Bildbasierte Hochdurchsatz-Phänotypisierung zur Bestimmung morphologischer und physiologischer Reaktionen auf Einzel- und Kombinationsbelastungen bei Kartoffeln

Summary

Wir haben ein bildbasiertes Phänotypisierungsprotokoll entwickelt, um die morphologischen und physiologischen Reaktionen auf einfache und kombinierte Hitze-, Trockenheits- und Staunässebehandlungen zu bestimmen. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifizierung von frühen, späten und Wiederherstellungsreaktionen auf der Ebene der gesamten Anlage, insbesondere in oberirdischen Teilen, und unterstrich die Notwendigkeit des Einsatzes mehrerer bildgebender Sensoren.

Abstract

Die bildbasierte Phänotypisierung mit hohem Durchsatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Entwicklung und Leistung von Pflanzen unter bestimmten Bedingungen im Laufe der Zeit nicht-invasiv zu bestimmen. Durch die Verwendung mehrerer bildgebender Sensoren können viele interessante Merkmale bewertet werden, darunter die pflanzliche Biomasse, die photosynthetische Effizienz, die Temperatur des Kronendachs und die Reflexionsindizes der Blätter. Pflanzen sind häufig mehreren Belastungen unter Feldbedingungen ausgesetzt, bei denen schwere Hitzewellen, Überschwemmungen und Dürreereignisse die Produktivität der Pflanzen ernsthaft bedrohen. Wenn Stress zusammenfällt, können die daraus resultierenden Auswirkungen auf Pflanzen aufgrund synergistischer oder antagonistischer Wechselwirkungen unterschiedlich sein. Um zu klären, wie Kartoffelpflanzen auf Einzel- und kombinierte Belastungen reagieren, die natürlich vorkommenden Stressszenarien ähneln, wurden einer ausgewählten Kartoffelsorte (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) zu Beginn der Tuberisierung fünf verschiedene Behandlungen auferlegt, d.h. Kontrolle, Trockenheit, Hitze, Staunässe und Kombinationen aus Hitze-, Trockenheits- und Staunässestress. Unsere Analyse zeigt, dass Staunässe die nachteiligsten Auswirkungen auf die Pflanzenleistung hatte und zu schnellen und drastischen physiologischen Reaktionen im Zusammenhang mit dem Verschluss der Stomata führte, einschließlich einer Verringerung der Quantenausbeute und -effizienz von Photosystem II und einer Erhöhung der Temperatur und des Wasserindex im Kronendach. Unter Wärme- und kombinierten Stressbehandlungen war die relative Wachstumsrate in der frühen Stressphase reduziert. Bei Trockenheit und kombiniertem Stress sanken das Pflanzenvolumen und die Photosyntheseleistung mit erhöhter Temperatur und dem Verschluss der Spaltöffnungen in der späten Stressphase. Die Kombination aus optimierter Stressbehandlung unter definierten Umweltbedingungen zusammen mit ausgewählten Phänotypisierungsprotokollen ermöglichte es, die Dynamik morphologischer und physiologischer Reaktionen auf einzelne und kombinierte Belastungen aufzudecken. Hier wird ein nützliches Werkzeug für Pflanzenforscher vorgestellt, die Pflanzenmerkmale identifizieren möchten, die auf die Widerstandsfähigkeit gegenüber verschiedenen klimawandelbedingten Belastungen hinweisen.

Introduction

Die potenziellen Auswirkungen des Klimawandels, einschließlich der Zunahme der Intensität und Häufigkeit von Hitzewellen, Überschwemmungen und Dürreereignissen, haben negative Auswirkungen auf den Anbau von Kulturpflanzen¹. Es ist wichtig, den Einfluss des Klimawandels auf die Variabilität der Kulturpflanzen und die daraus resultierenden Schwankungen in der jährlichen Pflanzenproduktion zu verstehen². Angesichts der steigenden Bevölkerung und des steigenden Nahrungsmittelbedarfs ist es eine Herausforderung, den Ertrag von Kulturpflanzen zu erhalten, weshalb es dringend erforderlich ist, klimaresistente Pflanzen für die Züchtung zu finden ^3,4. Kartoffeln (Solanum tuberosum L.) sind eine der wichtigsten Nahrungspflanzen, die aufgrund ihres hohen Nährwerts und ihrer gesteigerten Wassernutzungseffizienz zur globalen Ernährungssicherheit beiträgt. Die Verringerung des Wachstums und des Ertrags unter ungünstigen Bedingungen ist jedoch ein Hauptproblem, insbesondere bei den anfälligen^{Sorten 5,6}. In vielen Studien wurde hervorgehoben, wie wichtig es ist, alternative Ansätze zur Aufrechterhaltung der Produktivität der Kartoffelernte zu untersuchen, einschließlich landwirtschaftlicher Praktiken, der Suche nach toleranten Genotypen und des Verständnisses der Auswirkungen von Stress auf die Entwicklung und den Ertrag ^7,8,9, was auch von europäischen Kartoffelbauern (oder Landwirten) stark nachgefragt ^wird10.

Automatisierte Phänotypisierungsplattformen, einschließlich bildbasierter Phänotypisierung, ermöglichen die quantitative Analyse der Pflanzenstruktur und -funktion, die für die Auswahl relevanter Merkmale von Interesse unerlässlich sind^11,12. Die Hochdurchsatz-Phänotypisierung ist eine fortschrittliche nicht-invasive Technik, um verschiedene morphologische und physiologische Merkmale von Interesse reproduzierbar und schnell zu bestimmen ¹³. Obwohl der Phänotyp genotypische Unterschiede in Bezug auf Umwelteinflüsse widerspiegelt, ermöglicht der Vergleich von Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen mit Stress die Verknüpfung der umfangreichen Phänotypisierungsinformationen mit einem spezifischen (Stress-)Zustand¹⁴. Die bildbasierte Phänotypisierung ist für die Beschreibung phänotypischer Variabilität unerlässlich und ist auch in der Lage, eine Reihe von Merkmalen über die gesamte Pflanzenentwicklung hinweg zu screenen, unabhängig von der Populationsgröße¹⁵. Zum Beispiel wird die Messung morphologischer Merkmale, einschließlich der Form, Größe und des Farbindex von Blättern mit Rot-Grün-Blau (RGB) Bildsensoren, verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen zu bestimmen. Darüber hinaus werden Messungen physiologischer Merkmale, einschließlich der photosynthetischen Leistung, der Kronentemperatur und des Blattreflexionsvermögens, mit mehreren Arten von Sensoren quantifiziert, wie z. B. Chlorophyllfluoreszenz, thermisches Infrarot (IR) und hyperspektrale Bildgebung¹⁶. Neuere Studien in kontrollierten Umgebungen zeigten das Potenzial der bildbasierten Phänotypisierung bei der Bewertung verschiedener Mechanismen und physiologischer Reaktionen von Pflanzen unter abiotischem Stress wie Hitze bei Kartoffeln¹⁷, Trockenheit bei Gerste¹⁸, Reis¹⁹ und kombinierten Trocken- und Wärmebehandlungen bei Weizen²⁰. Auch wenn die Untersuchung der Reaktionen von Pflanzen auf multiple Stressinteraktionen komplex ist, eröffnen die Ergebnisse neue Erkenntnisse zum Verständnis der pflanzlichen Mechanismen bei der Bewältigung des schnellen Wandels der Klimabedingungen²¹.

Die physiologischen und morphologischen Reaktionen der Pflanzen werden direkt durch abiotische Stressbedingungen (hohe Temperaturen, Wasserdefizit und Überschwemmungen) beeinflusst, was zu einer Ertragsminderung führt²². Auch wenn Kartoffeln im Vergleich zu anderen Kulturen eine hohe Wassernutzungseffizienz aufweisen, wirkt sich das Wasserdefizit aufgrund der flachen Wurzelarchitektur negativ auf die Ertragsmenge und -qualität^{aus 5}. Abhängig von der Intensität und Dauer der Trockenheit ist der Blattflächenindex reduziert, und in späteren Stressstadien ist eine Verzögerung des Kronenwachstums mit Hemmung der Blattneubildung ausgeprägt, was zu einer Verringerung der Photosyntheserate führt²³. Der Wasserschwellenwert ist kritisch bei Wasserüberschuss oder längeren Trockenperioden, was sich aufgrund von Sauerstofflimitierung, verminderter hydraulischer Leitfähigkeit der Wurzeln und Einschränkung des Gasaustauschs negativ auf das Pflanzenwachstum und die Knollenentwicklung auswirkt^24,25. Darüber hinaus reagieren Kartoffeln empfindlich auf hohe Temperaturen, bei denen Temperaturen über dem optimalen Niveau zu einer verzögerten Initiierung, einem verzögerten Wachstum und einer verzögerten Assimilationsrate der Knollen führen²⁶. Wenn Stress in Kombination auftritt, unterscheiden sich die biochemischen Regulierungen und physiologischen Reaktionen von den individuellen Stressreaktionen, was die Notwendigkeit unterstreicht, die Reaktionen der Pflanzen auf Stresskombinationen zu untersuchen²⁷. Kombinierter Stress kann zu einer (noch) stärkeren Verringerung des Pflanzenwachstums und zu determinanten Effekten auf reproduktionsbezogene Merkmale führen²⁸. Der Einfluss der Stresskombination hängt von der Dominanz der einzelnen Stressfaktoren über die anderen ab, was zu einer verstärkten oder unterdrückten Pflanzenreaktion führt (z. B. führt Trockenheit in der Regel zum Schließen der Spaltöffnungen, während die Spaltöffnungen offen sind, um eine Abkühlung der Blattoberfläche unter Hitzestress zu ermöglichen). Die kombinierte Stressforschung ist jedoch noch im Entstehen, und es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die komplexe Regulation, die die Pflanzenreaktionen unter diesen Bedingungen vermittelt, besser zu verstehen²⁹. Daher zielt diese Studie darauf ab, ein Phänotypisierungsprotokoll unter Verwendung mehrerer bildgebender Sensoren hervorzuheben und zu empfehlen, das geeignet sein kann, morphophysiologische Reaktionen zu bewerten und die zugrunde liegenden Mechanismen der Gesamtleistung der Kartoffel unter einfachen und kombinierten Stressbehandlungen zu verstehen. Wie angenommen, erwies sich die Kombination mehrerer bildgebender Sensoren als wertvolles Werkzeug, um die frühen und späteren Strategien während der Stressreaktion von Pflanzen zu charakterisieren. Die Optimierung des bildbasierten Phänotypisierungsprotokolls wird ein interaktives Werkzeug für Pflanzenforscher und -züchter sein, um Merkmale zu finden, die für die abiotische Stresstoleranz von Interesse sind.

Protocol

1. Vorbereitung des Pflanzenmaterials und Wachstumsbedingungen

1. In-vitro-Transplantation von Kartoffelstecklingen (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) aus Gewebekulturen in 250-ml-Töpfe.
2. Füllen Sie die Töpfe mit vollständig gesättigtem Klasmman Substrat 2 und bewahren Sie sie 1 Woche lang bei schlechten Lichtverhältnissen in der Wachstumskammer auf.
3. Stellen Sie die Lichtverhältnisse auf dem Schirmniveau mit einem Belichtungsmesser auf 160 μmol·^m-2·^s-1 mit einer Kombination aus 25 % weißem Licht und 35 % Infrarot ein.
4. Verpflanzen Sie die Pflanzen nach 10 Tagen des Wachstums der In-vitro-Stecklinge in Erde in 3-Liter-Töpfe (15,5 cm Durchmesser, 20,5 cm Höhe).
5. Füllen Sie den 3 L Topf mit 1850 g 3:1 Klasmann Substrat 2: Sand.
6. Stellen Sie die Pflanzen in die Wachstumskammer unter Lichtverhältnissen von 320 μmol·^m-2·^s-1 mit einer Kombination aus 55 % weißem Licht und 81 % Infrarot und stellen Sie sie auf ein langes Tagesregime (16 h Photoperiode) ein.
7. Stellen Sie die Temperatur in der Wachstumskammer auf 22 °C/19 °C für Tag/Nacht und die relative Luftfeuchtigkeit (RH) auf 55 % für den gesamten Versuch ein.
8. Halten Sie das Topfgewicht bei 60 % des relativen Wassergehalts (SRWC) des Bodens als geeignetes Kontrollniveau, um das Wachstum und den Ertrag aufrechtzuerhalten^30,31.
   HINWEIS: Basierend auf früheren Versuchen förderte die Aufrechterhaltung eines volumetrischen Wassergehalts von über 60 % das Mooswachstum auf der Bodenoberfläche und erhöhte das Risiko von Pflanzenkrankheiten. Darüber hinaus könnte das Vorhandensein von Moos irreführende positive Signale aus der Chlorophyll-Fluoreszenzbildgebung erzeugen, die schwer herauszufiltern sind. Verwenden Sie die folgende Gleichung: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, wobei FW das Frischgewicht des Bodens, TW das Turgorgewicht und DW das Trockengewicht³² ist.
   1. Wählen Sie die Bodenproben (100 g) aus drei verschiedenen Klasmman Substrate 2 Mischbeuteln als Repliken aus und wiegen Sie das Frischgewicht des Bodens.
   2. Tränken Sie die Erde mit Wasser, bis die Töpfe Wasser halten, ohne zu tropfen, und wiegen Sie das Turgorgewicht der Erde.
   3. Die Probe 3 Tage lang bei 80 °C in den Ofen stellen, bis die Bodenproben vollständig getrocknet sind, und das Trockengewicht des Bodens^{mit einem Gewicht von 33 °C} wiegen.
9. Legen Sie die blauen Matten auf die Topfoberfläche, um die Verdunstung zu reduzieren.
   HINWEIS: Blaue Farbe ist notwendig, um den Bodenhintergrund von den Pflanzenpixeln in der Bildsegmentierung zu subtrahieren.
10. Wählen Sie zehn biologische Replikate pro Behandlung aus.
11. Verteilen Sie die Töpfe während der Bewässerung nach dem Zufallsprinzip (insgesamt 50 Töpfe).
12. Fügen Sie die blauen Halter hinzu, um die Pflanzen zu stützen und mechanische Beschädigungen beim Einsetzen in das Phänotypisierungssystem zu vermeiden.

2. Anwendung von Stress

1. Im frühen Stadium der Tuberisierung (28 Tage nach dem Umpflanzen der In-vitro-Stecklinge ) teilen Sie die Pflanzen in fünf Behandlungsgruppen auf und phänotypisieren Sie zehn Pflanzen pro Behandlung (Abbildung 1).
2. Induzieren Sie den Einzel- und kombinierten Stress auf ein Niveau, das nicht nachteilig ist, wie folgt:
   1. Halten Sie die Pflanzen in der Wachstumskammer unter Kontrolle, Trockenheit und Staunässe bei 22 °C/19 °C Tag/Nacht (Schritt 1.7), mit unterschiedlichen Anteilen an SRWC:
      Kontrolle (C) mit 60% SRWC für den gesamten Versuch.
      Dürre (D) mit 20 % SRWC allmählich für 7 Tage, gefolgt von 1 Tag Erholung.
      Staunässe (W) mit 160% SRWC für 5 Tage, gefolgt von 10 Tagen Erholung.
   2. Um den Wasserstand bei der Staunässebehandlung über der Bodenoberfläche zu halten, setzen Sie eine Plastiktüte in den leeren Topf ein und stellen Sie dann den Haupttopf mit Erde in den vorbereiteten zweiten Topf.
   3. Stellen Sie die Pflanzen für Wärmebehandlungen bei 30/28 °C Tag/Nacht und 55 % relativer Luftfeuchtigkeit in eine Wachstumskapsel. Einzelne und kombinierte Wärmespannungen werden wie folgt auferlegt:
      1. Für Hitze (H) die Temperatur 15 Tage lang bei 30-28 °C mit 60 % SRWC halten.
      2. Bei dreifachem Stress bei Hitze + Dürre + Staunässe (HDW) die Pflanzen in den ersten 7 Tagen einer Wärmebehandlung bei 30 °C/28 °C Tag-/Nachttemperatur (unter Beibehaltung von 60 % SRWC), gefolgt von einer kombinierten Behandlung mit Trockenheit + Hitze für die anderen 7 Tage (20 % SRWC und 30 °C/28 °C) und schließlich die Pflanzen 1 Tag lang Staunässe aussetzen. Für Letzteres setzen Sie die Pflanzen zurück in die Wachstumskammer (siehe Schritt 1.7 für die Bedingungen) und induzieren Sie 1 Tag lang Staunässe auf 160% SRWC.
         HINWEIS: Die ausgewählten Dauern der induzierten Spannungen basierten auf einem Pilotversuch, der Stresseffekte ohne nachteilige Auswirkungen mit einem 100%igen Überleben der behandelten Pflanzen zeigte. In der Wachstumskammerumgebung lag die Variation der Umgebungsbedingungen im Bereich ± 0,2 °C für die Temperatur und ± 3 % für die Luftfeuchtigkeit.

3. Vorbereitung der Pflanzen für die Phänotypisierung

1. Nachdem das Licht um 6:00 Uhr morgens in den Wachstumskammern eingeschaltet wurde, lassen Sie die Pflanzen mindestens 2-3 Stunden lang unter den konstanten Wachstumslichtbedingungen (320 μmol·^m-2·^s-1) akklimatisieren, bevor Sie mit dem Phänotypisierungsprotokoll beginnen. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Photosynthese und die Stomataregulation in einem stationären Zustand befinden³⁴.
2. Bringen Sie die Pflanzen vor der Messung von ihrem Anbauort in den Wachstumspufferbereich des Phänotypisierungssystems, das für das manuelle Laden der Pflanzen in das System verwendet wird, während sich die automatische Bewertung im Standby-Modus befindet und im Gewächshaus positioniert ist (Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3).
   HINWEIS: Die Pflanzen wurden während der Phänotypisierungsphase von 3,5 Stunden im Wachstumspufferbereich gehalten. Im Gewächshaus lag die Variation der Umgebungsbedingungen im Bereich von ± 2 °C für die Temperatur, ± 5 % für die Luftfeuchtigkeit und 20 % Schwankungen in der Lichtintensität. Beachten Sie daher, dass die Messungen sofort beginnen und kurz sein sollten, um den Einfluss der Gewächshausbedingungen auf die Pflanzen zu vermeiden.
3. Platzieren Sie in der Phänotypisierungsplattform die Töpfe in den Scheiben, die sich automatisch auf einem Förderband in vorgegebenen Intervallen zum Bildsensor gemäß den in Abschnitt 4 angegebenen Messprotokollen bewegen.
4. Beschriften Sie jede Pflanze/jedes Tablett mit einer eindeutigen ID, um sicherzustellen, dass die Messdaten während des gesamten Experiments der richtigen Pflanze zugeordnet werden.

4. Phänotypisierungsprotokoll

1. Optimierung des Phänotypisierungsprotokolls durch den Einsatz mehrerer bildgebender Sensoren (Chlorophyllfluoreszenz, thermisches IR, RGB und hyperspektrale Bildgebung), wodurch die gleichzeitige Messung sowohl der physiologischen als auch der morphologischen Parameter von Pflanzen ermöglicht wird (Abbildung 2).
   HINWEIS: Da die Reaktionen der Pflanzen die Umweltbedingungen und die täglichen Auswirkungen widerspiegeln, ist es wichtig, die Randomisierung der Töpfe und die Durchführung einer Phänotypisierung innerhalb der gleichen Tageszeit in Betracht zu ziehen.
2. Stellen Sie in der Phänotypisierungsplattform sicher, dass die Pflanzen durch einen Anpassungstunnel in das System gelangen (Abbildung 2A), in dem zuerst die Höhe der Pflanze erfasst und dann die Höhe jedes Sensors auf der Grundlage eines festen Arbeitsabstands angepasst wird.
3. Führen Sie die Messungen in zwei Durchgängen durch, wie im Messprotokoll mit der Software angegeben.
   1. In der ersten Runde werden physiologische Reaktionen gemessen, die als "schnelle Reaktionen" quantifiziert werden, unter Verwendung von Chlorophyllfluoreszenz und Wärmebildgebung.
   2. Beginnen Sie mit der Messung der physiologischen Parameter bei Hitzestressbehandlungen und dann bei den restlichen Behandlungen.
   3. Fahren Sie in der zweiten Runde mit anderen Messungen zur Beurteilung langsamerer Reaktionen fort, einschließlich struktureller RGB- und hyperspektraler Bildgebung, gefolgt von Gewichtsbewertung und Bewässerung.
4. Definieren Sie während des Wäge- und Bewässerungsschritts das Referenzgewicht für jede Pflanze, um eine automatische Bewässerung und Verwiegung für die jeweilige Behandlung zu ermöglichen.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtreferenzgewicht das Gewicht der Scheibe, des Einsatzes auf dem Förderband, des unterstützenden blauen Halters, der blauen Matte, des Topfes, des Bodens und der Pflanzenbiomasse im definierten Protokoll enthält.
   2. Für eine genaue Messung der Evapotranspiration während des Wäge- und Bewässerungsschritts bereiten Sie leere Töpfe als Referenz vor. Bereiten Sie außerdem zusätzliche Töpfe vor, um das Gewicht der Pflanzenbiomasse zu korrigieren.
5. Um 50 Pflanzen zu messen, dauert das gesamte Phänotypisierungsprotokoll 215 Minuten (85 Minuten in der 1^. Runde und 130 Minuten in der 2^. Runde).
6. Phänotypisieren Sie täglich alle Pflanzen unter Kontrollbedingungen (1 Tag vor der Behandlung) und induzieren Sie dann die Stressbehandlungen, um die dynamischen Reaktionen zu überwachen und die frühen und späten Phasen des induzierten Stresses zu beurteilen.

5. Anpassen der Einstellungen für jeden Bildsensor

1. Kinetische Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung
   HINWEIS: Die kinetische Chlorophyllfluoreszenz wird verwendet, um die Photosynthesekapazität von Pflanzen als Reaktion auf verschiedene Umweltbedingungen, einschließlich abiotischer Stress, zu untersuchen und wertvolle Informationen über die Quanteneffizienz der Photochemie und Wärmeableitung (nicht-photochemischer Prozess) zu liefern.
   1. Durchführung von Chlorophyllfluoreszenzmessungen an lichtadaptierten Pflanzen unter Verwendung eines kurzen Lichtprotokolls, um die Reaktionen von Pflanzen unter verschiedenen Behandlungen zu unterscheiden.
   2. Akklimatisieren Sie³⁵ der Pflanzen für 5 min unter dem Licht im Anpassungstunnel, der mit kaltweißen LEDs (6500 K) bei 500 μmol·^m-2·^s-1 bestückt ist.
      HINWEIS: Die Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung ist die erste Messung nach der Lichtadaption, die zur Überwachung von Veränderungen der Photosynthesekapazitäten von Pflanzen verwendet wird.
   3. Wählen und optimieren Sie das vordefinierte Protokoll entsprechend der Anlagengröße und der erforderlichen Lichtintensitäten.
   4. Optimieren Sie die Messeinstellungen, einschließlich der Einstellungen für Kamera und Lichtintensität, um die Erfassung eines starken Signals mit einem optimalen Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten.
      1. Passen Sie Kameraeinstellungen wie Verschluss (Belichtungszeit, Dauer der Blitzmessung) und Empfindlichkeit (elektrische Verstärkung der Kamera) an. Verwenden Sie den Verschluss bei 2 ms und die Empfindlichkeit bei 12 %.
         HINWEIS: Diese Werte werden basierend auf der Blattgröße und -form und dem definierten Abstand zwischen der Oberseite des Blätterdachs und dem Bildsensor angepasst.
      2. Stellen Sie die aktinische Lichtintensität auf 500 μmol·^m-2·^s-1 ein und stellen Sie den Sättigungsimpuls auf 3200 μmolμm-2·^s-1 ein, was mindestens 6-7 mal höher ist als das aktinische Licht.
   5. Zur Messung von Parametern im lichtbeständigen Zustand (Lss) (siehe unten) lichtadaptieren Pflanzen für 5 Minuten vor den Messungen im Lichtadaptionstunnel.
   6. Um die Quantenausbeute des stationären Photosystems II (PSII) von lichtadaptierten Pflanzen abzuschätzen, wählen Sie das Kurzlichtprotokoll (Abbildung 3) und stellen Sie das Protokoll wie folgt ein.
      HINWEIS: Die Protokolldauer betrug 10 s pro Pflanze.
      1. Starten Sie die Messung, indem Sie das kaltweiße aktinische Licht bei 500 μmol·^m-2·^s-1 für 3 s einschalten, um die stationäre Fluoreszenz im Licht (F_t_Lss aka. F_t')
      2. Wenden Sie einen Sättigungsimpuls bei 3200 μmolμm-2·^s-1 für 800 ms an, um die stationäre maximale Fluoreszenz im Licht (F_m_Lss aka. F_m')
      3. Schalten Sie das aktinische Licht aus und dann das dunkelrote Licht (735 nm) ein, damit sich PSII im Dunkeln 800 ms lang entspannen und die stationäre minimale Fluoreszenz im Licht (F_o_Lss aka. F_o').
   7. Um die relativen Parameter zu berechnen, verwenden Sie eine Datenanalysesoftware, die den Hintergrund subtrahiert und die relevanten Parameter extrahiert.
      HINWEIS: Die aus dem verwendeten Protokoll extrahierten Parameter sind: maximale Effizienz der PSII-Photochemie einer lichtadaptierten Probe im lichtstationären Zustand, bestimmt als F_v/F_m_Lss aka. F_v'/F_m', Photosystem II Quantenausbeute oder Betriebseffizienz des Photosystems II im stationären Lichtzustand, definiert als QY_Lss aka. φ_PSII = F_q'/F_m', und der Anteil der offenen Reaktionszentren in PSII (oxidierte QA) wird bestimmt als qL_Lss = (F_q'/F_v') x (F₀'/F_t').
2. Thermische Infrarot (IR)-Bildgebung
   HINWEIS: Die thermische IR-Bildgebung wird zur nicht-invasiven Messung der tatsächlichen Kronentemperatur verwendet, um die verschiedenen Stomatavorschriften zu bestimmen. In der Wärmebild-IR-Bildgebungseinheit ist eine Wärmebildkamera seitlich am Roboterarm montiert, um die Temperatur des Blätterdachs aus der Seitenansicht zu messen.
   1. Um den Kontrast der Hintergrundtemperatur gegenüber der Temperatur des abgebildeten Objekts während der Bildverarbeitung zu erhöhen, verwenden Sie eine automatisch gesteuerte beheizte Wand auf der gegenüberliegenden Seite der Wärmebildkamera, um den Kontrast zu erhöhen. Regulieren Sie die Wandtemperatur auf 8 °C über der Lufttemperatur in der Bildgebungseinheit.
      HINWEIS: Die Wärmebilder wurden bei Dunkelheit mit dem Zeilenmodus³⁵ aufgenommen.
   2. Generieren Sie nach der Bildaufnahme eine Pflanzenmaske auf Basis von RGB-Seitenansichtsdaten und verwenden Sie diese zur Co-Registrierung mit thermischen Daten in der Bildanalyse. Dies gewährleistet eine präzise Identifizierung des gescannten Objekts und eliminiert gleichzeitig Hintergrundstörungen wie z. B. Pflanzenhalter.
   3. Um den Einfluss schwankender Umgebungsbedingungen während des gesamten Versuchs zu vermeiden, berechnen Sie den Parameter Temperaturdifferenz (Delta T oder ΔT).
      HINWEIS: Delta T (ΔT) ist definiert als die Differenz zwischen der gemessenen Temperatur der Blattoberfläche (dem Durchschnitt aller Pixel der gesamten erfassten Oberfläche der Pflanze) und der Umgebungslufttemperatur in der Imagingbox.
3. RGB-Bildgebung
   HINWEIS: Die RGB-Bildgebung basiert auf VIS-Kameras (Visual Inertial System), die Licht im sichtbaren Bereich von 400 bis 700 nm erfassen, wo sie für eine eingehende Analyse der Pflanzenmorphologie, -architektur und -extraktion von Farbindexmerkmalen verwendet werden.
   1. Die Bildgebungseinheit enthält einen Drehtisch zur präzisen Positionierung des Tabletts und ermöglicht gleichzeitig eine Mehrwinkelaufnahme für Seitenansichten.
   2. Stellen Sie die RGB-Bildgebung basierend auf der Seitenansicht ein, um die Pflanze aus drei Winkeln (0°, 120° und 240°) zu erfassen, die im Zeilenscanmodus (RGB1) und in der Draufsicht im Schnappschussmodus (RGB2) aufgenommen wird.
   3. Beide Kameras verfügen über eine LED-basierte Lichtquelle, die eine homogene Ausleuchtung der abgebildeten Pflanze gewährleistet und somit morphologische und farbliche Merkmale genau bestimmen kann.
   4. Extrahieren Sie berechnete Parameter mithilfe der Datenanalysesoftware.
   5. Für zusätzliche Parameter, die auf Seiten- und Draufsichten basieren, berechnen Sie das Pflanzenvolumen (digitale Biomasse)³⁶:
      
   6. Berechnen Sie die relative Wachstumsrate (RGR)³⁷:
      
      Dabei geben T_n und T_n+1 das Zeitintervall (Tage) an.
4. Hyperspektrale Bildgebung
   HINWEIS: Die hyperspektrale Bildgebung wird zur Visualisierung des spektralen Reflexionsgrads der Pflanzen verwendet. Die Veränderungen des Blattreflexionsvermögens sind Indikatoren für den unterschiedlichen physiologischen Zustand der jeweiligen Pflanze.
   1. Verwenden Sie den hyperspektralen Bildsensor, um den Reflexionsgrad des Kronendachs im sichtbaren Teil der Lichtspektren zu quantifizieren, mit einer Hyperspektralkamera im sichtbaren Nahinfrarot (VNIR) im Bereich von 380 bis 900 nm und einer kurzwelligen Infrarotkamera (SWIR) im Bereich von 900 bis 1700 nm.
   2. Die Kameras sind auf einem Roboterarm mit einer implementierten Halogenröhrenlichtquelle (600 W) für eine homogene und spektral angemessene Probenbeleuchtung während der Bildaufnahme montiert, die sich über den XZ-Bereich bewegt.
   3. Beide Kameras arbeiten im Zeilenscan-Modus und sind in einer lichtisolierten Bildbox untergebracht.
   4. Führen Sie vor jeder Messrunde zwei Kalibriermessungen (automatisch) durch: die Dunkelstromkalibrierung und die radiometrische Kalibrierung mit dem Teflonstandard für den spektralen Reflexionsgrad.
   5. Das dunkle Kalibrierungsbild wird vom rohen und weißen Kalibrierungsbild subtrahiert, um das Dunkelstromrauschen zu entfernen. Generieren Sie dann das endgültige Hyperspektralbild, indem Sie das Rohbild nach der Subtraktion durch das weiße Kalibrierungsbild dividieren.

6. Exportieren von Daten und Bildanalyse

1. Verwenden Sie die Datenanalysesoftware für die automatische Extraktion, die Hintergrundsubtraktion und die Segmentierung der Pflanzenmaske der Bildverarbeitungspipeline (Abbildung 2B).
2. Die Software führt eine vollautomatische Analyse durch, bei der das Auftragen der Maske, die Hintergrundsubtraktion, bei der die Pflanzen von ihrem Hintergrund isoliert werden, und die Parameterberechnung verarbeitet werden, wie für die RGB-Bildgebung³⁸ und die Wärmebildgebung²⁰ beschrieben.
3. Extrahieren Sie die gemessenen und berechneten Parameter aus den pflanzenspezifischen Pixeln, wie sie durch die mit RGB-Bildern erzeugte Pflanzenmaske und die Tablettmaske definiert sind.
4. Wenn die Bilder nicht vollständig ausgewählt wurden, was aufgrund von Veränderungen des Grüns der Vegetation in späteren Entwicklungsstadien oder durch die Wirkung der Stressbehandlung auftreten kann, öffnen Sie den lokalen Datenanalyseteil in der Software und passen Sie die Pflanzenmaskeneinstellungen in der Datenanalysesoftware je nach Sensor neu an.
5. Passen Sie bei der Chlorophyllfluoreszenz-Bildverarbeitung die Analyseparameter für die Chlorophyllfluoreszenz-Pflanzenmaske an (Ergänzende Abbildung 4).
   1. Legen Sie den Schwellenwert auf "True" fest, was bedeutet, dass die Anlagensegmentierung automatisch durchgeführt wird.
   2. Legen Sie den Maskenrahmenindex auf Falsch fest, was bedeutet, dass für die Erkennung von Pflanzenmasken der Zeit-Visual-Rahmen verwendet wird, wie im Chlorophyllfluoreszenzprotokoll definiert.
6. Stellen Sie in der Wärmebildverarbeitung die Parameter für die Pflanzenmaskenanalyse ein (Ergänzende Abbildung 5).
   1. Legen Sie den automatischen Schwellenwert für die Generierung von Objektmasken auf False fest.
   2. Legen Sie die Maske aus dem RGB-Seitenbild auf "True " fest, um sie für die Analyse zu verwenden.
7. Passen Sie in der RGB-Bildverarbeitung die Analyseparameter der Pflanzenmasken-Einstellungen (Ergänzende Abbildung 6 und Ergänzende Abbildung 7) je nach Art und Entwicklungsstadium an.
   1. Wählen Sie die Formel 4*G-3*B-R, die die Definition für die Generierung von Objektmasken darstellt und die verwendete Farbkomponente (Rot-, Grün-, Blau-Komponente) definiert.
      HINWEIS: Diese Standardformel und andere Einstellungen können sich je nach verwendetem Kameratyp (Draufsicht oder Größenansicht), angewendeter Behandlung und verschiedenen Sorten ändern.
   2. Passen Sie den Schwellenwert an, der für die Umwandlung des Graustufenbildes mit einem erweiterten Grünkanal in ein binäres Bild verwendet wird, um die von der Pflanze bedeckte Oberfläche zu bestimmen.
   3. Passen Sie die Median-Filtergröße an, um das Rauschen und ungültige Pixel zu reduzieren und fehlende Pixel zu ergänzen.
   4. Passen Sie die minimale Größe des Objekts in Pixel an, das in die Analyse einbezogen werden soll.
   5. Passen Sie die minimale Größe von Löchern in den Maskenobjekten in Pixeln an, in der Regel Dutzende von Pixeln. Die Löcher, die kleiner als dieser Wert sind, werden geschlossen und in die Objektpixel übernommen.
   6. Legen Sie die Option "Reflexionsreduzierung verwenden " auf "True " fest, um die RGB-Werte in jedem Pixel zu normalisieren.
   7. Setzen Sie die Option "Fehlerhafte belichtete Punkte überspringen " auf "Wahr " für das Über-/Unterbelichten von belichteten Pixeln aus der Pflanzenmaske (z. B. Weglassen der Oberflächenreflexionen oder der dunklen Pixel, bei denen das Rauschen größer als das Signal ist).
8. Färben Sie die Segmentierungseinstellungen, die mit der Datenanalysesoftware aus RGB analysiert wurden, ein, um Informationen über Farbänderungen im Zusammenhang mit Stressreaktionen und Pflanzenseneszenz bereitzustellen.
   HINWEIS: Der Grüngrad wird anhand eines vordefinierten Farbbereichs geschätzt, der alle Stadien der Pflanzenentwicklung darstellt. Die Intensität in den Farbkanälen aller Pixel, die der Pflanzenoberfläche entsprechen, wurde gruppiert und geclustert, um als Quellfarbkarte für die Farbsegmentierung verwendet zu werden.
   1. Stellen Sie das verarbeitete RGB-Bild (entfernter Hintergrund), die Farbkarte - eine Liste der Farbtöne für die spezifische Analyse - als Eingabe in der Software bereit.
   2. Um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten, führen Sie eine Farbtonauswahl mit einem "Trainings"-Datensatz durch und wählen Sie verschiedene Entwicklungsstadien und Behandlungen aus.
      HINWEIS: Bei der Analyse werden die R-, G- und B-Werte jedes Pixels jedes Bildes aus diesem Trainingsdatensatz gespeichert.
   3. Definieren Sie die Anzahl der Farbtöne (wählen Sie 6 Farbtöne) mit der Software für die Ausgabe der Farbdefinition im Bereich von 0 bis 255 für jeden Kanal.
   4. Geben Sie die Liste der Farbtöne an, die in der Datenanalysesoftware generiert wurden (Farben).
9. Verarbeiten Sie bei der hyperspektralen Bildverarbeitung die erfassten hyperspektralen Daten mit der Pixel-für-Pixel-Analyse, die in der Hyperspektralanalysesoftware implementiert ist und radiometrische und dunkle Rauschkalibrierung, Hintergrundsubtraktion und Segmentierung von Pflanzenmasken umfasst. Verwenden Sie die durchschnittlichen Spektren und Vegetationsindizes für weitere Analysen.
10. Erstellen Sie die Maske für die Datenextraktion aus dem Hyperspektralbild aus dem VNIR-Bild, das von der VNIR-Hyperspektralkamera aufgenommen wurde. Generieren Sie für den SWIR-Hyperspektralscan eine Pflanzenmaske auf Basis der SWIR-Analyse.
    1. Verwenden Sie in VNIR Plant Mask die Formel 1,2*(2,5*(R740-R672)-1,3*(R740-R556)) zur Visualisierung der Bilder, wobei R den Reflexionswert in einer bestimmten Wellenlänge darstellt (Ergänzende Abbildung 8).
    2. Verwenden Sie in der SWIR-Pflanzenmaske die Formel (R960-R1450)-(R960-R1200) in der Bildverarbeitung zur Visualisierung der Bilder (Ergänzende Abbildung 9).

7. Wiegen und Gießen

1. Lagern Sie das Gewicht (vor) der Bewässerung während des Wiege- und Bewässerungsvorgangs. Gießen Sie dann und behalten Sie das Gewicht auch nach dem Gießen.
2. Bewässern Sie die Tabletts im Referenzmodus - jedes Tablett hatte einen Referenzwert, der in der Datenbank gespeichert war, auf den es immer gegossen wurde. Bestimmen Sie die Referenz basierend auf der Behandlung.

8. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die Daten mit dem ANOVA- und Shapiro-Test.
2. Führen Sie paarweise Vergleiche zwischen verschiedenen Behandlungen durch den Pairwise Wilcox-Test in R Studio (Version 4.2.3) mit den Paketen (dplyr), (tidyverse), (rstatix) und (ggpubr) durch.
   HINWEIS: Die Bildanalyse wurde automatisch mit Hilfe einer Datenanalysesoftware durchgeführt. Für die weitere Analyse der Bildaufnahme verwenden Sie eine sensorspezifische Datenanalysatorsoftware.

Results

In dieser Studie wurde eine automatisierte bildbasierte Phänotypisierung verwendet, um die morphologischen und physiologischen Reaktionen der Kartoffel (cv. Lady Rosetta) unter einfachem und kombiniertem Stress zu untersuchen. Der angewandte Ansatz zeigte die dynamischen Reaktionen von Pflanzen in hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, wenn Stress in der Knolleninitiierungsphase induziert wurde. Um die frühen und späten Phasen von Stress zu erfassen, wurden die Ergebnisse in 3 Zeiträumen dargestellt ([0-5 Tage Phänotypisierung (DOP)], [6-10 DOP] und [11-15 DOP]) (Abbildung 1). Bis 0 DOP wurden alle Pflanzen unter Kontrollbedingungen (C) angebaut, dann von 1-5 DOP, wobei Staunässe (W) und Hitzestress (H) angewendet wurden. So wurden die Reaktionen wie folgt beobachtet: (i) in 0-5 DOP zeigte die anfängliche Hitze- und Staunässe; (ii) in 6-10 DOP wurde die frühe Dürre (D) und kombinierte Hitze und Dürre (HD) beobachtet und (iii) in 11-15 DOP zeigte die späte Hitze, Trockenheit und kombinierte Hitze + Dürre + Staunässe (HDW). Die Erholung von Staunässe wurde bei 6-10 DOP und 11-15 DOP beobachtet.

Morphologische Merkmale
Mit Hilfe von RGB-Bildgebung wurde der Einfluss verschiedener Belastungen und Kombinationen auf das oberirdische Pflanzenwachstum bestimmt. Die Ergebnisse in Abbildung 4 zeigen, dass Wärmebehandlung und Staunässe (0-5 DOP) bereits eine Reduzierung des Anlagenvolumens und der RGR im Vergleich zur Regelung bewirken. Während 6-10 DOP nahmen das Pflanzenvolumen und die RGR der Kontrollpflanzen kontinuierlich zu, während unter Hitze, Kraft-Wärme-Kopplung, Trockenheit und Staunässe diese Zunahme des Pflanzenvolumens deutlich reduziert wurde (Abbildung 4A). Da Pflanzen sehr anfällig für Staunässe sind, war ein Rückgang der RGR ausgeprägt (Abbildung 4B). Während des späten Trockenstresses (11-15 DOP), bei dem der SRWC bei 20% gehalten wurde, wurde eine deutliche Reduktion der RGR im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. In der späten Phase der kombinierten HDW führte die Anwendung einer Staunässebehandlung jedoch zu einem Anstieg der RGR am letzten Tag der Belastung.

Physiologische Merkmale
Die Kombination aus struktureller und physiologischer Phänotypisierung wurde angewendet, um weitere Reaktionen auf Stress aufzudecken. Die Verwendung mehrerer bildgebender Sensoren ermöglicht die Bestimmung der physiologischen Reaktionen in der frühen Phase von Stress. Eine weitere Analyse der Chlorophyll-Fluoreszenzdaten zeigte, dass Staunässe die photosynthetische Effizienz negativ beeinflusste, wobei F_v'/F_m' (F_v/F_m_Lss) bei 0-5 DOP und 6-10 DOP dramatisch abnahm, aber eine Erholungsreaktion bei 11-15 DOP beobachtet wurde, wo F_v'/F_m' leicht anstieg (Abbildung 5A). Während der späten Stressphase (11-15 DOP) wurde eine Reduktion von F_v'/F_m' bei Trockenheit und kombinierter Hitze und Trockenheit beobachtet. In wassergesättigten Pflanzen war die Betriebseffizienz der Pflanzen (QY_Lss auch bekannt als φ_PSII) im Vergleich zu anderen Behandlungen bei 0-5 DOP und 6-10 DOP signifikant niedriger, aber ein leichter Anstieg bei 11-15 DOP, was auf eine Wiederfindung der Pflanzen hinweist (Abbildung 5B). Darüber hinaus wurden die verschiedenen Mechanismen zur Regulierung der Effizienz, die zum Schutz von PSII beitragen, durch Berechnung des Anteils der offenen Reaktionszentren in PSII in einem leichten stationären Zustand (qL_Lss) bestimmt (Abbildung 5C). Nur unter Trockenheit wurde ein Anstieg der qL beobachtet, wahrscheinlich aufgrund der Photoinhibition.

Diese Ergebnisse stimmten mit IR-Daten überein, die unterschiedliche zugrundeliegende Mechanismen unter Stress widerspiegelten (Abbildung 6). Bei Staunässe wurde ein Anstieg von deltaT (ΔT) beobachtet, wodurch sich die Gaswechselrate verringerte. Bei Spättrockenheit und kombinierter Hitze und Trockenstress war ein Anstieg des ΔT auf den Verschluss der Spaltöffnungen zurückzuführen, der als eine der wichtigsten Reaktionen zur Vermeidung von übermäßigem Wasserverlust angesehen wurde. Auf der anderen Seite wurde eine Verringerung des ΔT unter Wärmebehandlungen beobachtet, wenn sich die Spaltöffnungen öffnen, um die Transpirationseffizienz zu erhöhen und die Blattoberfläche zu kühlen.

Bei der Untersuchung der hyperspektralen Daten wurden zwei Parameter aus den hyperspektralen VNIR-Daten ausgewählt, um die Blattreflexionsindizes zu bewerten, darunter NDVI als Indikator für den Chlorophyllgehalt und PRI als Indikator für die Effizienz der Photosynthese. Die Ergebnisse zeigten eine Abnahme von NDVI und PRI nur unter Staunässe in Verbindung mit der beobachteten Reduktion der morphologischen Merkmale (Abbildung 7A,B). Darüber hinaus wurde aus den hyperspektralen SWIR-Daten, die zur Beurteilung des Wassergehalts in den Pflanzen verwendet wurden, ein Anstieg des Wasserindex bei Staunässe während 0-5 DOP beobachtet (Abbildung 7C). Bei Wärmebehandlungen wurde jedoch eine gegenteilige Reaktion beobachtet, bei der der Wasserindex niedriger war als bei der Kontrolle. Diese Ergebnisse stimmten mit einer Untersuchung der Vegetation aus der Farbsegmentierung der RGB-Draufsicht überein. Die Veränderungen im Anteil der Farbtöne zeigen die Stressreaktionen im Laufe der Zeit an (Abbildung 8). Der Greening-Index zeigte eine Verringerung des Pigmentgehalts unter Trockenheit und kombinierter HDW in der späten Stressphase und eine allmähliche Erholung von der Staunässebehandlung. Die Verwendung der verschiedenen bildgebenden Sensoren spiegelte somit die Korrelation morphophysiologischer Merkmale wider und ermöglichte die Beurteilung der Gesamtleistung der Pflanze unter abiotischem Stress.

Abbildung 1: Zeitleiste der Anwendung der verschiedenen Behandlungen, einschließlich des Alters der Pflanzen in Tagen nach dem Umpflanzen der In-vitro-Stecklinge . Tag 0 der Phänotypisierung (DOP) wurde unter Kontrollbedingungen (C) gemessen, und dann wurden die verschiedenen Belastungen mit unterschiedlicher Dauer induziert. Von 1-5 DOP wurde Staunässe (W) Spannung aufgebracht und die erste Reaktion der Wärmebehandlung (H). In den folgenden Tagen wurde 6-10 DOP die Anfangsphase von Trockenstress (D) und kombinierter Hitze- und Trockenstress (HD) vorgestellt. Während 11-15 DOP wurde die Reaktion der Pflanzen auf die späte Phase der Trockenheit und Wärmebehandlungen und die Anwendung von Staunässe auf HD (HDW) für 1 Tag reflektiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schema zur Zusammenfassung des Phänotypisierungsprotokolls und der Datenanalyse. (A) Überblick über das Phänotypisierungsprotokoll. Die Pflanzen werden von den kontrollierten Bedingungen in der FS-WI-Wachstumskammer (PSI) zum Phänotypisierungssystem transportiert. Die Pflanzen wurden vor den Messungen 5 Minuten lang in der Lichtadaptionskammer bei 500 μmol.m-2.s-1 lichtakklimatisiert. Mehrere bildgebende Sensoren wurden verwendet, um morphologische und physiologische Merkmale zu bestimmen, gefolgt von der Wiege- und Bewässerungsstation. Je nach Behandlung wurden die Pflanzen wieder unter kontrollierten Bedingungen ausgesetzt, entweder bei 22 °C/19 °C oder 30 °C/28 °C. (B) Automatische Extraktion und Segmentierung der Bildverarbeitungspipeline von jedem Bildsensor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Kurzübersicht über das Lichtprotokoll für die Chlorophyll-Fluoreszenzbildgebung. Das Messprotokoll begann mit dem Einschalten von kaltweißem aktinischem Licht zur Messung der stationären Fluoreszenz im Licht (F_t_Lss) und dem anschließenden Anlegen eines Sättigungsimpulses zur Messung der stationären maximalen Fluoreszenz im Licht (F_m_Lss). Das aktinische Licht wurde ausgeschaltet und das dunkelrote Licht eingeschaltet, um die stationäre minimale Fluoreszenz im Licht (F_o_Lss) zu bestimmen. Die Dauer des Protokolls betrug 10 s pro Pflanze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: RGB-Bildgebung für die morphologische Beurteilung. (A) Pflanzenvolumen berechnet aus dem RGB-Bereich von oben und von der Seite. (B) Relative Wachstumsrate (RGR) während der Initiierungsphase der Knolle. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung an lichtadaptierten Pflanzen. (A) Maximale Effizienz der PSII-Photochemie lichtadaptierter Proben im lichtstabilen Zustand (F_v/F_m_Lss). (B) Quantenausbeute des Photosystems II oder Betriebseffizienz des Photosystems II im stationären Lichtzustand (QY_Lss). (C) Anteil der offenen Reaktionszentren in PSII im leichten stationären Zustand (oxidierte QA) (qL_Lss). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Thermische IR-Bildgebung wurde verwendet, um die Differenz zwischen der aus thermischen IR-Bildern extrahierten Durchschnittstemperatur des Kronendachs und der Lufttemperatur (ΔT) zu berechnen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Hyperspektrale Bildgebung zur Bestimmung von Vegetationsindizes und Wassergehalten. (A) Normalisierter Differenz-Vegetationsindex (NDVI). (B) Photochemischer Reflexionsindex (PRI), berechnet aus VNIR-Bildgebung. (C) Wasserindex berechnet aus SWIR-Bildgebung. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Begrünungsindex für Pflanzen unter verschiedenen Behandlungen. Die Bildverarbeitung basiert auf der Umwandlung des ursprünglichen RGB-Bildes in eine Farbkarte, die aus 6 definierten Farbtönen besteht. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Gemessene Lichtintensität während der Tage der Phänotypisierung (DOP). Die Dauer der Messungen von 9:00 bis 12:35 Uhr. LI_Buff bezieht sich auf die Mediandaten von 5 Lichtsensoren, die im Gewächshaus verteilt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Relative Luftfeuchtigkeit (RH), gemessen während der Tage der Phänotypisierung (DOP). Die Dauer der Messungen von 9:00 bis 12:35 Uhr. RH_Buff bezieht sich auf die Mediandaten von 5 Feuchtigkeitssensoren, die im Gewächshaus verteilt sind. RH2 bezieht sich auf die relative Luftfeuchtigkeit in der Adaptionskammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Temperatur, die während der Tage der Phänotypisierung (DOP) gemessen wurde. Die Dauer der Messungen von 9:00 bis 12:35 Uhr. T_Buff bezieht sich auf die Mediandaten von 5 Temperatursensoren, die im Gewächshaus verteilt sind. T2 bezieht sich auf die Temperatur in der Adaptionskammer. T3 bezieht sich auf die Temperatur der Heizwand. T4 bezieht sich auf die Temperatur im Wärmebildgerät. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Screenshot aus der Datenanalysesoftware, der die Parameter zeigt, die für die Analyse von Pflanzenmasken in bildgebenden Chlorophyllfluoreszenzsensoren angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Screenshot aus der Datenanalysatorsoftware, der die Parameter zeigt, die für die Analyse von Pflanzenmasken in thermischen Infrarot-Bildsensoren angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Screenshot aus der Datenanalysesoftware, der die Parameter zeigt, die für die Analyse der Pflanzenmaske in RGB-Bildsensoren mit 1-Seitenansicht angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Screenshot aus der Datenanalysesoftware, der die Parameter zeigt, die für die Analyse von Pflanzenmasken in RGB2-Bildsensoren mit Draufsicht angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Screenshot aus der Datenanalysesoftware, der die Parameter zeigt, die für die Analyse der Pflanzenmaske in VNIR-Bildsensoren angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Screenshot aus der Datenanalysesoftware, der die Parameter zeigt, die für die Analyse der Pflanzenmaske in SWIR-Bildsensoren angepasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Verbesserte, fortschrittliche hochauflösende Bildgebungswerkzeuge und Computer-Vision-Techniken haben die rasche Entwicklung der Pflanzenphänotypisierung ermöglicht, um quantitative Daten aus massiven Pflanzenbildern auf reproduzierbare Weise zu erhalten³⁹. Diese Studie zielte darauf ab, die bildbasierte Hochdurchsatz-Methodik unter Verwendung einer Reihe derzeit verfügbarer bildgebender Sensoren anzupassen und zu optimieren, um die dynamischen Reaktionen von Pflanzen unter einfachem und kombiniertem abiotischem Stress zu überwachen. Einige kritische Schritte des angewandten Ansatzes erfordern Anpassungen, einschließlich der Anwendung von Spannungen und der Auswahl eines geeigneten Bildgebungsprotokolls für die Messungen. Die Verwendung mehrerer Sensoren für die Bildaufnahme ermöglicht die Quantifizierung wichtiger phänotypischer Merkmale (wie Pflanzenwachstum, Photosyntheseeffizienz, Stomataregulation, Blattreflexion usw.). Darüber hinaus verbessert es das Verständnis, wie Kartoffelpflanzen auf verschiedene abiotische Belastungen reagieren. Dies ist eine wichtige Voraussetzung, um Pflanzenzüchtungsprojekte zur Entwicklung klimatoleranter Genotypen^{zu beschleunigen 40}. Die morphologischen Reaktionen auf den induzierten Stress hängen vom Entwicklungsstadium ab. Zum Beispiel hemmt die Induktion von Stress in der Stolon- oder Knolleninitiationsphase die Blatt- und Pflanzenentwicklung und begrenzt die Anzahl der Ausläufer, wodurch der Endertrag verringert^{wird 41}. Unter ungünstigen Bedingungen nutzen Pflanzen jedoch Stressreaktionen als adaptive Reaktion, um stressinduzierte zelluläre Schäden zu verhindern und zu reparieren⁴². Pflanzen verfügen über adaptive Mechanismen, um Stressbedingungen in Abhängigkeit vom Schweregrad⁴³ zu vermeiden und zu tolerieren.

Um die Mechanismen von Pflanzen zu verstehen, gilt die Induktion der angemessenen Dauer und Intensität von Stress und die Bestimmung der pflanzlichen Reaktionen auf Stress mit Hilfe von bildgebenden Sensoren als einer der kritischen Schritte. Wenn mehrere Spannungen zusammentreffen, kann die Intensität einer Spannung die Wirkung der anderen überstimmen, abhängig von der Kombination, Intensität und Dauer der Spannungen. So können sich die Stresseffekte summieren, oder gegensätzliche Reaktionen können sich gegenseitig (teilweise) aufheben, was letztendlich zu positiven oder negativen Auswirkungen auf die Pflanzen führt. Das in dieser Studie ausgewählte Protokoll basierte auf früheren Erfahrungen, um sicherzustellen, dass ein ausreichendes Stressniveau angewendet wurde. Zum Beispiel wurde die Anwendung des Trockenstresses wie in einem früheren Experiment auf ein moderates Niveau eingestellt, das Ansprechen unterschied sich nicht von Kontrollbehandlungen in einem frühen Stressstadium auf der Grundlage von Chlorophyllfluoreszenzbildgebung. Dies ist auf das Auftreten der Photorespiration zurückzuführen, die als alternative Senke für Elektronen in der Thylakoidmembran und als Schutzmechanismus für das Photosystem II fungiert^44,45. Bei der kombinierten Stressreaktion könnte die Exposition der Pflanze gegenüber einem milden primären Stressor die Toleranz gegenüber einem nachfolgenden Stressor erhöhen, was sich positiv oder nachteilig auswirken kann⁴⁶. In dieser Studie wurde eine stärkere Reaktion unter kombiniertem Stress im Vergleich zu individuellem Trockenstress beobachtet. Durch die Untersuchung anderer physiologischer Reaktionen zeigten die Ergebnisse einen Anstieg von ΔT (deltaT) unter Trockenheit, da sich die Spaltöffnungen schließen, um einen übermäßigen Wasserverlust zu vermeiden. Im Gegensatz dazu wurde die umgekehrte Reaktion unter Hitzestress beobachtet, wobei ΔT niedriger war als bei der Kontrolle, die die Öffnung der Spaltöffnungen zur Verbesserung der Blattkühlung widerspiegelte, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen bei Weizen unter kombiniertem Hitze- und Trockenstress²⁰. Während der Staunässe resultierte der Anstieg von ΔT aufgrund des Stomataverschlusses aus Sauerstoffmangel im Boden und einer Störung der Wurzelwasserhomöostase, wodurch der Transpirationsstrom mit einem Anstieg des ABA, einem Schlüsselhormon für Wasserstressreaktionen, gesenkt wurde⁴⁷.

In Pflanzenstressstudien ist die Dauer des Stresses und der anschließenden Erholungsbehandlungen direkt proportional zur Stressintensität. Zum Beispiel führt moderater Trockenstress, wie z. B. die Aufrechterhaltung der Bodenfeuchtigkeit bei 20 % Feldkapazität (FC), zu reversiblen phänotypischen Veränderungen, die sich in der Regel nach einem einzigen Tag der erneuten Bewässerung erholen. Im Gegensatz dazu führen starke Stressbedingungen wie Staunässe zu umfangreichen phänotypischen Schäden, die eine längere Erholungsphase erforderlich machen. Obwohl die Standardisierung der Behandlungsdauer ideal ist, muss die inhärente Variabilität der Stressintensitäten bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden.

Der zweite wichtige Schritt besteht darin, ein geeignetes Protokoll auszuwählen und die Einstellungen für jeden Sensor zu optimieren. Die Chlorophyllfluoreszenz ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Leistung von Photosyntheseapparaten unter Stress⁴⁸. Je nach Fragestellung und Versuchsdesign können unterschiedliche Chlorophyllfluoreszenz-Messprotokolle mit licht- oder dunkeladaptierten Pflanzen gewählt werden⁴⁹. In dieser Studie ermöglicht das ausgewählte Protokoll (Short Light Response) die Bestimmung verschiedener Merkmale, einschließlich F_v'/F_m', φ_PSII und qL, die die Photosyntheseleistung unter verschiedenen Bedingungen anzeigen⁵⁰. Frühere Studien zeigten, dass das verwendete Protokoll bei der Hochdurchsatz-Phänotypisierung bei der Untersuchung der photosynthetischen Effizienz von Pflanzen unter verschiedenen Anwendungen von Stressbehandlungen und bei der Unterscheidung zwischen gesunden und gestressten Pflanzen wirksam ist^14,20. Basierend auf dem Versuchsdesign ist es sehr wichtig, die Dauer des ausgewählten Protokolls zu berücksichtigen, wenn in einem Hochdurchsatzsystem mit einer hohen Pflanzenpopulation gemessen wird. Daher wurde die Chlorophyllfluoreszenzmessung an lichtadaptierten Pflanzen mit Hilfe eines Kurzzeitprotokolls ausgewählt, um Reaktionen unter verschiedenen Behandlungen zu unterscheiden. Genotyp-Umwelt-Interaktionen können viele phänotypische Merkmale beeinflussen, was bei der Messung entscheidend ist¹². Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass die Dauer der Messung in kurzer Zeit abgeschlossen werden sollte, um den täglichen Effekt auf die Photosyntheseeinschränkungen zu minimieren⁵¹.

Thermische IR-Bildgebung wurde verwendet, um die Temperatur des Kronendachs zu bestimmen und die Stomataregulation unter verschiedenen Behandlungen zu verstehen⁵². Erwähnenswert ist, dass die technologische Optimierung dort eingesetzt wurde, wo sich die Heizwand auf der gegenüberliegenden Seite der Kamera befand und die Temperatur der Wand dynamisch gesteuert und programmierbar war. Daher ist es notwendig, die beheizte Wand mit integrierten Umgebungssensoren anzupassen, um Pflanzen aus dem Hintergrund richtig auszuwählen, indem der Kontrast der Hintergrundtemperatur gegenüber der Temperatur des abgebildeten Objekts erhöht wird.

Obwohl die Bildanalyse automatisiert ist, ist die Anpassung der RGB-Schwellenwertindizes immer noch erforderlich, um eine geeignete binäre Maske in der RGB-Bildgebung zu erhalten, mit der Pflanzen genau ausgewählt^{werden können 53}. Darüber hinaus ist die Wahl mehrerer Blickwinkel wichtig, um quantitative Parameter, einschließlich digitaler Biomasse und Wachstumsrate, angemessen abzuschätzen. In dieser Studie wurden drei Winkel (0°, 120° und 240°) auf der RGB-Seitenansicht ausgewählt und gemittelt, um das Pflanzenvolumen und die relative Wachstumsrate genau zu berechnen.

Je nach Spektralbereich können viele physiologische Merkmale mit Hilfe der hyperspektralen Bildgebung^{untersucht werden 54}. Es muss bestimmt werden, welcher der Reflexionsindizes die notwendigen Informationen liefert und die Reaktion der Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen zeigt¹⁴. Es ist sehr gefragt im Screening auf tolerante Sorten und bei der Phänotypisierung von Pflanzen, um die Korrelation zwischen den hyperspektralen Indizes und anderen physiologischen Merkmalen zu bestimmen⁵⁵. In dieser Studie zeigten Pflanzen, die mit Staunässe behandelt wurden, eine ausgeprägte Reaktion auf den Chlorophyllgehalt und die Photosyntheseeffizienz aus der VNIR-Bildgebung. Darüber hinaus wurden unterschiedliche Reaktionen im Wasserindex beobachtet, der aus der SWIR-Bildgebung unter Wärmebehandlungen und Staunässe berechnet wurde, was auf unterschiedliche Stomataregulationen und Wassergehalte in den Blättern zurückzuführen ist.

Diese Ergebnisse unterstreichen daher den Nutzen eines solchen Ansatzes nach Optimierung der Einstellungen und das Potenzial des Einsatzes mehrerer Sensoren, um für die Klimatoleranz relevante Stressmerkmale zu finden. Die Bewertung der Dynamik der Reaktionen mit mehreren bildgebenden Sensoren kann als eines der mächtigen Werkzeuge zur Verbesserung von Zuchtprogrammen verwendet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1" CMOS-Sensor mit RGB-Kamera	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://psi.cz/	Der Sensor liefert eine Auflösung von 4112 x 4168 Pixeln für die Seitenansicht und 2560 x 1920 Pixel für die Draufsicht. Der Sensor ist extrem empfindlich und stellt einen echten Megapixel-CCD-Ersatz dar und erzeugt scharfe, rauscharme Bilder.
	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	FC1300/8080-15	Pulsamplitudenmoduliertes (PAM) Chlorophyll-Fluorometer
Fluorcam 10 Software	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	Version 1.0.0.18106	Für die Visualisierung und Analyse von Chlorophyllfluoreszenzbildern
GigE PSI RGB – 12,36 Megapixel Kamera	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://psi.cz/	Für die Seitenansichtsprojektionen wurde der Zeilenscan-Modus mit einer Auflösung von 4112 px/Zeile, 200 Zeilen pro Sekunde verwendet. Der abgebildete Bereich aus der Seitenansicht betrug 1205 & mal; 1005 mm (Höhe > Breite), während der abgebildete Bereich von der Draufsicht aus 800 > 800 mm.
Hyperspectral Analyzer Software	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	Version 1.0.0.14	Für die Visualisierung und Analyse von hyperspektralen Bildern
Hyperspektralkamera HC-900 Serie	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://hyperspec.org/products/	Kamera im sichtbaren Nahinfrarot (VNIR) 380-900 nm mit einer spektralen Auflösung von 0,8 nm FWHM
Hyperspektralkamera SWIR1700	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://hyperspec.org/products/	Kurzwellige Infrarotkamera (SWIR) Kamera 900 - 1700 nm mit einer spektralen Auflösung von 2 nm FWHM
InfraTec Wärmebildkamera (VarioCam HEAD 820(800))	Flir,  USA	https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/	Auflösung von 1024 x 768 Pixeln, thermische Empfindlichkeit von < 20 mK und thermischer Emissionsgrad auf 0,95 eingestellt, mit einer Scangeschwindigkeit von 30 Hz und einer Länge von 768 Pixeln pro Zeile. Der abgebildete Bereich betrug 1205 & mal; 1005 mm (Höhe & Zeiten; Breite).
LED-Panel	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://led-growing-lights.com/products/	Ausgestattet mit 4 > 240 rot-orangefarbenen (618 nm), 120 kalt-weißen LEDs (6500 K) und 240 dunkelroten LEDs (735 nm) gleichmäßig verteilt über einen Abbildungsbereich von 80 > 80 cm
Licht-, Temperatur- und relative Feuchtesensoren	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://psi.cz/	Sensoren zur Überwachung der kontrollierten Bedingungen im Gewächshaus
MEGASTOP Blue Matten	Friedola	75831	Zur Abdeckung von Bodenoberflächen
Morphoanalyzer Software	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	Version 1.0.9.8	Für die Visualisierung und Analyse von RGB-Bildern sowie die Analyse der Farbsegmentierung
PlantScreen Data Analyzer Software (Version 3.3.17.0)	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Zur Visualisierung und Analyse der Daten aller bildgebenden Sensoren  Bewässerungs-Wiegeeinheit und der Umgebungsbedingungen im Gewächshaus
PlantScreen Modulares System	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Art der Phänotypisierungsplattform
Plantscreen Scheduler Software	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	Version 2.6.8368.25987	Zur Planung des Experiments und zur Einstellung des Messprotokolls
SpectraPen MINI	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details	Belichtungsmesser zum Einstellen des Lichtverhältnisses auf einer Haubenwaage
TOMI-2 hochauflösende Kamera	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/	Auflösung von 1360 > 1024 Pixel, Bildrate 20 fps und 16-Bit-Tiefe) mit einem 7-Positionen-Filterrad ist auf einem Roboterarm montiert, der in der Mitte des mehrfarbigen LED-Lichtpanels mit den Abmessungen 1326 x 1586 mm positioniert ist.
Begehbare FytoScope-Wachstumskammer	PSI, Drá sov, Tschechische Republik	https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/	Art der Kammern, in denen die Pflanze angebaut wird