Name: Поверхностные мышей хирургии лимфатических узлов (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Узнайте хирургическое удаление лимфатических узлов у мышей для исследования иммунного ответа. Этот метод позволяет получить жизнеспособные лимфоциты и анализировать их методом проточной цитометрии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим Сильви Лесаж и все лаборатории членов критического чтения протокола. Эта работа была поддержана грантом (СС-77 545) из Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). Натали Labrecque поддерживается FRSQ старший стипендии и Мелисса Матье получил NSERC Александр Грэхем Белл Канада высшей стипендии.

1. Подготовка перед операцией Мыши были обработаны в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам Animal Care. <ol><li> Anesthetise мышам инъекции кетамина / ксилазина (150/300 мг / кг, внутрибрюшинно) или при вдыхании ИФ (2%, 1 л кислорода). Если возможно, ИФ следует использовать, поскольку оно позволяет лучше контролировать анестезии времени и глубины. Кроме того, кислород вводится в то же время, поддерживает физиологические функции животных. Кроме того, ИФ непосредственно устранить легкие и, следовательно, не требует печени или почек метаболизм. </li><li> Вводите бупренорфин (0,05 - 0,1 мг / кг, подкожно) или другой анальгетик. </li><li> Применять мазь на глаза мыши до операции, чтобы избежать сухости глаз (если используется ИФ). </li><li> Убедитесь, что мышь спит, зажимая лапой и подвижного хвоста. Если мышь не реагирует, приступить к операции. </li></ol> 2. Хирургия <ol><li> Поместите мышь на его стороне. </li><li> Локализация региона, где вы будете выполнять incisioп., в зависимости от LN вы хотите собрать. (Рис. 1). </li><li> Применение хлоргексидина или другого дезинфицирующего средства, в этом регионе. </li><li> Сделать крошечный разрез с острыми ножницами (около 5 мм) или на задней части передней ноги или выше задней лапы у брюшной полости (рис. 1). </li><li> Удалить волосы свободно вы сократили с щипцами. Если вы предпочитаете, вы можете брить мыши перед созданием разреза. Тем не менее, это удлиняет процедуру, и мы находим, что это не нужно, так, как показано ниже, это не улучшает заживление или уменьшение инфекции, которые являются очень редкими. </li><li> Протяните разрез с 2 щипцы для того, чтобы увидеть LN. Разрез может достигать 10 мм. Л.Н. появляется сероватый или темнее, чем окружающие жира. </li><li> Зажмите фасции (тонкие оболочки, покрывающей жир и ткани) в верхней части Л. с одним пинцетом и слегка потяните без нарушения окружающих тканей. </li><li> Поместите второй щипцы, насколько это возможно недеформированнойrneath LN. С первым щипцы, сломать фасции и удаление LN. Если вы успешно собрали Л.Н., пятна крови должны находиться в месте, где LN ранее находились. Отметим, что Л. Н. тонет в изотонический раствор. Этот простой тест позволяет проверить, что вы извлекли Н., а не жировой ткани. </li><li> Убедитесь, что не волосы в ране. </li><li> Закройте разрез, придерживаясь 2 части кожи вместе (внутри кожи) и сшивания их клип. Мы используем несколько клипов Мишель с применением щипцов. Установите один или 2 ролика в зависимости от размера разреза. Чаще всего клипы упасть, когда ткань заживает. </li></ol> 3. Ведение послеоперационного периода <ol><li> Добавьте немного влажный корм на дно клетки мышей таким образом, может легко кормить после операции. </li><li> Около 6 до 8 часов после операции, проверить мышей, чтобы они не испытывают боли. Внимательно наблюдать за их поведением (осанка, походка, ввзаимодействие с соединением и внешний вид меха). Если внешний вид мышей бедных, управлять второй дозы бупренорфина. На следующий день мыши должны восстановить их нормальное поведение в противном случае продолжить администрации бупренорфина. Мыши никогда не достигают конечных ранее определены и приняты Советом вашей помощи животных. Вы можете обратиться за советом и помощью к зоотехник виварий помощи. </li></ol> 4. Обработка лимфатических узлов <ol><li> В лабораторных условиях для получения суспензии отдельных клеток, отделить LN в соответствии с вашей обычной процедуре. Жмем Л.Н. против слайды матового и регулярно получать 1-2 × 10 6 клеток на LN. Кроме того, мы готовим LN для извлечения РНК. </li><li> Пятно клеток в соответствии с вашим обычным протоколом. Вы должны получить ожидаемый Л.Н. профили проточной цитометрии. </li></ol> 5. Представитель Результаты Например вперед и стороной разброс рМногое показано LNS собран из наркоза мыши хирургическим путем или пожертвовать мыши (рис. 2). Профиль и процент клеток в живых лимфоцитов ворот такие же, показывая, что Л.Н. хирургии соответствующую технику для уборки клетки. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Рисунок 1"> Рисунок 1. Паховой и плечевой локализации LN в мышь. А. Н. паховой находится чуть выше задних лап, немного в сторону живота. В. Н. плечевой находится за передней ноги. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2. Проточная цитометрия профиля лимфоцитов, полученных после Л.Н. операции. Вперед и боковые профили разброс показаны для LNS найденным Anesthetized мыши хирургическим путем (A) или пожертвовать мыши (B). LNS были собраны, проанализированы и диссоциированных на проточной цитометрии. Процент клеток в живых лимфоцитов ворота показаны.

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы описали протокол Л.Н. операции, которые могут применяться в отношении многих экспериментальных систем. Хотя очень полезно следовать иммунный ответ или иммунного гомеостаза клетки, этот метод имеет ряд ограничений. Во-первых, только четыре LNS могут быть собраны. Во-вторых, иммунный ответ должен быть изучен системным или происходят в поверхностных паховых или плечевой (кожа-слив) LNS. Наконец, число клеток, полученных зависит от качества Л.Н. удаления, технические ограничения, которые могут способствовать эксперимента...

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагент Имя </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Грефе пинцет изобразительных премиум шаблон </td><td> Гарвардский аппарата </td><td> 52-2144 </td><td> Сильно изогнутый, 10 см (4 дюйма), 0,8 мм наконечником </td></tr><tr><td> Мишель клип Применение и удаление щипцы </td><td> Гарвардский аппарата </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 см (5 дюймов) </td></tr><tr><td> Мишель клипов 100 </td><td> Гарвардский аппарата </td><td> 52-3746 </td><td> 7.5-1.75 мм </td></tr><tr><td> Temgesic (бупренорфина гидрохлорид) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (кетамина гидрохлорид) </td><td> Boniche животных здравоохранения </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (Ксилазин) </td><td> Bayer </td> &lt;TD&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> Изофлюран </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears глазной мази </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (Clorhexidine глюконат 2% изопропиловый спирт 70%) </td><td> Омега </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

Поверхностные мышей хирургии лимфатических узлов

Murine Superficial Lymph Node Surgery

В области иммунологии, чтобы понять, прогрессирование иммунного ответа на вакцину, инфекции или опухоли, ответ часто сопровождается с течением времени. Кроме того, исследование лимфоцитов гомеостаза требует экспериментов время курса. Выполнение этих работ в том же мышь идеально подходит для уменьшения экспериментальной изменчивости, а также количество мышей использовали. Забора крови позволяет проводить эксперименты время, конечно, но это только дает информацию о циркулирующих лимфоцитов и предоставляет ограниченное количество ячеек 1-4. Так как лимфоциты циркулируют по всему телу и проживающих в лимфатические узлы имеют различные свойства, важно изучить обоих местах. Последовательное удаление лимфатических узлов хирургическим путем предоставляет уникальную возможность следить за иммунный ответ или иммунной расширения ячейки в той же мыши с течением времени. Кроме того, этот метод дает от 1-2х10 6 клеток в лимфатических узлах, достаточное для пеrform фенотипические характеристики и / или функционального анализа. Последовательные операции лимфатических узлов или лимфаденэктомия была успешно использована нами и другими 5-11. Здесь мы опишем, как плечевой и паховые лимфатические узлы могут быть удалены, сделав небольшой разрез в коже anesthetised мыши. Поскольку операция является поверхностным и сделать быстро, мыши восстанавливается очень быстро, заживает хорошо и не испытывает чрезмерную боль. Каждый второй день, можно собрать один или два лимфатических узлов позволяет эксперименты время курса. Этот метод, таким образом, подходящим для изучения характеристик лимфатических узлов, проживающих лимфоцитов с течением времени. Такой подход годится для различных экспериментальных проектов и мы считаем, что многие лаборатории выиграют от выполнения последовательных операций лимфатических узлов.

Чтобы проследить прогрессирование иммунного ответа с течением времени в той же мыши, лимфатические узлы могут быть последовательно удалены хирургическим путем. Здесь мы опишем, как эта техника может быть выполнена.

В области иммунологии для понимания динамики иммунного ответа на вакцину, инфекцию или опухоль данный ответ часто...

Общая цель данной процедуры заключается в хирургическом удалении лимфатических узлов у анестезированной мыши. Это достигается путем предварительной локализации лимфатических узлов. Затем производится забор лимфатических узлов, после чего разрез закрывается.Наконец, для экспериментального анализа можно получить суспензию единичных клеток. В конечном итоге жизнеспособные популяции лимфоцитов могут быть оценены с помощью проточной цитометрии. Визуальная демонстрация этой методики имеет решающее значение, так как для её освоения необходимо видеть процесс локализации и удаления лимфатических узлов.После анестезии мыши нанесите глазную мазь, введите бупренорфин и подтвердите седацию с помощью щипкового теста (сдавливания пальца лапы), затем положите мышь на бок. Сначала локализуйте подмышечный лимфатический узел, после чего выбрейте область, подлежащую диссекции. Смахнув все отделившиеся волоски, обработайте область антисептиком, затем сделайте небольшой разрез длиной около пяти миллиметров на тыльной стороне передней лапы.Используйте два пинцета, чтобы растянуть разрез до тех пор, пока не станет виден плечевой лимфатический узел, который может иметь сероватый цвет или быть темнее окружающего жира. Затем захватите фасцию, покрывающую лимфатический узел, одним пинцетом. Поместите второй пинцет как можно глубже под лимфатический узел и осторожно потяните за мембрану, не повреждая окружающие ткани.Затем с помощью первого пинцета разорвите фасцию и извлеките лимфатический узел. Если лимфатический узел был успешно извлечен, в месте его прежнего нахождения появится пятно крови. Поместите иссеченный лимфатический узел в изотонический раствор; если он погрузится на дно, это подтвердит, что извлеченная ткань является лимфатическим узлом, а не жировой тканью.Затем убедитесь, что в ране нет волосков, и закройте разрез, соединив внутренние края кожи и зафиксировав их одной или двумя скобами, в зависимости от размера разреза. Теперь найдите паховый лимфатический узел и выбрейте область, подлежащую диссекции. После удаления всех выпадающих волосков обработайте область дезинфицирующим средством, а затем сделайте небольшой разрез длиной около пяти миллиметров выше задней лапы, рядом с брюшной полостью.После того как разрез был раскрыт двумя парами пинцетов, как было показано ранее для плечевого лимфатического узла, найдите паховый лимфатический узел, расположенный в окружающей жировой ткани. Затем удалите лимфатический узел двумя парами пинцетов, как было продемонстрировано. Снова подтвердите успешное извлечение лимфатического узла, отметив появление пятна крови в месте, где ранее находился узел, после чего поместите паховый лимфатический узел в отдельный контейнер с изотоническим раствором.После извлечения всех лимфатических узлов поместите мышь в клетку и добавьте влажный корм, чтобы животное могло легко питаться. Примерно через шесть-восемь часов после операции осмотрите мышь, чтобы убедиться в отсутствии болевого синдрома. Внимательно проследите, чтобы поза, походка, взаимодействие с сородичами и внешний вид шерсти соответствовали показателям здоровой мыши.Наконец, диссоциируйте лимфатический узел, прижимая его к матовым предметным стеклам в чашке Петри, а затем перенесите его в пробирку для получения суспензии одиночных клеток. После окрашивания клеток на интересующие антигены клеточной поверхности проанализируйте клетки методом проточной цитометрии. Здесь представлены примеры диаграмм прямого и бокового светорассеяния для лимфатических узлов, полученных от анестезированных или забитых животных.Профили и процентное содержание клеток в гейтах живых лимфоцитов на двух диаграммах рассеяния идентичны. Это доказывает, что хирургическое выделение лимфатического узла является подходящим методом сбора клеток. После освоения данной техники операция по извлечению лимфатического узла может занимать от 5 до 10 минут на одну мышь при условии правильного выполнения.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

Техника для выполнения прижизненной микроскопии паховых лимфатических узлов (ЛУ) описана. Такая методика позволяет в режиме реального...

Прижизненные микроскопия пахового лимфатического узла

Это видео демонстрирует хирургическую процедуру изоляции пахового дренирующего лимфатического узла на мышиной модели. Разрез брюшной области обеспечивает доступ к паховому лимфатическому узлу, который собирается хирургическим путем. Собранный полупрозрачный паховый лимфатический узел может быть использован для иммунологических исследований.

Забор пахового дренирующего лимфатического узла у мышиной модели

Здесь мы описываем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб печени и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) в макак, что позволяет увеличить частоту дискретизации, и уменьшает потенциал для хирургических осложнений, по сравнению с выполнением лапаротомии.

Лапароскопическая Техника для последовательного Сборнике печени и мезентериальных лимфоузлов макак

Этот протокол описывает метод изображения различных популяций клеток в осушении лимфатических узлов без изменений в структуре органа.

Визуализация структуры лимфатических узлов и клеточной локализации с помощью ex-Vivo Confocal Микроскопии

Эта модель животных позволяет исследователям индуцировать статистически значимые вторичные лимфедемы в задней конечности мышей, продолжительностью не менее 8 недель. Модель может быть использована для изучения патофизиологии лимфедемы и для изучения новых вариантов лечения.

Пересмотренный метод для индуцирования вторичной лимфедемы в Hindlimb мышей

Представлен протокол блокирования лимфатического потока хирургическим завозом афферентных лимфатических сосудов.

Блокирование лимфатического потока путем засовывания афферентных лимфатических сосудов у мышей

Лимфедема – это отек конечностей, вызванный лимфатической дисфункцией. Мы описываем модель хронического мышиного хвоста лимфедемы и новое использование технологии нанотрансфекции тканей (TNT) для доставки генетического груза в хвост.

Модель лимфедемы мышиного хвоста

Настоящий протокол описывает мышиную модель абляции адренергической иннервации путем идентификации и резекции верхнего шейного ганглия.

Хирургическая техника ганглионэктомии верхнего шейного отдела позвоночника на мышиной модели

Этот протокол описывает процедуру выживаемости при безопасной и хорошо переносимой двусторонней почечной лимфаденэктомии у мышей.

Мышиная двусторонняя почечная лимфаденэктомия

Этот протокол описывает процедуру выживаемости при безопасной и хорошо переносимой мышиной мезентериальной лимфаденэктомии на каждой из четырёх станций вдоль цепи брыжейковых лимфатических узлов. Эта процедура адаптируется для селективного нарушения лимфатической коммуникации с дистальной кишкой, проксимальной кишкой и/или тонкой кишкой.

Мышиная мезентериальная лимфаденэктомия для селективного нарушения лимфатической коммуникации с регионально-специфическим кишечником

Узнайте хирургическое удаление лимфатических узлов у мышей для исследования иммунного ответа. Этот метод позволяет получить жизнеспособные лимфоциты и анализировать их методом проточной цитометрии.

Поверхностные мышей хирургии лимфатических узлов

Больше видео