Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen

Adjuvantien werden häufig eingesetzt, um die Wirksamkeit eines Impfstoffs zu erhöhen, indem sie das Immunsystem dazu anregen, stärker auf den Impfstoff zu reagieren, wodurch die Immunität gegen einen bestimmten Erreger erhöht^{wird 1}. Nanoemulsion (NE)-Adjuvans bezieht sich auf ein kolloidales Dispersionssystem mit thermodynamischer Stabilität, indem es einen bestimmten Anteil der Ölphase und der wässrigen Phase emulgiert, um eine Emulsion in Form von Wasser-in-Öl (W/O) oder Öl-in-Wasser (O/W)² zu erzeugen. O/W-Nanoemulsions-Adjuvans können Zytokine und Chemokine an der Injektionsstelle produzieren, die schnelle Aggregation und Proliferation wichtiger Immunzellen wie Monozyten, Neutrophile und Eosinophile induzieren, die Immunantwort verstärken und die Immunogenität von Antigenen verbessern³. Derzeit sind drei Nanoemulsions-Adjuvantien (MF59, AS03 und AF03) für die Verwendung in Impfstoffen zugelassen und haben eine gute Sicherheit und Wirksamkeit gezeigt⁴.

Die Immunität der Schleimhäute wurde jedoch durch die derzeit zugelassenen adjuvanten Formulierungen bei der konventionellen parenteralen Impfung nur unzureichend berücksichtigt⁵. Es wurde berichtet, dass Retinsäure (RA) das intestinale Homing von Immunzellen induziert, aber ihre niedrige Polarität, ihre schlechte Löslichkeit in Wasser und ihre schlechte Licht- und Wärmestabilität schränken ihre Verwendung für eine robuste enterische Impfung ein. Nanoemulsionen bieten die Möglichkeit, die Bioverfügbarkeit von hochlipophilen Arzneimitteln zu erhöhen, und der Ölkern von O/W-Emulsionsadjuvantien eignet sich zum Auflösen von unpolaren Substanzen wie RA⁶. Daher können Nanoemulsionen als Träger für RA verwendet werden, um den dualen Response-Effekt von systemischer Immunität und Schleimhautimmunität zu erzielen.

Im Vergleich zu neutralen oder anionischen Verabreichungssystemen weisen kationische Verabreichungssysteme relativ effiziente Antigenverkapselungs- und -abgabefähigkeiten auf, die die Immunogenität von Antigenen verbessern können ^7,8,9. Die kationische Oberflächenladung einer Vielzahl von adjuvanten Systemen ist wichtig für ihre adjuvante Wirkung 10,11,12. Die kationische Ladung ist ein wichtiger Faktor bei der Verlängerung der Retention des Impfstoffs an der Injektionsstelle, der Erhöhung der Antigenpräsentation und der Verlängerung der Stimulation der zellulären Immunität im Körper¹².

Basierend auf den oben genannten Überlegungen haben wir eine kationische Nanoemulsion entwickelt, um RA und Antigene effektiv gemeinsam zu liefern. Die Partikelgröße und das Zetapotenzial der Nanoemulsion wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt, und die systemischen und mukosalen Immunantworten der Nanoemulsion in Kombination mit OVA wurden durch intramuskuläre Injektion bewertet¹³.

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt und von der Kommission für den Schutz und die Ethik von Versuchstieren der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.

1. Herstellung von Nanoemulsionen (NEs)

1. Für die Herstellung in der wässrigen Phase werden 0,15 g Polysorbat 80 in 28,2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Rühren bei 40 °C gelöst.
2. Für die Vorbereitung der Ölphase ist die Ölphasenformulierung der Nanoemulsion zu verwenden, die in Tabelle 1 gezeigt ist. Das Sornitantrileat 85, DOTAP und RA in Squalen unter Rühren bei 40 °C auflösen.
3. Für die Herstellung der primären O/W-Emulsion rühren Sie die Ölphase magnetisch bei 1400 U/min, während Sie das wässrige langsam und tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugeben. Das Gemisch mit einem High-Shear-Emulgator bei 30.000 U/min für 6 min voremulgieren.
4. Für die Hochdruckhomogenisierung (HPH) wird die oben hergestellte primäre O/W-Emulsion mit einem Hochdruck-Homogenisator für 12 Zyklen bei 900 bar behandelt, um eine homogene Nanoemulsion im Bereich von 160 bis 190 nm zu erhalten.
5. Am Ende des Prozesses wird die Emulsion in einem 50-ml-Kolben aufgefangen und die Emulsion durch eine 0,2 μm PES-Filtermembran filtriert.
6. Verbinden Sie den Kolben durch den Katheter mit der Schlenk-Leitung, drehen Sie den Dreiwegehahn, um das System mit der Vakuumröhre zu verbinden, und schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um ein Vakuum im Kolben zu erzeugen. Drehen Sie dann den Dreiwegehahn, schließen Sie das System an das Argonrohr an und füllen Sie es mit Argon. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x, um sicherzustellen, dass der Kolben mit Argon gefüllt ist.
7. Den Korken wieder aufsetzen und mit einer Paraffinfolie verschließen, den Kolben in Alufolie einwickeln und bei 4 °C lagern.

2. Charakterisierung der Nanoemulsionen

1. Detektion von Partikelgröße und Zetapotenzial
   1. Schalten Sie das Gerät ein und warten Sie 30 Minuten, bis sich die Laserlichtquelle stabilisiert hat.
   2. Verdünnen Sie den NE 50-fach mit Reinstwasser und geben Sie 1 mL Probe in die entsprechende Probenzelle.
   3. Um die Partikelgröße zu messen, stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein, wählen Sie Wasser als Dispergiermedium und wählen Sie Einweg-Kunststoffschalen als Messzelle. Laden Sie die Proben und messen Sie automatisch. Geben Sie den Mittelwert von drei wiederholten Messungen für jede Probe als Endergebnis an.
   4. Für die Messung des Zetapotenzials stellen Sie die Temperatur auf 25 °C ein. Aufgrund der Wahl der wässrigen Phase als Dispersionsmedium ist das Smoluchowsi-Modell und die gefaltete Kapillarzelle als Messzelle zu wählen. Laden Sie die Proben und messen Sie automatisch. Geben Sie den Mittelwert von drei Wiederholungsmessungen für jede Probe als Endergebnis an.
2. Bestimmung der Verkapselungsrate und der Wirkstoffladerate
   1. Um die Menge an RA zu bestimmen, die in der NO geladen ist, verwenden Sie absolutes Ethanol, um die RA aus der NO zu demulgieren und zu extrahieren. Zu 5 μl Probe werden 995 μl Ethanol hinzugefügt und der RA-Gehalt der Lösung mit einem Spektralphotometer bei 355 nm bestimmt. Vergleichen Sie die Extinktion mit einer Standardkurve. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
      Verkapselung = tatsächliche RA-Belastung/Gewicht des zugesetzten Arzneimittels
      Wirkstoffladerate = tatsächliche RA-Beladung / Probenqualität

3. Impfverfahren und Probenentnahme

1. Impfverfahren und Gruppierung
   1. Gruppe weiblicher Balb/C-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von etwa 18-21 g in 5er-Sets zur Immunisierung an Tag 0, Tag 14, Tag 28 gemäß den folgenden Versuchsgruppen: (1) PBS-Gruppe, (2) Eieralbumin (OVA)-Gruppe, (3) OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA)-Gruppe, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA)-Gruppe.
   2. Immunisieren Sie alle Mäuse durch intramuskuläre Injektion in die oberen Quadrizepsmuskeln mit 200 μl verschiedener Impfstoffformulierungen: 100 μl Emulsion und 15 μg OVA absorbiert in 100 μl PBS, gemischt vor der Verabreichung. Injizieren Sie 100 μl/Hinterbein. Bei Mäusen in der Kontrollgruppe ist PBS allein zu verabreichen.
   3. Euthanasie: Alle Mäuse werden 2 Wochen nach Abschluss der drei Impfungen durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1 % Natrium-Pentobarbital eingeschläfert.
   4. Probenentnahme und -verarbeitung: Nach der Euthanasie wird die Brust von Mäusen mit einer Schere aufgeschnitten und eine Spritze direkt in das Herz eingeführt, um etwa 0,5 ml Vollblut abzusaugen. Lassen Sie das Blut 2 h bei Raumtemperatur stehen und zentrifugieren Sie es dann bei 1800 x g für 5 min bei 4 °C. Serum sammeln, aliquotieren und zur weiteren Analyse bei -80 °C lagern.
   5. Sammeln Sie Vollblut, Milz, vaginale Spülflüssigkeit (VLF), bronchoalveoläre Spülflüssigkeit (BALF), Nasenspülflüssigkeit (NLF) und Dünndarmspülflüssigkeit (SILF).
2. Isolierung von Milz-Lymphozyten
   1. Weichen Sie die Mäuse für eine kurze Sterilisation zu 75 % (v/v) in Ethanol ein und bringen Sie die Mäuse auf eine saubere Bank. Schneiden Sie die Haut am linken Bauch mit einer Schere ein, legen Sie die Milz frei und entfernen Sie sie.
   2. Legen Sie die Milz in eine Petrischale mit 3 mL PBS, mahlen und filtrieren Sie sie mit einem Sieb (200 Mesh, 70 μm) und einem Mahlstab in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 650 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und den Niederschlag mit 3 mL Lyselösung für rote Blutkörperchen suspendieren, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Geben Sie 10 mL PBS in das Röhrchen und schütteln Sie es gut, um die Reaktion zu beenden, und zentrifugieren Sie es dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 650 x g .
   5. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml PBS, geben Sie 20 μl der Zellverdünnung zur Zellzählung in den automatisierten Zellzähler.
   6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 650 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und die Zellen auf 1 x 10⁶ Zellen/ml mit 1640 Vollmedium (1 % Penicillin-Streptomycin, 10 % fötales Rinderserum) verdünnen.
3. VLF-Entnahme: Die Vagina 4x mit 75 μl 1%BSA/PBST spülen, die Spüllösung mischen und in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen auffangen, bei 5000 x g bei 4 °C für 20 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette auffangen und bei -80 °C lagern.
4. BALF- und NLF-Kollektion
   1. Desinfizieren Sie die Mäuse nach der Tötung mit 75% (v/v) Ethanol. Halte den Mäusebauch nach oben und richte den Hals auf. Machen Sie mit einer Schere einen Längsschnitt in die Haut des Maushalses und verwenden Sie eine Pinzette, um die Muskeln zu trennen und die Luftröhre angemessen freizulegen.
   2. Schneiden Sie die Luftröhre durch eine kleine Queröffnung und führen Sie den Schlauch in Richtung Lunge ein, befestigen Sie die Spritze am Schlauch und injizieren Sie 0,5 mL PBS in die Lunge und ziehen Sie sie zurück, spülen Sie 3x wiederholen und zentrifugieren Sie bei 650 x g bei 4 °C für 5 min, lagern Sie den Überstand (BALF) bei -80 °C.
   3. Drehen Sie den Schlauch in die Nasenhöhle, befestigen Sie die Spritze am Schlauch und injizieren Sie 0,5 mL PBS, die Flüssigkeit fließt durch die Nasenhöhle in das 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Saugen Sie die Wäsche aus dem Zentrifugenröhrchen an und wiederholen Sie das Spülen 2x, zentrifugieren Sie dann bei 650 x g bei 4 °C für 5 min, lagern Sie den Überstand (NLF) bei -80 °C.
5. SILF-Kollektion
   1. Bereiten Sie eine PBS-Lösung vor, die 0,1 mg/ml Trypsin-Inhibitor, 50 mM/l EDTA-2Na, 1 mM/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) als Dünndarmspüllösung enthält. Bei Raumtemperatur umrühren, bis sie sich auflösen, und bei 4 °C lagern.
   2. Schneiden Sie den Dünndarm entlang des Darmschlauchs auf und tauchen Sie ihn in 3 ml Dünndarmspülflüssigkeit. Durch vertikales Schütteln bei 15 U/min für 30 min bei 4 °C mixen. Bei 1440 x g bei 4 °C für 20 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette auffangen, dann bei 5000 x g bei 4 °C für 20 min zentrifugieren. Lagern Sie den Überstand (SILF) bei -80 °C.

4. Bewertung der OVA-spezifischen Antikörperantwort nach intramuskulärer Verabreichung

1. Bestimmung der Serumspiegel von IgG, Unterklassen von IgG1, IgG2a und der spezifischen sIgA-Spiegel in VLF, BALF, NLF und SILF mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
2. Für die Antigenbeschichtung verdünnen Sie OVA auf 5 μg/ml mit Beschichtungspuffer und beschichten Sie 96-Well-ELISA-Platten über Nacht bei 4 °C mit 100 μl OVA-Lösung pro Well.
3. ELISA Platten 5x mit PBST waschen und durch Inkubation mit 250 μl 1%BSA/PBST bei 37 °C für 2 h blockieren.
4. Die ELISA-Platten werden 5x mit PBST gewaschen, dann 100 μl der zu testenden Probe wie unten beschrieben verdünnt zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Verdünntes Serum, VLF, BALF, NLF mit 0,5 % BSA/PBST, verdünntes SILF mit 20 % fötalem Kälberserum (FCS)/PBST.
   1. Beginnen Sie mit der 1000-fachen Verdünnung des Serums in einem zweistufigen Verdünnungsverfahren: Verdünnen Sie 20 μl Serum auf 1 ml, verdünnen Sie dann 25 μl dieses verdünnten Serums auf 500 μl. Verwenden Sie diese Verdünnung des Serums zum Nachweis von IgG1, IgG2a.
5. Geben Sie 200 μl des 1000x verdünnten Serums in die erste Reihe der beschichteten Platte und geben Sie 100 μl 0,5 % BSA/PBST in alle Vertiefungen außer der ersten Reihe. Übertragen Sie 100 μl von der ersten Reihe in die zweite Reihe und mischen Sie 10x mit der Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt bis Reihe 8 und verwerfen Sie 100 μl Flüssigkeit, das Serum wurde für den Nachweis von IgG in unterschiedlichen Konzentrationen erhalten.
6. Führen Sie eine 1:1-Verdünnung von BALF, NLF und SILF durch, um IgA nachzuweisen. Verwenden Sie für VLF das gleiche Verdünnungsverfahren wie für Serum.
7. ELISA Platten 5x mit PBST waschen. 100 μl HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgG/IgG1/IgG2a/IgA (verdünnt 1:10000 mit PBST) in die entsprechenden Vertiefungen geben und 40 min bei 37 °C inkubieren.
8. Waschen Sie die ELISA-Platten 5x mit PBST, fügen Sie 100 μl TMB ELISA-Substrat (hochempfindlich) hinzu und stellen Sie die Platte für 5 min an einen lichtgeschützten Ort. Geben Sie sofort 100 μl 450 nm Stopplösung für das TMB-Substrat hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
9. Messen Sie die Absorption (OD) bei 450 nm für jede Vertiefung und berechnen Sie den Antikörpertiter, indem Sie das 2,1-fache des Serumwerts der Maus der Blindgruppe als positiven Ansprechwert verwenden.

5. ELISpot-Assay

1. Befolgen Sie die Richtlinien für ELISpot Plus und verwenden Sie Maus-IFN-γ (ALP) aus dem Kit, um die Assays durchzuführen.
2. Nehmen Sie die Platte aus der versiegelten Packung und waschen Sie sie 4x mit sterilem PBS (200 μl/Well). Konditionieren Sie die Platte mit 1640 vollständigem Medium (200 μl/Well) und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie das Medium und geben Sie die eingestellte Konzentration der in Schritt 3.2.2 hergestellten Lymphozytensuspension (100 μl/Well) auf die Platte, dann fügen Sie 100 μl des Stimulus hinzu, d. h. 1640 vollständiges Medium mit 20 μg/ml OVA257~264 oder OVA323~339 oder 1640 vollständiges Medium. Stellen Sie die Platte für 48 h bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen befeuchteten Inkubator. Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein, um Verdunstung zu vermeiden.
4. Entsorgen Sie die Zellsuspension und waschen Sie die Platte 5x mit PBS (200 μl/Well). Verdünnen Sie den Nachweisantikörper (R4-6A2-Biotin) auf 1 μg/ml in PBS, das 0,5 % fötales Kälberserum (PBS-0,5 % FCS) enthält. 100 μl/Vertiefung zugeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Waschen Sie die Platte wie in Schritt 5.2. Streptavidin-ALP (1:1000) in PBS-0,5%FCS verdünnen und 100 μl/Vertiefung zugeben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Waschen Sie die Platte wie in Schritt 5.2. Die gebrauchsfertige Substratlösung (BCIP/NBT-plus) durch einen 0,45 μm Filter filtrieren und 100 μl/Well zugeben. Entwickeln, bis deutliche Flecken entstehen.
7. Stoppen Sie die Farbentwicklung, indem Sie ausgiebig in Leitungswasser waschen, den weichen Kunststoff entfernen und die Platte trocknen lassen.
8. Untersuchen und zählen Sie Spots in einem ELISpot-Reader.

6. Statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Daten von 4 Gruppen durch unidirektionale ANOVA, gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleich nach dem Test. Geben Sie alle Ergebnisse als Mittelwert ± SD aus. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Insgesamt wurden vier Nanoemulsionsformulierungen hergestellt, die sich durch ihre Partikelgröße (Abbildung 1), ihr Zetapotenzial und ihre Verkapselungseffizienz auszeichneten, wie in Tabelle 2 dargestellt. Die Partikelgröße konzentrierte sich auf etwa 160-190 nm und die Zugabe von DOTAP kehrte das Zetapotenzial der Nanoemulsion um. OVA-spezifisches Serum-IgG und seine Untergruppen-Antikörperspiegel im Serum wurden 2 Wochen nach der dritten Immunisierung nachgewiesen. Der adjuvante Nanoemulsionsimpfstoff erhöhte signifikant die OVA-spezifischen IgG-, IgG1- und IgG2a-Antikörpertiter im Serum (Abbildung 2). Noch wichtiger ist, dass die spezifischen sIgA-Spiegel in der vaginalen Spülflüssigkeit und der Dünndarmspülflüssigkeit signifikant erhöht waren, wenn die OVA mit CNE-RA adjuvantiert wurde (Abbildung 3). Im ELISpot-Assay wurden keine signifikanten Flecken gefunden.

Abbildung 1: Größendurchmesser und Verteilung. (A) Größendurchmesser und Verteilung von NE-RA. (B) Größe, Durchmesser und Verteilung von CNE-RA. d.nm ist der mittlere Durchmesser der Partikel in nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: OVA-spezifisches Serum-IgG und seine Untergruppe Antikörperspiegel im Serum. Das OVA-spezifische Serum-IgG und seine Untergruppen-Antikörperspiegel im Serum 2 Wochen nach Abschluss der drei Impfungen waren abgeschlossen. (A) Log2-Wert der IgG-Titer. (B) Optische Dichte von IgG1 bei 450 nm. (C) Optische Dichte von IgG2a bei 450 nm. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n=5), ***: P<0,001 ausgedrückt. Vergleiche der Unterschiede zwischen den Gruppen und der PBS-Gruppe sind direkt über den Spalten in der Abbildung dargestellt und werden wie folgt angegeben: ns: keine Signifikanz, #p<0,05, ###p<0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: OVA-spezifisches sIgA. OVA-spezifisches sIgA in vaginaler Spülflüssigkeit, bronchoalveolärer Spülflüssigkeit, Nasenspülflüssigkeit, Dünndarmspülflüssigkeit. (A) Vaginalspülflüssigkeit, (B) bronchoalveoläre Spülflüssigkeit, (C) Nasenspülflüssigkeit und (D) Dünndarmspülflüssigkeit. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n=5), ns: keine Signifikanz, *p<0,05; S<0.001. Vergleiche der Unterschiede zwischen den Gruppen und der PBS-Gruppe sind direkt über den Spalten in der Abbildung dargestellt und werden wie folgt angezeigt: ns: keine Signifikanz, ###p<0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Die Ölphasenformulierung von NEs.

Tabelle 2: Physikalisch-chemische Eigenschaften von NEs.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit haben.