Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind netzartige Chromatinstrukturen, die als Reaktion auf verschiedene Entzündungsreize aus Neutrophilen extrudiert werden. NETs bestehen aus DNA, Histonen und verschiedenen antimikrobiellen Proteinen/Peptiden, die infektiöse Krankheitserreger einfangen und abtöten und Entzündungsreaktionen hervorrufen¹.

Während NETs für die Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger von Vorteil sind, haben sie als potenzieller Treiber verschiedener Autoimmunerkrankungen², Thrombosen³, Stoffwechselerkrankungen⁴ und metastasierendem Wachstum von Krebs⁵ Aufmerksamkeit erregt. Daher ist die Hemmung der NET-Bildung eine potenzielle therapeutische Option für diese Erkrankungen. Trotz einiger vielversprechender NETs-Targeting-Moleküle in der Entwicklung⁶ gibt es jedoch noch keine zugelassene Therapie, die diesen Mechanismus spezifisch beeinflusst. Dies ist zumindest teilweise auf den Mangel an objektiven, unvoreingenommenen, reproduzierbaren und Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethoden für die NET-Bildung zurückzuführen.

Wir haben eine neue Methode unter Verwendung einer zweifarbigen Lebendzell-Bildgebungsplattform etabliert und berichtet ^7,8. Zeitrafferbilder von Neutrophilen, die mit membrandurchlässigem Kernfarbstoff und membranundurchlässigem DNA-Farbstoff gefärbt wurden, werden von der Software analysiert, und die Anzahl der prä- und post-NET-bildenden Neutrophilen wird zu mehreren Zeitpunkten gezählt. Da die Integrität der Plasmamembran während der NET-Bildung durch die Regulation von PKCα-vermitteltem Lamin B und CDK4/6-vermittelter Lamin A/C-Zerlegung⁹ verloren geht, werden NET-bildende Neutrophile mit membranundurchlässigem DNA-Farbstoff gefärbt, gesunde Neutrophile jedoch nicht. Diese Methode überwindet die Probleme zuvor berichteter Techniken zur Quantifizierung der NET-Bildung und bietet eine unvoreingenommene, reproduzierbare und genaue NET-Quantifizierung mit hohem Durchsatz auf automatisierte Weise.

Neutrophile von gesunden Probanden wurden nach Einverständniserklärung gemäß dem vom National Institutes of Health (IRB) genehmigten Protokoll des National Institutes of Health (NIH) erhalten. Das Protokoll folgt den Richtlinien der NIH-Ethikkommission für die Humanforschung.

1. Färbung der Neutrophilen und Vorbereitung der Assay-Platte

1. Entnehmen Sie peripheres Blut mit entsprechender schriftlicher Einverständniserklärung gemäß den Richtlinien des jeweiligen Instituts und isolieren Sie Neutrophile mit einer beliebigen Methode. Beispielsweise ist die Ficoll-Dextran-Methode ^10,11 ein häufig verwendetes Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut.
   HINWEIS: Obwohl die hier besprochene Methode menschliche Neutrophile verwendet, können Maus-Neutrophile auch mit einem ähnlichen Protokoll analysiert werden.
2. Neutrophile im Roswell Park Memorial Institute (RPMI; siehe Materialtabelle) 1640 Medium bei 2,0 x 10⁶ Neutrophilen/ml resuspendieren und Neutrophilensuspension in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen geben.
   HINWEIS: Normalerweise fügen wir den Nährmedien kein fötales Rinderserum (FBS) hinzu, da Albumin in FBS die NET-Bildung^{reduzieren kann 12} und hitzestabile Nuklease in FBS NETs¹³ abbauen kann.
3. Fügen Sie membranpermeablen roten DNA-Farbstoff (siehe Materialtabelle) in 1 μl pro 1,5 ml neutrophiler Suspension hinzu.
4. Bei Raumtemperatur 5 Minuten im Dunkeln inkubieren. Bei 2500 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und Überstand entfernen.
5. Neutrophile in 1 ml RPMI resuspendieren, dann bei 2500 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und Überstand entfernen. 2x wiederholen (insgesamt 3x waschen).
6. Resuspendieren Sie Neutrophile in 1 ml RPMI und zählen Sie mit einem Zellzähler. Verdünnen Sie die Neutrophilensuspension auf 1,5 x 10⁵ Neutrophile/ml.
7. Fügen Sie 4 μl 1:100-vorverdünnten membranundurchlässigen grünen DNA-Farbstoff (siehe Materialtabelle) pro 1 ml Neutrophilensuspension hinzu.
8. Geben Sie 100 μl Neutrophilensuspension pro Well in eine klare, mit Gewebekultur behandelte 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle). Legen Sie jede Bedingung in dreifacher Ausführung fest.
   HINWEIS: Wir haben bereits⁷ gezeigt, dass es bei dieser Methode keinen Unterschied in der NET-Bildung und -Quantifizierung gibt, wenn Neutrophile in Platten mit oder ohne Poly-L-Lysin-Beschichtung platziert werden. Daher ist die Verwendung einer mit Gewebekultur behandelten Platte für diese Methode ausreichend.
9. Fügen Sie 100 μl RPMI-haltige Stimulusreagenzien mit oder ohne Inhibitor oder ein anderes Reagenz von Interesse in die entsprechenden Vertiefungen hinzu. Verwenden Sie immer positive Kontrollvertiefungen durch Zugabe von 500 nM Phorbol 12-Myristat 13-acetat (PMA) oder 2,5 μM Calciumionophor (A23187), hier wurde ein 30 μM AKT-Inhibitor verwendet.
10. Legen Sie die Platte in das Lebendzellanalysesystem (siehe Materialtabelle), das in einem 5%_{CO 2} -Inkubator untergebracht ist.
    Anmerkungen: Einige Minuten nach diesem Schritt kann Kondenswasser auf der Ober- und Unterseite der Platte auftreten. Dies kann die ordnungsgemäße Bildgebung behindern. Wischen und entfernen Sie Kondenswasser gründlich, bevor Sie mit dem Scannen beginnen. Legen Sie die Platte in das Gerät, starten Sie die Software, geben Sie das Scanprotokoll ein und wischen Sie die Platte kurz vor dem ersten Scan ab.

2. Abtastplatte zur Visualisierung von NET-bildenden Neutrophilen

1. Starten Sie die Software (siehe Materialtabelle für Softwaredetails). Starten Sie Add Vessel durch Drücken von + in der oberen linken Ecke.
2. Wählen Sie Scan on Schedule. Wählen Sie Neu aus.
   HINWEIS: Führen Sie nach der Erstellung dasselbe Scanprotokoll aus, indem Sie Vorherige kopieren und auf dem nächsten Bildschirm das gespeicherte Protokoll auswählen.
3. Wählen Sie Standard. Legen Sie die Scaneinstellungen wie folgt fest: Zellenweise Optionen: Keine; Bildkanäle: Phase, Grün (Aufnahmezeit: 200 ms), Rot (Aufnahmezeit: 400 ms); Ziel: 20x.
4. Wählen Sie die verwendete Platte aus der Liste aus. Wählen Sie die Position des Gefäßes, an dem die Platte auf das Tablett des Lebendzell-Bildgebungssystems gelegt werden soll.
5. Wählen Sie Wells aus, in denen Proben vorhanden sind, und entscheiden Sie, wie viele Bilder pro Well aufgenommen werden sollen. Generieren Sie basierend auf der Anzahl der Bilder pro Vertiefung eine geschätzte Scandauer für die Platte. Normalerweise sind 4 Bilder pro Well ausreichend; Dies kann jedoch je nach den Bedingungen und der Häufigkeit der Scans variieren.
6. Geben Sie die Informationen aus jedem Well (z. B. Zelltyp und Verbindung) ein, indem Sie auf Plattenkarte erstellen klicken , um einen Namen für die Studie anzugeben.
   HINWEIS: Die Plattenkarte kann im Voraus mit dem Plattenkarteneditor in der Software vorbereitet und gespeichert werden. Die gespeicherten Kennzeichenkartendaten können während dieses Schritts importiert werden. Falls gewünscht, kann die Eingabe von Kennzeichenzuordnungsinformationen übersprungen und später durchgeführt werden. Daten können auch ohne Eingabe von Informationen über das Plattenlayout abgerufen werden. Es wird jedoch empfohlen, Platteninformationen einzugeben, um die anschließende Analyse zu erleichtern.
7. Wählen Sie auf dem nächsten Bildschirm Basic Analyzer als Analysetyp und wählen Sie Analyseprotokoll aus der Dropdown-Liste, in der zuvor verwendete Analysedefinitionen (keine Scan-Protokolle) angezeigt werden. Die spektrale Entmischung für Grün und Rot kann bei 0,0 % belassen werden.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann bei Bedarf übersprungen werden.
8. Planen Sie den Scan. Für das Experiment hier scannen Sie alle 15-20 Minuten für 8 h . Legen Sie die Startzeit des Scans fest, indem Sie den weißen und grauen Balken oben auf dem Bildschirm ziehen.
   Anmerkungen: Vermeiden Sie zu häufiges Scannen, da das Gerät sonst aufgrund von Überhitzung möglicherweise nicht gut funktioniert. Die Scanzeit sollte 12 Stunden pro 24 Stunden nicht überschreiten. Möglicherweise wird eine Warnung angezeigt, wenn das Scannen zu häufig ist.
9. Überprüfen Sie die Scaneinstellung auf dem nächsten Bildschirm und klicken Sie auf Zum Zeitplan hinzufügen , um den Scanvorgang zu starten. Warten Sie, bis der erste Satz von Bildern gescannt wurde, um zu bestätigen, ob alles gut funktioniert.
   1. Manchmal sind Zellen möglicherweise nicht richtig fokussiert. Überprüfen Sie in diesem Fall, ob Kondenswasser vorhanden ist (und wischen Sie entsprechend ab), die Platte richtig auf dem Tablett platziert ist oder die Position der Platte richtig angegeben ist usw. Wenn die Zellen noch schwimmen und sich nicht auf dem Boden der Vertiefung abgesetzt haben, warten Sie etwa 5 Minuten, bevor Sie scannen.

3. Festlegen der Analysedefinition zur Quantifizierung von NETs

1. Öffnen Sie die zu analysierende Studie (Gefäß) auf der Registerkarte Ansicht. Drücken Sie auf der linken Seite des Bildschirms auf Analyse starten . Wählen Sie Neue Analysedefinition anlegen.
   1. Wenn zuvor eine Analyse durchgeführt wurde, verwenden Sie dieselbe Analysedefinition mit geringfügigen Änderungen, indem Sie Vorhandene Analysedefinition kopieren wählen. Fahren Sie in diesem Fall mit Schritt 3.3 fort. Wenn Sie die Analyse ohne Änderungen verwenden, wählen Sie Vorhandene Analysedefinition verwenden. Dies wird nicht empfohlen, da der Fluoreszenzgrad zwischen den Assays an verschiedenen Tagen variieren kann und in der Regel einige kleinere Korrekturen erforderlich sind.
2. Wählen Sie Basic Analyzer aus. Verwenden Sie alle Bildkanäle: Phase, Grün, Rot und Überlappung.
   HINWEIS: Obwohl wir normalerweise grüne und rote Objektmasken verwenden, um NETs zu zählen, ist die Überlappungsobjektmaske nützlich, wenn es um Schmutz geht. In solchen Fällen wird die Anzahl der überlappenden Objekte als Zähler anstelle der grünen Objektanzahl verwendet (siehe Schritt 3.9). Wenn die Anzahl der Überlappungsobjekte anstelle der Anzahl der grünen Objekte verwendet wird, müssen alle roten Signale korrekt gezählt werden. Passen Sie die Einstellung des roten Signals an, um alle roten Objekte mit schwachem rotem Signal in Bildern zu zählen, die zu späteren Zeitpunkten aufgenommen wurden, aber nicht, um Schmutz zu zählen.
3. Wählen Sie 6 - 8 repräsentative Beispielbilder für das Training aus. Fügen Sie für das Experiment hier die folgenden Bilder hinzu:
   Bilder, die zwischen 0 und 20 Minuten aufgenommen wurden, um die Einstellung des grünen Signals zu optimieren und subtile grüne Signale zu kompensieren, die in nicht-NET-bildenden Neutrophilen erzeugt werden können
   Bilder von maximalen NETs mit Positivkontrolle, aufgenommen zwischen 3-6 h (die Zeit variiert je nach verwendeter Stimulation), um die Einstellung des grünen Signals zu optimieren, um NET-bildende Neutrophile zu definieren
   Bilder, die um den 1-Stunden-Zeitpunkt aufgenommen wurden, um die Gesamtzahl der Zellen (mit rotem Farbstoff gefärbt) zu zählen, da das nukleare rote Signal um 1 Stunde am stärksten ist (wenn sich alle Zellen auf dem Boden der Vertiefung niedergelassen haben) und aufgrund des Zelltods allmählich abnimmt.
   Bilder, die Trümmer enthalten, um sie von der Zählung auszuschließen.
4. Legen Sie die Analysedefinition fest. Rote Objekte und grüne Objekte entsprechen den Kernen aller Neutrophilen bzw. derjenigen, die NETs bilden. Beginnen Sie mit dem folgenden Beispiel, und drücken Sie Vorschau aktuell oder Vorschau aller und modulieren Sie jeden Parameter, um die Ergebnisse zu optimieren:
   Für Grün: Segmentierung - Hintergrundsubtraktion: Zylinder; Radius: 100 μM; Schwellenwert: 0,3 GCU; Kantenteilung: Ein; Kantenempfindlichkeit: -20; Reinigung -Lochfüllung: 100 μm²; Größe 0 Pixel anpassen; Filter- Fläche: min 20 μm², max 500 μm²; Exzentrizität: max. 0,97; Mittlere Intensität: min 1.00
   Für Rot: Segmentierung - Hintergrundsubtraktion: Zylinder; Radius: 10 μM; Schwellenwert: 1,0 GCU; Kantenteilung: EIN; Kantenempfindlichkeit: -50; Cleanup-Lochfüllung: 50 μm²; Größe 0 Pixel anpassen; Filterfläche: min 20 μm², max 400 μm²; Mittlere Intensität: min 1,5.
   1. Wenn ein übermäßiges grünes Signal in Neutrophilen auftritt, die keine NETs bilden sollten (z. B. unstimulierte Neutrophile bei 0 min, die gelappte Kerne haben), kann dies auf einen Überlauf des roten Signals zurückzuführen sein, das im grünen Kanal detektiert wurde. Kehren Sie in diesem Fall zu Schritt 3.1 zurück, öffnen Sie Bildebenen auf der linken Seite des Bildschirms und entfernen Sie die roten Signale aus dem grünen Kanal, indem Sie die spektrale Unmischung verwenden.
   2. Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine Vertiefung für die Einzelfärbung mit nuklearrotem Farbstoff einzustellen, um zu klären, wie viel des roten Signals aus dem grünen Kanal entfernt werden soll. Auf der anderen Seite hat ein in der Regel grünes Signal, das in den roten Kanal blutet, keinen Einfluss auf die Analysen.
      HINWEIS: Es spielt keine Rolle, ob die Empfindlichkeit gegenüber roten Signalen niedrig ist und nicht alle roten Signale in den Bildern erfasst werden, die zu späteren Zeitpunkten aufgenommen werden (z. B. 6 h Zeitpunkt). Die maximale Anzahl der roten Objekte in jedem Bild wird als Gesamtzahl der Neutrophilen im Bild betrachtet und als Nenner in Schritt 3.9 verwendet. Normalerweise erreichen die roten Kernsignale um 1 Stunde ihren Höhepunkt und nehmen aufgrund des Zelltods allmählich ab (Abbildung 1B). Passen Sie daher die Einstellung des roten Signals an, um rote Objekte in den Bildern mit maximalen roten Signalen korrekt zu zählen.
5. Wählen Sie Scanzeiten und zu analysierende Wells aus. In der Regel sollten alle Zeitpunkte und Bohrungen analysiert werden. Geben Sie der Analysedefinition eine Beschriftung an.
6. Überprüfen Sie die Zusammenfassung und starten Sie die Analyse. Es dauert einige Stunden, bis die Analyse abgeschlossen ist (die Dauer hängt von der Anzahl der Zeitpunkte und Vertiefungen ab). Nach dem Start wird der Name der Analysedefinition unter dem Namen der Studie auf der Registerkarte Ansicht angezeigt, und das vollständige Datum wird angezeigt, wenn sie fertig ist.
7. Öffnen Sie anschließend die analysierte Studie, indem Sie auf den Namen der Analysedefinition doppelklicken. Öffnen Sie Ebenen auf der linken Seite des Bildschirms und prüfen Sie, ob jede Zelle richtig markiert ist. Wenn es nicht richtig markiert ist, kehren Sie zu Schritt 3.1 zurück und wiederholen Sie die folgenden Schritte.
8. Klicken Sie links auf dem Bildschirm auf Diagrammmetriken , um die Daten zu exportieren. Wählen Sie Grüne Anzahl, Rote Anzahl oder Überlappungsanzahl (pro Bild) und wählen Sie dann die zu exportierenden Zeitpunkte und Wells aus. Wählen Sie für die ausgewählte Gruppierung die Option Plate Map Replicates aus, wenn alle Wells beim Scannen korrekt angegeben sind.
9. Exportieren Sie die Daten. Berechnen Sie den Prozentsatz der NET-bildenden Zellen für jede Bedingung/jeden Zeitpunkt anhand der folgenden Gleichung mit einer geeigneten Software.
   
   HINWEIS: Der Grund, warum der Nenner die maximale Anzahl roter Objekte ist, ist, dass die Anzahl der roten Objekte bei etwa 1 Stunde ihren Höhepunkt erreicht und aufgrund des Zelltods allmählich abnimmt.

Diese Methode liefert Phasenkontrast-, rot fluoreszierende (membrandurchlässiger Farbstoff) und grün fluoreszierende (membranundurchlässiger Farbstoff) Bilder, die zu jedem Zeitpunkt aufgenommen wurden. Zusammen mit dem NET-Entstehungsprozess werden morphologische Veränderungen in Phasenkontrast- und Rotfluoreszenzbildern beobachtet, und sobald die Membran durchbrochen wird, kann eine grüne Fluoreszenz beobachtet werden (Abbildung 1). In diesem Assay sind NET-bildende Neutrophile im Allgemeinen rund, anstatt eine netzartige Struktur zu bilden. Dies liegt daran, dass die Auflösung des Geräts nicht hoch genug ist, um feine bahnartige Strukturen und membranundurchlässige grüne Farbstofffärbungen zu erfassen, bevor es freigesetzt wird, sobald die Membran durchbrochen wird. Wir haben bereits7 gezeigt, dass NETs durch konfokale Bildgebung in den 96-Well-Platten, die nach 4 h Inkubation gewonnen wurden, visualisiert werden können.

Wenn die Analysedefinition entsprechend eingestellt ist, werden alle Neutrophilen im Bild als rotes Objekt und NET-bildende Neutrophile als grünes Objekt markiert (Abbildung 2). Die Maschine zählt die Anzahl der roten und grünen Objekte zu jedem Zeitpunkt. Der Zeitverlauf der NET-Bildung wird visualisiert, indem der Prozentsatz der NET-bildenden Neutrophilen zu jedem Zeitpunkt aufgetragen wird (Abbildung 3). Potenzielle Moleküle, die auf die NET-Bildung abzielen (z. B. AKT-Inhibitor), können mit dieser Methode im Hochdurchsatz getestet werden.

Abbildung 1: Morphologische Veränderungen bei Neutrophilen, die sich in der NET-Bildung befinden. (A) Humane periphere Blutneutrophile, die 3 h lang mit 2,5 μM Calciumionophor stimuliert wurden. (B) Repräsentative Einzelzellansichten von Phasenkontrastbild, rotem Kanal (membrandurchlässiger Kernfarbstoff), grünem Kanal (membranundurchlässiger DNA-Farbstoff) und zusammengeführtem Bild. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder, die die Softwareerkennung von Neutrophilen und NETs zeigen. Neutrophile von gesunden Probanden wurden 1 h lang mit 2,5 μM Calciumionophor stimuliert. Überlagerte Bilder der Phasenkontrastbildgebung und jedes Signal oder jeder Maske werden angezeigt. Die Kerne wurden mit (A) membrandurchlässigem rotem Farbstoff gefärbt, und die Software erkannte und zählte (B) blau markierte (B) Kerne, während die NETs mit (C) membranundurchlässigem grünem Farbstoff gefärbt wurden und die Software sie als (D) violett markierte. Wenn (E) eine Übererfassung oder (F) eine Untererfassung auftritt, muss der Parameter möglicherweise geändert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zeitlicher Verlauf des Prozentsatzes der NET-bildenden Neutrophilen. Neutrophile wurden durch 25 nM Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) oder 2,5 μM Calciumionophor stimuliert, um NETs zu induzieren, oder im RPMI unstimuliert. Die Zugabe eines 30 μM AKT-Inhibitors wurde durchgeführt, um die NET-Bildung zu blockieren. Die Bilder wurden von der Software alle 20 Minuten für 6 Stunden aufgenommen. Der Prozentsatz der NET-bildenden Zellen wurde berechnet, indem die Anzahl der grünen Objekte (= die Anzahl der NET-bildenden Zellen) durch die Anzahl der roten Objekte (= die Anzahl aller Neutrophilen) geteilt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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