Name: Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri saggi comportamentali per valutare deficit locomotori, apprendimento e memoria in Drosophila melanogaster. Questi metodi aiutano a studiare la neurodegenerazione e le basi genetiche delle malattie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Charles Luetje per la fornitura del T-labirinto e la sala comportamento. Questo lavoro è supportato dalla American Heart Association (a YA), l&#39;Istituto Nazionale per il Disturbo neurologici e colpo di Grant R01NS64269 (a RGZ), e Pew Charitable Trust (a RGZ).

1. Introduzione In questo video, ci mostrerà due saggi comportamentali utilizzando Drosophila per dimostrare la misura di locomozione e le funzioni di apprendimento e memoria che sono compromesse nei disordini neurodegenerative. In primo luogo, mostreremo come il comportamento motorio può essere misurata con il test negativo geotassi. In secondo luogo, si valuterà la capacità di apprendimento e la memoria vola utilizzando positivamente phototactic che sono addestrati ad associare la luce con un gusto amaro avversivo e poi testato 6 ore dopo per valutare le funzioni di memoria. Infine, si discutono le implicazioni ei limiti di questi test comportamento. 2. Attrezzature e reagenti <ol><li> Vola lavoro <ul><li> Ambito stereo (Zeiss) </li><li> Pennelli piccoli per spingere le mosche </li><li> Drosophila anidride carbonica (CO 2) dell'apparecchio di anestesia (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Geotassi test negativo <ul><li> 28,5 x 95 polistirolo Vial mm (Capitol Vial, Inc.) </li><li> Mini-allarme timer / cronometro (VWR International) </li><li> Penne Sharpie </li><li> Nastro adesivo </li></ul></li><li> Avversiva fototassi Soppressione Assay <ul><li> Chinino cloridrato (Sigma Aldrich, numero CAS: 6119-47-7) </li><li> Acqua distillata </li><li> Digital scala di misurazione per la diluizione precisa in peso </li><li> Connettori rapidi Disconnetti, polietilene ad alta densità (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> 15 Centrifuga Tubo mL (VWR International), tagliata in segno di 2 ml da fine chiuso per adattarsi con la Quick Disconnect adattatore connettore per fonte di luce </li><li> Singolo canale 200 pipetter microlitri per caricare soluzione di chinino su carta da filtro rivestimento della camera </li><li> T-Maze (Simple sistemi comportamentali; Figura 1) </li><li> Foglio di alluminio </li><li> Sorgente luminosa (Zeiss) </li><li> Una lampada con luce rossa. </li><li> Filtro di carta </li><li> Mini-allarme timer / cronometro (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Preparazione delle mosche <ul><li> Le mosche sono mantenuti su standard di farina di mais-agar-melassa, lievito di media a 25 ° C 12 ore su un ciclo luce / buio. </li><li> Vola Virgin sono isolati in anestesia anidride carbonica nel giorno della eclosion. Per gli studi di invecchiamento, le mosche sono mantenuti in gruppi di venti per fiala e trasferito in una fiala fresco ogni 3 giorni. E 'importante utilizzare le mosche fratello dalla croce stessa dei genitori per gli studi di invecchiamento, di minimizzare le differenze derivanti da substrato genetico. </li><li> Per entrambi i test, le mosche sono sessuato e mantenuti in gruppi di dieci mosche per flaconcino. La differenza di genere sul comportamento è significativo ed è consigliabile non mescolare le mosche maschio e femmina in uno studio di dati potrebbe essere difficile da interpretare e riprodurre 6. </li><li> Per il saggio di geotassi negativo, mosche vengono ordinate in gruppi di dieci per flaconcino e testato un'ora dopo l'anestesia. E 'importante per le mosche di recuperare completamente da anestesia in quanto ciò potrebbe avere un effetto sulle attività locomotoria. </li><li> Per il saggio di APS, vola di ogni gruppo vengono inseriti in una fiala vuota polistirolo inumidito con acqua carta da filtro per sei ore prima che il test viene eseguito. Questo assicura che le mosche sono affamati prima che il test e sarà più percettivo al gusto avverse. Poco prima del test viene eseguito, ogni volare da un gruppo di dieci è posto in una provetta vuota centrifuga 15 ml, che sono state limitate in modo impreciso, per evitare la fuga. </li></ul> 4. Geotassi test negativo <ul><li> Geotassi è generalmente misurata per 10-20 gruppi di dieci persone del genotipo stesso o di trattamento (100-200 vola totale per ciascun genotipo / trattamento) 7. Gruppi sorta di dieci mosche di sesso femminile o maschile per un apparato di CO 2 l'anestesia e il luogo di ogni gruppo in un flaconcino a parte. Attendere almeno un'ora per le mosche di recuperare da anestesia. </li><li> Preparare l'apparato arrampicata per ogni gruppo, in modo che due fiale polistirolo vuote sono verticalmente uniti da nastro di fronte all'altra. E 'importante assicurarsi che le aperture dei flaconcini sono perfettamente allineati tra loro per fornire una superficie piana di arrampicata per le mosche. </li><li> Per il flacone inferiore, misurare una distanza verticale di 8 cm al di sopra della superficie inferiore e contrassegnare ogni fiala disegnando un cerchio lungo l'intero perimetro del flaconcino. </li><li> Trasferimento di un gruppo di dieci vola nel flacone inferiore attentamente impedire la fuga di una mosca. Coprire immediatamente il flacone inferiore con la fiala superiore e nastro in modo sicuro in prossimità del contatto con aperture. Lasciare le mosche per acclimatarsi alla nuova impostazione per 1 minuto prima di effettuare il test. </li><li> Battere delicatamente la vola verso il fondo del flaconcino e misurare il numero di mosche che possono salire sopra il marchio da 8 cm per 10 secondi dopo il rubinetto. </li><li> Ripetere questo test lo stesso gruppo dieci volte, consentendo periodo di riposo per 1 minuto tra ogni prova. </li><li> Registrare il numero di mosche per ogni gruppo che hanno superato gli 8 cm marchio come unpercentuale totale di mosche. </li></ul> 5. Avversiva fototassi saggio di soppressione (APS Assay) Originariamente adattato da Le Bourg e Buecher (2002) 4, questa analisi sfrutta il comportamento positivo phototactic in treno vola a loro di associarsi luce con stimoli avversi (in questo caso, il gusto amaro del chinino). Dopo una formazione / condizionamento fase, mosche wild-type in grado di associare l'area illuminata con gusto repulsivo e evitarlo. Vola con compromessa capacità di apprendimento non riuscirà a fare questa associazione. Inoltre, il saggio APS può essere utilizzato anche per misurare la memoria a breve termine funzione di mosche 5 sottoponendo già vola addestrati per la stessa prova 6 ore dopo condizionamento per verificare la loro abilità nel ricordare il compito imparato. <ol><li> Preparazione della soluzione di chinino <ul><li> Sciogliere chinina cloridrato in acqua distillata per ottenere una soluzione 0,1 M magazzino (1.98g in 50mL di acqua distillata). Soluzione di riserva possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di un anno in piccole aliquote </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di 1 microM diluendo la soluzione madre in acqua distillata. </li></ul></li><li> Preparazione del T-Maze <ul><li> T-labirinto è costituito dalla colonna centrale con la botola e due camere indipendenti, una camera di "dark" e una camera "illuminata" (Figura 1). </li><li> Preparazione Camera: prendere due tubi 15ml centrifuga di plastica e tagliate a 2 ml marchio dal fondo chiuso concluderà con una sega manuale. Montare gli adattatori connettore ad ogni estremità, e sigillare il collegamento con parafilm. L'adattatore alla fine del tubo serve come lo slot di ingresso per la sorgente di luce a collo d'oca. Collegare un tubo con la sorgente di luce e questo tubo sarà la camera "illuminata". Avvolgere il tubo altre con un foglio di alluminio per fungere da camera "oscura". </li><li> Aggiungi 180uL o di acqua distillata o di soluzione di chinino per filtrare carta e porre in camera di luce. </li><li> Assemblare la T-labirinto avvitando le camere luminose e scure su ogni lato della colonna centrale, con la botola in mezzo chiuso (Figura 1). </li><li> Inserire la fonte di luce nella camera illuminata. </li></ul></li><li> Formazione vola a sopprimere fototassi con stimoli avversi <ul><li> Svitare la camera oscura dal T-labirinto e trasferire una mosca in questa camera e subito avvitare il tubo di nuovo al buio labirinto. </li><li> Spegnere le luci in sala e accendere la spia rossa. </li><li> Consentire al volo per acclimatare nella camera oscura per 30 secondi e lentamente accendere la fonte di luce illumina la camera illuminata. Aprire lentamente la botola che separa le due camere. </li><li> Se la mosca si dirige verso la camera illuminata entro 10 secondi, è considerato positivamente phototactic ed è pronto per essere addestrato per l'analisi. Fallimento in fototassi indica problemi nel sistema visivo e vola con fototassi negativi devono essere esclusi dal test. </li><li> Per la soppressione avversivo fototassi (APS) la formazione, tocca al volo che ha dimostrato fototassi positivo ritorno alla camera oscura, chiudere la botola e spegnete la luce. Attendere 30 secondi di acclimatazione. Durante questo tempo mettere carta da filtro con una soluzione di chinino nella camera illuminata. Aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lasciare che il cammino volare nella camera di chinino rivestito illuminata. Dopo un minuto, toccare il volo di ritorno alla camera oscura e ripetere questo 9 volte di più. (In genere, tipo selvatico vola evitare la camera illuminata dopo 3 o 5 studi di formazione.) </li><li> Immediatamente dopo l'allenamento, cinque studi di prova sarà condotta. In ogni prova, prova, attendere 10 secondi dopo la luce è accesa per il volo addestrati a camminare verso la camera illuminata. Il mancato piedi dalla fiala illuminata sarà registrato come "Pass", che equivale a "compito appreso attraverso rinforzo". Il tasso Pass più di cinque prove consecutive viene registrato e mostrato sotto nella figura 2 come PC0 (0 condizionamento post ora). </li></ul></li><li> La valutazione a breve termine funzione di memoria in Flies <ul><li> Dopo una formazione iniziale e PC0 registrazioni, ogni volo è posto di nuovo nella sua fiala cibo originale e tenuti da parte per sei ore. </li><li> Sei ore di formazione post, sottopone ogni volare a 5 studi ancora allo stesso modo di prima, e registrare il numero di volte al volo evita (pass) o va in (non riuscito) il flacone illuminato. Questo tasso di passaggio viene registrato come PC6 (6 ore dopo condizionamento), che è un indicatore della memoria a breve termine. </li></ul></li></ol> 6. Interpretazione dei dati e analisi statistica <ol><li> Geotassi test negativo <ul><li> I dati grezzi generati da questa analisi rappresenta il numero di mosche che attraversano l'8-cm marchio in 10 secondi in ogni gruppo. Convertire questa percentuale e per calcolare il tasso medio di passaggio per ogni gruppo di oltre 10 sessioni. </li><li> Dati sono rappresentati graficamente come un pass rate medio per gruppo (genotipo, trattamento, ecc) con l'errore standard della media (SEM). </li><li> Differenze tra i gruppipuò essere determinata per essere statisticamente significativo o non si utilizza un test t di Student o ANOVA. </li></ul></li><li> Avversiva fototassi Soppressione Assay <ul><li> I dati grezzi di questa analisi è rappresentato come il numero di volte ogni volo evita la camera illuminata in cinque prove successive. Il tasso di passaggio è calcolato come la percentuale di prove evitare di successo nel corso degli studi clinici totale. Calcolare il tasso medio di passare in questo modo per un minimo di 15 mosche per gruppo. </li><li> I dati vengono rappresentati graficamente come il tasso medio di passare PC0 (subito dopo il condizionamento; indicatore di "apprendimento") o il tasso medio di passare PC6 (6 ore dopo il condizionamento; indicatore "memoria") con i rispettivi SEM. </li><li> Indici di apprendimento e memoria vengono confrontate tra i gruppi sia di tipo selvatico e "geneticamente manipolati-benigno" gruppo (come la GFP iperespressione di aria) in modo appropriato. </li></ul></li></ol> 7. Rappresentante Risultati In questo esperimento video, stiamo valutando deficit di apprendimento e la memoria e il motore nelle mosche iperespressione umano Tau nel sistema nervoso centrale e confrontando le loro prestazioni a quelle delle mosche overesprimenti GFP. Sovraespressione neuronale del Tau umani in Drosophila ha dimostrato di causare gravi vacuolizzazione nel cervello 8 e portare a significativi deficit di apprendimento e di funzioni di memoria 9. Come mostrato nella Figura 2A, 10 giorni maschio o femmina vola sovraesprimono umano Tau hanno deficit motorio significativo rispetto ai pari età GFP sovraesprimono mosche. Inoltre, queste mosche non associare la luce con gusto amaro come dimostrato dal tasso di PC0 passare rispetto al gruppo di controllo, così come non ricordare questa associazione, come indicato dalla diminuzione del tasso di passaggio PC6 (Figura 2B). Questo esperimento conferma ulteriormente che i modelli di Drosophila possono essere usati per studiare le malattie neurodegenerative umane e ricapitola alcuni dei fenotipi comportamentali osservati negli esseri umani e mammiferi. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. T-Maze di installazione per analisi avversivo Soppressione fototassi. A. L'impostazione generale sperimentale per l'esperimento APSA con la sorgente luminosa collegata al tubo "illuminato" falco, foderato con carta da filtro e il tubo "dark" a sinistra (coperto in fogli), separati da una botola. B. Durante la fase di test e allenamenti, la mosca è nella camera oscura e la botola aperta dopo la luce è accesa nella camera illuminata. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati rappresentativi dal geotassi negativo e sperimentare APS con iperespressione di mosche GFP o Tau con un pan-neuronale driver. A. Nel test geotassi negativo, 10 giorni di età maschile (colonna blu) o femmina (colonna rossa) vola sovraesprimono GFP ha mostrato una maggiore attività di arrampicata di Tau-sovraesprimono mosche. B. di 20 giorni vecchia femmina vola iperespressione GFP ha mostrato una migliore apprendimento (PC0) e memoria (PC6) le funzioni di Tau iperespressione di mosche.

<ol><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Lloyd, T. E. &amp, Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Learning+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).</li>
<li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+phototaxic+suppression%3A+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li>
<li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li>
<li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li>
<li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sia geotassi negativo e saggi APS sono robusti test comportamentali per misurare le variazioni locomotore o di apprendimento e capacità di memoria derivanti da manipolazioni genetiche o ambientali. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi di questi saggi che attendono un&#39;ulteriore ottimizzazione. Nel saggio geotassi negativo, le mutazioni in alcuni geni può rendere gravi disfunzioni motorie nelle mosche. In tali casi, le mosche difficilmente può scalare i muri, in risposta alla forza di gravità su agitazione. Saggi di altro comportamento che, direttamente misurare il movimento può essere più appropriato. Questi test includono il comportamento riflesso di raddrizzamento che misura la paralisi e il sequestro 10, e il comportamento optomotor 11 che registra la perdita di coordinazione motoria. Nel saggio APS, l&#39;ostacolo prima può essere vola a caso fermarsi all&#39;ingresso della camera illuminata, senza andare avanti. Questo diventa più un problema se l&#39;invecchiamento è una delle condizioni studiate, dal momento che vola più anziani sono meno attivi in ​​generale e tendono a fermarsi e riposare per lunghi periodi di tempo. In questo caso lo sperimentatore deve fornire stimoli meccanici di promuovere la libera, che non è sempre efficace. In secondo luogo, si potrebbe sostenere che la mancata andare ai risultati camera illuminata da una perdita di fototassi positivo. Questo è raramente il caso, in quanto il lavoro precedente ha mostrato che vola tornare indietro alla capacità di risposta luce una volta che il negativo rafforzare viene rimosso 4. In terzo luogo, la durata del contatto con lo stimolo avversivo può variare da prova a prova. Questa variazione di solito può essere ridotto circonda la parete interna della camera con carta da filtro imbevuto di prevenire vola da evitare il chinino. Inoltre, lo sperimentatore può garantire che ogni volo passano abbastanza tempo a contatto con la carta da filtro, aumentando la quantità di tempo trascorso nella camera da diversamente specificato 1 minuto. In sintesi, geotassi negativo e saggi APS sono modi veloci e semplici per valutare deficit comportamentali e quantitativamente indicare locomotore e di apprendimento e le capacità di memoria in Drosophila. Questi test sono particolarmente utili nella modellazione umana malattie neurodegenerative in Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commento </th></tr><tr><td> Polistirolo Vial </td><td> Vial Campidoglio, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 Vial polistirolo mm, qualità dei materiali importanti, male se troppo scivoloso per le mosche a salire. </td></tr><tr><td> Dissezione stereoscopio </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 filiali a collo d&#39;oca guida di luce (12V/30W) </td></tr><tr><td> Chinino cloridrato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Sciogliere in acqua distillata. </td></tr><tr><td> Quick Disconnect Connettori </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polietilene ad alta densità </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Semplici sistemi comportamentali </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Singolo canale 200 microlitri pipetta </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

deficit locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in drosophila modelli di neurodegenerazione

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

I progressi nei metodi di genetica hanno permesso lo studio dei geni coinvolti in malattie neurodegenerative umane utilizzando Drosophila come sistema modello 1. La maggior parte di queste malattie, tra cui l&#39;Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Huntington sono caratterizzati da età-dipendente deterioramento delle funzioni di apprendimento e memoria e coordinazione motoria 2. Qui usiamo test comportamentali, tra cui il test negativo geotassi 3 e il test di soppressione phototaxic avversivo (APS test) 4,5, per mostrare che alcune delle caratteristiche di comportamento associato neurodegenerazione umana può essere riassunta nelle mosche. Nel test geotassi negativo, la tendenza naturale di mosche a muoversi contro la gravità, quando agitato è utilizzata per studiare i geni o le condizioni che possono ostacolare la capacità locomotoria. Nel saggio APS, le funzioni di apprendimento e la memoria sono testati in modo positivo-phototactic vola addestrati per associare la luce con gusto amaro avverso e, quindi, evitare questa tendenza altrimenti naturale a muoversi verso la luce. Test questi addestrati vola 6 ore dopo la formazione è utilizzata per valutare le funzioni di memoria. L&#39;utilizzo di questi saggi, il contributo di fattori genetici o ambientali verso lo sviluppo di neurodegenerazione può essere facilmente studiato in mosche.

Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità in<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

I progressi nei metodi genetici hanno permesso lo studio dei geni coinvolti nelle malattie neurodegenerative umane utilizzando Drosophila come sistema modello1. La maggior parte di...

L'obiettivo generale della procedura è studiare l'apprendimento e la memoria negli adulti di Esso Melan Gaster, innanzitutto per determinare se le mosche presentano deficit locomotori. Vengono sottoposte al test di geotassi negativa. Successivamente, il comportamento fototattico positivo viene verificato posizionando le mosche in un labirinto a T e registrando la latenza nel muoversi verso la camera illuminata preferita.Le mosche con fototassi positiva vengono quindi condizionate ad associare la camera illuminata al sapore amaro della chinina. Infine, si verifica quanto bene le mosche associano lo stimolo avversivo alla camera illuminata, fornendo una misura dell'apprendimento e della memoria. Ola, benvenuto nel laboratorio X.Oggi vi illustreremo due saggi comportamentali comunemente utilizzati per studiare la neurodegenerazione in drosophila. Per prima cosa, vi mostreremo il saggio di soppressione della fototassi avversiva, dimostrato da Wil Fredo Sala, uno studente universitario del nostro laboratorio, e da me stesso, seguito dal saggio della geotassi negativa, dimostrato da Kaiwan, uno studente laureato del nostro laboratorio. Mantenere le mosche su un mezzo standard a base di agar, melassa, mais e lievito, a 25 gradi Celsius, in un ciclo luce/buio di 12 ore.Nel giorno dell'occlusione, suddividere le mosche vergini in gruppi di 20. Le mosche vergini si riconoscono dal colore chiaro e da una macchia verde scuro situata sulla parte inferiore dell'addome. Le mosche devono essere trasferite in un nuovo flacone ogni tre giorni, e si devono utilizzare mosche sorelle per minimizzare le differenze derivanti dagli sfondi genetici.Per un esperimento di geotassi, devono essere testati da 10 a 20 gruppi per genotipo o trattamento. Per iniziare, suddividere le mosche femmine e maschi in gruppi di 10. Queste mosche devono essere testate separatamente.Poiché il comportamento è significativamente influenzato dal sesso, attendere almeno un'ora dopo l'anestesia prima di procedere, per garantire che l'attività locomotoria non sia compromessa. Una volta che i moscerini sono stati preparati correttamente, allineare le aperture di due provette vuote in polistirene unendole verticalmente sulla provetta inferiore.Misurare otto centimetri a partire dal fondo e tracciare un cerchio lungo la circonferenza. Ora che l'apparato è stato assemblato, trasferire un gruppo di 10 moscerini nel vial inferiore. Unire immediatamente i vial e lasciare ambientare i moscerini per un minuto prima del test.Dopo che i moscerini si sono calmati, battere delicatamente sul fondo della provetta per farli scendere e misurare il numero di moscerini che superano il segno degli otto centimetri entro 10 secondi. Il numero di moscerini per gruppo che superano questo segno viene registrato come percentuale del totale dei moscerini. Ripetere questa procedura 10 volte per ogni gruppo, permettendo ai moscerini di riposare per un minuto tra una prova e l'altra.Sei ore prima di un saggio PS, selezionare moscerini femmine e trasferirli in provette di polistirene contenenti carta da filtro inumidita con acqua. Questo passaggio garantisce che i moscerini siano a digiuno e più sensibili al sapore sgradevole. In questo saggio, una soluzione di chinino funge da stimolo avversivo.Preparare una soluzione lavorativa di un micromolare a partire da una soluzione madre di 0,1 molare. Il labirinto a T è composto da una colonna centrale con una botola e due camere laterali, una camera scura e una camera illuminata. All’altezza del segno di due millimetri, utilizzare una sega manuale per tagliare l’estremità chiusa di due provette plastiche da 15 millilitri, applicare adattatori di connessione a ciascuna estremità e sigillare il collegamento con paraform. Avvolgere un tubo con della carta d'alluminio per realizzare la camera oscura. Assemblare le TMA avvitando la camera illuminata e quella oscura su ciascun lato della colonna centrale. Con la porta di chiusura centrale chiusa, completare l'allestimento collegando una sorgente luminosa all'adattatore della camera illuminata. Prima di eseguire il saggio, trasferire ogni moscerino da un gruppo di 10 in un tubo da centrifuga vuoto da 15 millilitri e chiuderlo leggermente per evitare fughe.Successivamente, svitare la camera oscura dalle TMA. Trasferire una singola mosca nel tubo e reinserirlo immediatamente nel labirinto. Spegnere le luci della stanza e accendere una lampada rossa.Lasciare che il moscerino si ambienti nella camera oscura per 30 secondi, quindi accendere lentamente la sorgente luminosa che illumina la camera illuminata. Una volta illuminata, aprire la botola che separa le due camere. Se il moscerino raggiunge la camera illuminata entro 10 secondi, viene considerato positivamente fototattico ed è pronto per essere addestrato.Il mancato riscontro di questa risposta indica un problema nel sistema visivo e richiede l'esclusione dal saggio. Una volta confermata la fototassi positiva, battere leggermente sul moscerino per farlo tornare nella camera oscura, chiudere la porta a trappola e spegnere la luce durante un periodo di riposo di 32°. Preparare lo stimolo avversivo posizionando la carta da filtro nella camera illuminata e aggiungendo con una pipetta un millilitro di soluzione di chinino sulla carta da filtro.Assicurarsi che tutta la carta da filtro sia completamente inumidita con stimoli avversivi. Per iniziare il condizionamento, aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lasciare che la mosca entri camminando nella camera illuminata con odore di chinino.Dopo un minuto, fate tornare la mosca nella camera scura. Ripetete questa procedura nove volte per un totale di 10 prove di condizionamento. Di solito, dopo tre o cinque prove di addestramento, le mosche di tipo selvatico evitano immediatamente dopo l'addestramento la camera illuminata.Eseguire cinque prove di test. Se la mosca addestrata non entra nella luce della camera entro 10 secondi, viene registrata come superata. Viene registrata e indicata la percentuale di prove superate su cinque prove consecutive.PC zero. Dopo l'addestramento e le registrazioni iniziali di PC zero, ogni mosca viene riposizionata nel suo contenitore numerato originale con cibo e conservata per sei ore. Sei ore dopo l'addestramento, effettuare cinque ulteriori prove di test come mostrato in precedenza; questa percentuale di superamento rappresenta il PC sei ed è una misura della memoria a breve termine.Nel saggio di geotassi negativa, il numero di moscerini che superano il segno degli otto centimetri viene convertito in una percentuale e presentato come tasso di superamento del test di arrampicata. In 10 prove, come mostrato qui a destra, moscerini maschi o femmine di 10 giorni che sovraesprimono la proteina tau umana presentano deficit locomotori significativi rispetto ai moscerini controllo di pari età che sovraesprimono GFP, mostrati a sinistra.La prestazione nel test di soppressione della fototassi avversiva è rappresentata dalla frequenza media di superamento o dalla percentuale di prove di evitamento riuscite. Nel complesso, le mosche che sovraesprimono tau, mostrate qui a destra, sono meno capaci di associare la luce a un sapore amaro rispetto al gruppo di controllo a sinistra, sia immediatamente dopo l'addestramento che quando testate sei ore più tardi. Al termine di questa procedura, è possibile prelevare campioni per analisi immunocitochimiche al fine di rispondere ad ulteriori domande riguardo le differenze morfologiche. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come studiare l'apprendimento e la memoria nelle mosche amiche.E ricorda, si tratta sempre di te.

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Il metodo per misurare adulti Drosophila memoria associativa è descritta. Il test si basa sulla capacità della mosca per associare un odore presentato con un rinforzo negativo (folgorazione) e poi richiamare queste informazioni in un secondo momento, permettendo di memoria da misurare.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Qui descriviamo due saggi che sono stati stabiliti per studiare neurodegenerazione età-dipendente di dopaminergici (DA) neuroni...

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Presentiamo un test di geotassi negativa ottimizzato, economico e affidabile in Drosophila melanogaster come modello per i disturbi neurodegenerativi. Essendo più sensibile ai difetti locomotori lievi, questo test aiuterà a individuare potenziali interazioni genetiche e bersagli farmacologici.

Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Questo protocollo descrive un apprendimento e memoria di Drosophila chiamato condizionamento di corteggiamento. Questo saggio classico si basa su una riduzione del comportamento maschile di corteggiamento dopo il rifiuto sessuale da parte di una femmina prematurata non ricettiva. Questa forma naturale di plasticità comportamentale può essere usata per testare l'apprendimento, la memoria a breve termine e la memoria a lungo termine.

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell&#39;apprendimento e della memoria

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Questo protocollo dettagliato analizza il comportamento di geotassi negativa di Drosophila utilizzando un sistema automatico di multi-cilindro che ospita centinaia di mosche e sincronizza la loro azione da un motore elettrico. Al momento della sincronizzazione, volare geotassi negativo comportamento viene analizzato, registrata digitalmente ed analizzati utilizzando il software di RflyDetection auto-progettato.

Un dosaggio di geotassi negativa iterativo rapido automatizzato per l'analisi del comportamento adulto arrampicata in un modello di Drosophila di neurodegenerazione

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

L'obiettivo di questa procedura è quello di sezionare il tessuto del muscolo longitudinale dorsale (DLM) per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari DLM (NMJ) nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando Drosophila melanogaster.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Il presente protocollo valuta l'attività locomotoria di Drosophila tracciando e analizzando il movimento delle mosche in un'arena fatta a mano utilizzando il software open source Fiji, compatibile con plugin per segmentare i pixel di ogni fotogramma in base alla registrazione video ad alta definizione per calcolare i parametri di velocità, distanza, ecc.

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Il protocollo presenta un metodo ad alto rendimento ed economico per valutare la neurotossicità nel moscerino della frutta attraverso la quantificazione della disfunzione locomotoria come alternativa ai modelli tradizionali di mammifero. Mira a valutare gli effetti neurotossici di composti farmaceutici, agenti ambientali o modificazioni genetiche utilizzando un modello sensibile, riproducibile ed eticamente favorevole.

Analisi comportamentale della disfunzione locomotoria in Drosophila melanogaster come lettura della neurotossicità

Scopri saggi comportamentali per valutare deficit locomotori, apprendimento e memoria in Drosophila melanogaster. Questi metodi aiutano a studiare la neurodegenerazione e le basi genetiche delle malattie.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Esplora altri video