entzündungsreaktionen hervorrufen1.
Während NETs für die Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger von Vorteil sind, haben sie als potenzieller Treiber verschiedener Autoimmunerkrankungen2, Thrombosen3, Stoffwechselerkrankungen4 und metastasierend....
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Protokoll
Neutrophile von gesunden Probanden wurden nach Einverständniserklärung gemäß dem vom National Institutes of Health (IRB) genehmigten Protokoll des National Institutes of Health (NIH) erhalten. Das Protokoll folgt den Richtlinien der NIH-Ethikkommission für die Humanforschung.
1. Färbung der Neutrophilen und Vorbereitung der Assay-Platte
- Entnehmen Sie peripheres Blut mit entsprechender schriftlicher Einverständniserklärung gemäß den Richtlinien des jeweiligen Instituts und isolieren Sie Neutrophile mit einer beliebigen Methode. Beispielsweise ist die Ficoll-Dextran-Methode 10,11
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Ergebnisse
Diese Methode liefert Phasenkontrast-, rot fluoreszierende (membrandurchlässiger Farbstoff) und grün fluoreszierende (membranundurchlässiger Farbstoff) Bilder, die zu jedem Zeitpunkt aufgenommen wurden. Zusammen mit dem NET-Entstehungsprozess werden morphologische Veränderungen in Phasenkontrast- und Rotfluoreszenzbildern beobachtet, und sobald die Membran durchbrochen wird, kann eine grüne Fluoreszenz beobachtet werden (Abbildung 1). In diesem Assay sind NET-bildende Neutrophile im Allgemei.......
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Diskussion
Aktuelle Methoden zur Quantifizierung von NETs ex vivo haben mehrere Nachteile, die unsere Fähigkeit einschränken, Neutrophile, NETs und potenzielle therapeutische Ziele unvoreingenommen und mit hohem Durchsatz zu untersuchen10,14. Beispielsweise ist die direkte Zählung von NET-bildenden Zellen nach der Immunfluoreszenzfärbung, die als Goldstandard für die Quantifizierung von NETs gilt, mit geringem Durchsatz verbunden und hängt von der subjektiven Sicht.......
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Offenlegungen
Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken der Abteilung für Lichtbildgebung im Büro für Wissenschaft und Technologie des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health. Diese Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health (ZIA AR041199) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AKT-Inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Klare 96-Well-Platte | Corning | 3596 | |
| Lebendzellanalysesystem | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membranundurchlässiger grüner DNA-Farbstoff | Thermo Fisher | Scientific S7020 | |
| Nuklearroter Farbstoff | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophilen-Pellet wird nach dem Färben bläulich. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenolrot mit RPMI kann verwendet werden. |
Referenzen
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288....
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Nachdrucke und Genehmigungen
