Eine neue intraperitoneale (IP) Injektionsmethode bei adulten Zebrafischen wird beschrieben. Beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin ist dieses Verfahren wirksamer als die beiden bisher berichteten IP-Methoden. Die Technik ist so konzipiert, dass sie von Forschern mit begrenzter Erfahrung im Zebrafischmodell leicht übernommen werden kann.
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Methodenartikel
Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der erwachsene Zebrafisch (Danio rerio), der genetisch zugänglich ist, wird als wertvolles Wirbeltiermodell zur Erforschung menschlicher Erkrankungen wie der Kardiomyopathie eingesetzt. Die intraperitoneale (IP) Injektion ist eine wichtige Methode, die dem Körper Verbindungen zuführt, um entweder therapeutische Wirkungen zu testen oder Krankheitsmodelle wie die Doxorubicin-induzierte Kardiomyopathie (DIC) zu erstellen. Derzeit gibt es zwei Methoden der IP-Injektion. Beide Methoden haben Grenzen beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin, die zu Nebenwirkungen führen, die sich in schweren Schäden an der Körperform und dem Tod der Fische äußern. Während diese Mängel durch eine umfangreiche Schulung der Prüfärzte überwunden werden könnten, ist eine neue IP-Injektionsmethode mit minimalen Nebenwirkungen wünschenswert. Hier wird über eine einzigartige IP-Injektionsmethode berichtet, die in der Lage ist, mit toxischen Verbindungen umzugehen. Eine dauerhaft verminderte Herzfunktion kann die Folge sein, ohne dass es zu einem nennenswerten Fischsterben kommt. Die Technik kann von Forschern, die nur wenig Erfahrung mit erwachsenen Zebrafischen haben, leicht gemeistert werden.
Einleitung
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat als experimentelles Modell für die Erforschung menschlicher Krankheiten Aufmerksamkeit erregt, da dieses Tier eine hohe Gen- und Organhomologie zum Menschen, externe Befruchtung, einfache genetische Manipulation und Körpertransparenz bis in die frühe Reife umfasst, was eine Vielzahl von bildgebenden Anwendungen ermöglicht1. Im Gegensatz zu dem einfachen Prozess, Medikamente für Zebrafischembryonen und -larven direkt ins Wasser zu bringen, stellt die Verabreichung von Medikamenten an erwachsene Zebrafische ein komplizierteres und herausfordernderes Unterfangendar 2.
Bei erwachsenen Fischen können Verbindungen durch passive Wirkstoffverabreichungstechniken wie die direkte Verabreichung ins Wasser oder durch orale Wirkstoffverabreichungsmethoden wie Gavaging2 abgegeben werden. Andere Ansätze umfassen das Beschichten von Fischfutter mit den Verbindungen und das anschließende Füttern der Fische3 und die direkte Verabreichung von wasserunlöslichen Medikamenten in einer vorgegebenen Konzentration, einschließlich retroorbitaler oder intraperitonealer Injektionen 4,5. Die intraperitoneale Verabreichung wird aufgrund ihrer ausgeprägten pharmakokinetischen Vorteile für In-vivo-Studien von Krankheitsmodellen bevorzugt6. Diese Methode bietet eine hohe Wirkstoffkonzentration und eine verlängerte Halbwertszeit in der Peritonealhöhle und bietet damit einen effektiven Weg für die Wirkstoffabgabe 7,8. Der Ansatz wird häufig in Forschungsumgebungen verwendet, um eine optimale Wirkstoffabsorption und -verteilung zu gewährleisten 9. Während sich injektionsbasierte Methoden bei der einmaligen Verabreichung als effizient erweisen, führen längere und wiederholte Injektionen häufig zu Körperschäden und chronischen Infektionen2.
Derzeit gibt es zwei Methoden der IP-Injektion bei adulten Zerbafischen 4,10. Beide Methoden haben jedoch Einschränkungen bei der Verabreichung von toxischen Verbindungen wie Doxorubicin, was zu schweren Schäden an der Körperform und zum Fischsterben führt. Die Nebenwirkungen können die Interpretation der Daten erheblich erschweren. Obwohl diese Herausforderungen mit umfangreichen Schulungen angegangen werden können10, besteht ein klarer Bedarf an einer neuen IP-Injektionsmethode, die Nebenwirkungen minimiert.
Unser Ziel ist es, eine neue Methode der IP-Injektion zu entwickeln, die für die effektive Verabreichung von Doxorubicin an erwachsene Zebrafische optimiert ist und die Generierung zuverlässiger Doxorubicin-induzierter Kardiomyopathie (DIC)-Modelle mit minimierter Körperschädigung und damit verbundener Mortalität ermöglicht.
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Protokoll
Alle durchgeführten Verfahren wurden vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und hielten sich an die Standards, die im "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (National Academies Press, 2011) dargelegt sind. Alle Zebrafische in der Studie gehören zum Stamm des Wild Indian Karyotype (WIK). Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für die Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Zubereitung und Lagerung von Doxorubicin-Stammlösung
- Beziehen Sie den Doxorubicin-Bestand aus einer kommerziellen Quelle.
HINWEIS: Doxorubicin ist lichtempfindlich, also erwerben Sie es in Pulverform und lagern Sie es in undurchsichtigen Behältern, um es vor Lichteinwirkung zu schützen. Führen Sie alle Schritte für die Dox-Pulveraufbereitung in einer chemischen Haube durch. - Das Dox-Pulver wird vollständig in destilliertem Wasser aufgelöst und eine Stammlösung mit einer Endkonzentration von 5 mg/ml hergestellt.
- Aliquotieren Sie den Stamm, indem Sie ihn in 1,5-ml-Röhrchen aufteilen.
- Wickeln Sie die Röhren in Alufolie ein, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen.
- Die aliquote Dox-Lösung ist bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung (<1 Monat) oder -20 °C für die Langzeitlagerungzu lagern 10.
2. Gruppierung der Fische nach ihrem Körpergewicht
- Gruppieren Sie die Fische mit einer BW-Differenz von weniger als 10 % für die anschließende Injektion.
HINWEIS: Um in dieser Phase Aufwand zu sparen, werden Fische mit einer BW-Abweichung von weniger als 10 % als gleich groß kategorisiert. - Lassen Sie den Fisch vor der Injektion 24 Stunden nüchtern.
- Betäuben Sie den Fisch 1 Minute lang mit Embryonenwasser, das 0,16 mg/ml Tricain enthält.
- Nehmen Sie den Fisch mit Tricain aus dem Wasser und tupfen Sie beide Seiten des Fischkörpers mit sauberem Filterpapier ab, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
- Messen und protokollieren Sie den BW jedes Fisches und setzen Sie den Fisch dann umgehend in einen Auffangbehälter zurück, der mit frischem Systemwasser gefüllt ist.
HINWEIS: Die Dox-Injektion wurde bei Fischen nach Erreichen des 3. Lebensmonats durchgeführt. In dieser Studie verwendeten die Forscher 3 Monate bis 10 Monate alte Fische. Die BWs von ausgewachsenen Zebrafischen des WIK-Stammes können zwischen 0,2 g und 0,5 g variieren. Eine verlängerte Narkose von mehr als 5 Minuten, gefolgt von einer Dox-Injektion, führte zu einer hohen Fischsterblichkeit.
3. Vorbereitung der Nadel und Station für die Injektion
- Bestimmen Sie das Injektionsvolumen der Dox-Stammlösung (z. B. 5 mg/ml), das für jeden Fisch auf der Grundlage des durchschnittlichen Körpergewichts erforderlich ist, um die Zieldosis von 20 μg/g zu erreichen.
- Verwenden Sie die folgende Formel, um das Einspritzvolumen zu berechnen:
- Fügen Sie 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) hinzu, um die in Schritt 1 für die Injektion berechnete Dox-Lösung zu verdünnen, bis ein Gesamtvolumen von 5 μl erreicht wird.
HINWEIS: Verwenden Sie die Schüttlösung für jede Gruppe von Fischen basierend auf ihrem BW und schließen Sie weitere 3 Fische in jede Gruppe ein, um sicherzustellen, dass es im Verlauf des Experiments keinen Mangel an Injektionslösung gibt. - Klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen und zentrifugieren Sie dann kurz mit Höchstgeschwindigkeit, um die Lösung 10 s lang bei Raumtemperatur zu sammeln.
- Legen Sie die vorbereitete Lösung auf Eis und schützen Sie sie vor Lichteinwirkung.
- Stellen Sie eine saubere 100-mm-Petrischale mit einem Schwamm unter ein Präpariermikroskop und stellen Sie dann den Fokus ein.
HINWEIS: Der Schwamm enthält eine 4 cm lange Rille. Das elastische Zurückziehen des Schwamms gibt dem Fisch Halt und hält den Fischkörper in Position. Der Schwamm kann wiederverwendet werden. - Rüsten Sie eine 10-μl-Mikrospritze mit einer abgeschrägten 34-G-Nadel aus.
- Spülen Sie die Nadel mit 1x HBSS-Puffer, um Blasen zu beseitigen und mögliche Verstopfungen aus der Spritze zu entfernen.
- Messen Sie 5 μl der in Schritt 4 für die Injektion vorbereiteten Lösung.
4. Verfahren der IP-Dox-Injektion
- Legen Sie den erwachsenen Fisch 1 Minute lang mit 0,16 mg/ml Tricain in Wasser, um einen Zustand der Bewusstlosigkeit herbeizuführen.
- Positionieren Sie den Fisch in der Rille des eingebetteten Schwamms mit dem Bauch nach oben (Abbildung 1A).
- Führen Sie die Nadel mit einem Winkel nahe 0° ein, beginnend vom Mittelpunkt der Brustflosse in Richtung der hinteren Seite der Herzhöhle (Abbildung 1B).
HINWEIS: Vermeiden Sie während des Eingriffs jeglichen Kontakt mit dem Herzen. - Richte die Nadel auf den Schwanz und gehe unter die silberne Haut.
HINWEIS: Positionieren Sie die Nadel in unmittelbarer Nähe der Silberhaut und achten Sie darauf, dass keine Kratzer oder Löcher entstehen. - Überwachen Sie die Nadelspitze in der Bauchhöhle während der gesamten Operation (Abbildung 1C).
HINWEIS: Vermeiden Sie Schäden an Leber, Darm, Schwimmblase und anderen Organen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel das Ende des Darms in der Nähe des Foramen kloakale erreicht. - Geben Sie die 5 μl Dox-Lösung allmählich und gleichmäßig ab und ziehen Sie die Nadel dann langsam entlang des ursprünglichen Weges zurück, um ein Auslaufen zu verhindern (Abbildung 1D).
- Überwachen Sie die Bauchhöhle auf das Vorhandensein von Dox, indem Sie eine rote Färbung der Dox-Lösung beobachten (Abbildung 1E).
- Bringen Sie den injizierten Fisch schnell in ein sauberes Kreuzungsbecken, das mit frischem Systemwasser gefüllt ist, damit sich der Fisch erholen kann.
HINWEIS: Spülen Sie die Nadel zwischen den Injektionen einmal mit 1x HBSS-Puffer.
5. Fischmanagement nach der Injektion
- Bringen Sie den Fisch nach der Injektion mit Zirkulation wieder in das System zurück.
- Fasten Sie alle injizierten Fische für weitere 24 Stunden, um ihre Genesung zu erleichtern.
- Behalten Sie in der ersten Woche die Fische genau im Auge. Entfernen Sie die verstorbenen Fische so schnell wie möglich, um eine Infektion der anderen Fische zu vermeiden.
HINWEIS: Der Tod von Fischen innerhalb der ersten 24 Stunden ist wahrscheinlich auf körperliche Verletzungen durch die Injektion oder eine längere Anästhesie zurückzuführen. Erfassen Sie die Anzahl der Fische, um eine Überlebenskurve zu erstellen. - Führen Sie eine Echokardiographie durch, um den Dox-injizierten Fisch 56 Tage nach der Injektion zu phänotypisieren11.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Bedingungen und Verfahren für die entsprechende Kontrollgruppe, der HBSS-Lösung injiziert wurde, einheitlich sind.
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Ergebnisse
Bisher wurden zwei intraperitoneale (IP) Methoden zur Verabreichung von Doxorubicin bei adulten Zebrafischen eingesetzt 4,10. Bei Methode I, auch bekannt als klassische IP-Injektionsmethode, wie von Kinkel et al.4 beschrieben, wurde die Nadel in einem 45°-Winkel zur Mittellinie zwischen den Beckenflossen mit dem Bauch nach oben eingeführt. Bei Methode II oder der alternativen IP-Injektionsmethode, wie sie von Ma et al.10<...
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Diskussion
Anders als die beiden bestehenden IP-Injektionsverfahren 4,10 zeichnet sich das neue IP-Injektionsverfahren durch folgende Besonderheiten aus. Zunächst wird ein einzigartiger Nadeleinstichwinkel verwendet (nahe Null); Zweitens dringt die Nadel über eine einzigartige Stelle, d.h. ein natürliches Loch auf der Bauchoberfläche eines Fisches, in den Fisch ein, was die Injektion erleichtern würde; Und schließlich bewegt sich die Nadel von anterior nach posteri...
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Danksagungen
Diese Studie wurde von den NIH (HL107304 und HL081753) und der Mayo Foundation (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) bis X.X. J.L. wird von den Fundamental Research Funds for the Central Universities der Central South University, Nr. 56021702, finanziert. Besonderer Dank geht an Beninio Gore und Quentin Stevens für die Leitung der Zebrafischanlage.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 μ L NanoFil-Spritze | World Precision Instruments, Inc | NANOFIL | Injektionswerkzeug |
| 34 G Nadel | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | Einführwerkzeug |
| 60 mm Petrischale | Fisher Scientific/Fisherbrand | FB0875713A | Platzieren des Schwamms |
| Präpariermikroskop | Nikon | SMZ800 | Injektion des Dox |
| Doxorubicinhydrochlorid | Sigma | D1515-10MG | Arzneimittels zur Erstellung eines DIC-Modells |
| Echokardiographie | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | Messung der Herzfunktion |
| Schaumschwamm | Jaece Industries | L800-D | Platzieren des Fisches |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Vehikel für |
| southernlabware | MyFuge/C1012 | sammelt die Dox-Lösung | |
| Präzisionswaage | Torbal | AD60 | Digitalwaage |
| Tricain | Argent | MS-222 | Betäubungsmittel für Fische |
| Tube | Eppendorf | 1,5 mL | Lagerung |
| vevo LAB software | FUJIFILM VISUAL SONICS | 5.6.0 | Quantifizierung des Herzens |
Referenzen
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