Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Zusammenfassung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Zusammenfassung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Krankheitsmodell, das die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose (MS) auf histopathologischer und molekularer Ebene rekapituliert. EAE wird durch Immunisierung von Versuchstieren durch subkutane Injektion von kurzen Myelinpeptiden zusammen mit spezifischen Adjuvantien induziert, um die Immunantwort zu verstärken. Wie das menschliche Gegenstück entwickeln EAE-Mäuse demyelinisierende Läsionen, die Infiltration von Immunzellen in das Zentralnervensystem (ZNS), die Aktivierung von Gliazellen und neuronale Verletzungen. Eine konsistente Evidenz unterstützt auch eine mechanistische Rolle der B-Zell-Dysfunktion in der Ätiologie von MS und EAE. B-Zellen können sowohl als Antigen-präsentierende Zellen als auch als primäre Quelle für entzündungsfördernde Zytokine und Autoantikörper dienen. Bei der EAE werden Antikörper gegen die Myelinpeptide gebildet, die zur Induktion der Krankheit eingesetzt wurden. Es wurde gezeigt, dass solche Autoantikörper entweder den Myelinverlust oder die pathogene Reaktivierung von T-Zellen im ZNS vermitteln. Dieser Artikel beschreibt ein effizientes ELISA-basiertes Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von C57BL/6J-Mäusen, die mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein 35-55 (MOG35-55)-Peptid immunisiert wurden. Die vorgeschlagene Methode dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Spezifität und das Ausmaß der aberranten humoralen Reaktion im Zusammenhang mit der autoimmunen Demyelinisierung zu untersuchen.

Einleitung

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch fokale Infiltration von Immunzellen in das Hirnparenchym, den Abbau von Myelinscheiden, die Axone umhüllen, die Gliaaktivierung und neuronalen Verlust gekennzeichnet^{ist 1}. Zusätzlich zu der gut etablierten Rolle pathogener T-Zellen haben mehrere Beweise die Beteiligung von B-Zellen an der Vermittlung der Autoimmunantwort gegen das ZNS hervorgehoben. B-Zellen durchlaufen im MS-Gehirn eine klonale Expansion, und Antikörper gegen Myelinkomponenten wurden in demyelinisierten Läsionen nachgewiesen ^2,3

Protokoll

Alle Eingriffe mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit den experimentellen Richtlinien durchgeführt, die vom East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden. In dieser Studie wurden weibliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J im Alter von 8-10 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). EAE wurde nach zuvor veröffentlichten Berichten^induziert 12,13,14.

1. Serum-Entnahme

1. Die Versuchsmaus wird durch CO_2<....

Ergebnisse

Um die Robustheit des vorliegenden ELISA-Assays zu demonstrieren, wurde die Methode an Serumproben getestet, die aus einer Kohorte von weiblichen C57BL/6J-Mäusen 20 Tage nach der Immunisierung (dpi) mit 100 μg MOG35-55-Peptid in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) nach einem validierten EAE-Induktionsprotokoll^{isoliert wurden} 12,13,14. Die Tiere erhielten außerdem an Tag 0 und 2 400 ng Pertussis-Toxin. Als Negativkontrollen dient.......

Diskussion

Hier wurde über ein einfaches und effizientes ELISA-basiertes Protokoll berichtet, um die humorale Reaktion in einem relevanten Tiermodell der MS-Pathologie genau zu quantifizieren. Diese Methode wurde kürzlich eingesetzt, um die neuartige Rolle des Ataxin-1-Proteins bei der Kontrolle der Serumspiegel von Autoantikörpern im MOG35-55/C57BL6J EAE-Paradigma¹² zu beschreiben. In diesem Zusammenhang sollten eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, um mit dieser Methode konsistente und biologisch .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Spritzen	BD Biosciences	309628
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher	05-408-129
25 G Nadeln	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat	Thermo Fisher	N301	Bei 4 & Grad lagern; C
Klebedichtungen	Thermo Fisher	AB0558
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A7906	Bei 4 > C
C57BL/6J weibliche Mäuse	Das Jackson Laboratory	000664	Tiere im Alter zwischen 8 und 10 Wochen sollten für EAE-Experimente verwendet werden
Kryo-Röhrchen	Fisher	10-500-25
Seziertablett	Fisher	S111022
Dissector-Schere	Fine Science Tools	14082-09
ELISA-Beschichtungspuffer	BioLegend	421701	Bei 4° lagern; C
Excel-Software	Microsoft		Analysis Tabellenkalkulation
Pinzette	Fine Science Tools	11152-10
Ziege Anti-Maus IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 ° C
LED-Lichtquelle	Fisher	AMPSILED21
Mikroplatten-Reader	Fisher	14-377-575
Wasser in molekularbiologischer Qualität	Corning	46-000-Cl
Maus MOG35-55 Peptid	EZBiolab	cp7203	Lagern bei -80 &Grad; C
Mehrkanalpipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes Federschere	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-Well-Platten	BioLegend	423501
Orbitalschüttler	Fisher	88-861-023
Ofen	VWR	445-0024
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Gekühlte Tischzentrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop Lösung	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531