Name: ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: اكتشف تصنيع رقاقة ميكروفلويدية حرارية بلاستيكية للكشف عن فيروس إنفلونزا أ باستخدام عينات المرضى الخام. تدمج الرقاقة استخراج الحمض النووي والتفاعل البوليميري المتسلسل في عملية واحدة مبسطة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01 EB008268.

1. تصنيع رقاقة 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين من لويحات الكريات 690R Zeonex: توزيع 8-9 غرام الكريات Zeonex بالتساوي في وسط لوحة معدنية، سخن على الصحافة ساخنة C ° 198 لمدة 5 دقائق، ثم الضغط ببطء إلى 2،500 رطل لمدة 5 دقائق. لإكمال هذه الخطوة، استخدمنا الصحافة الساخنة كارفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زخرف قناة ميكروفلويديك في اللوحة مع العفن الايبوكسي. وترد تفاصيل عن تصنيع القالب في مكان آخر 12 (قناة التصميم في الشكل 2B): وضع واحد على لوحة القالب الايبوكسي؛ سخن لهم على الصحافة ساخنة عند 157 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ومن ثم ممارسة الضغط ببطء إلى 1،000 رطل لمدة 10 دقيقة . إزالة البلاك من القالب باليد أو باستخدام ملقط قبل أن يبرد. (ملاحظة: ارتداء القفازات الحرارية خلال هذه الخطوة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر ثقوب في الشريحة تنقش على مدخل، منفذ النفايات، ومنفذ للقناة ميكروفلويديك. استخدمنا بقطر 1،25 ملمالعطر قمة الحفر لجعل الثقوب الثلاثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السندات رقاقة تنقش مع آخر لوحة (في الأعلى): يغسل مع رقائق IPA، ريبونوكلياز بعيدا والماء منزوع الأيونات في تسلسل؛ على الصحافة تسخين الهواء الجاف وسخن لهم في C ° 131 لمدة 10 دقيقة ثم اضغط في 350 رطل لآخر 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق Nanoports في مدخل، والنفايات، وباستخدام المنافذ منفذ على حدة JB ولد الايبوكسي؛ علاج لمدة 15 إلى 24 ساعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع 50 قناة SPE بعيدا ريبونوكلياز ميكرولتر، ثم مع 100 ميكرولتر المياه نوكلياز مجانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل قناة SPE مع 4 ميكرولتر من الحل تطعيم (ميثاكريلات الميثيل مع 3٪ ث / ت بينزفينون) ثم تشعبي في ميتاكريليت من احتضان لمدة 10 دقيقة في فرن 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية تحت الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية و 2،000 ميغا جول 2 / سم. إزالة الحل المتبقية ترقيع مع الفراغ. كنا الجدار الفراغ. للحصول على أفضل النتائج، يجب استخدام حل الطازجة. فإنه عادة ما يكون مقبولا، ولكن، لتخزينأعد حل في C ° 4 لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل العمود SPE (جميع٪ V / V): 16٪ dimethacrylate الإيثيلين، 24٪ بوتيل ميتاكريليت، 42٪ 1-dodecanol، سيكلوهيكسانول 18٪، وإضافة 1٪ 2-dimethylamino-4-(ميثيل phenylamino)-الفينول كما البادئ الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج نفس الحجم من السيليكا المجهرية الحل هو الحل العمود SPE (لجعل مزيج 1:1)، وذلك في يجف تماما 70 درجة مئوية خلال الليل في فرن الفراغ. تفريق بيليه بالنقر على أنبوب مع إغلاق الغطاء. إضافة الحل العمود SPE في أنبوب السيليكا المكروية المجففة ودوامة لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 4 ميكرولتر من الحل SPE في نفس القناة وتشعبي ثم من قبل أشعة فوق البنفسجية لمدة 2.5 دقيقة. ثم، والوجه أكثر من شريحة وأشرق لمدة دقيقة 2.5. يجب أن يكون العمود SPE بلمرة يكون صلبة غير شفافة بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل القناة مع 500 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ لشطف بعيدا المواد المتفاعلة الزائدة. هذا يغسل كما يزيل داخل البوليمر بوالمذيبات rogenic، وبالتالي خلق بنية المسام المفتوحة للعمود SPE عندما تجفف في الظروف المحيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق اثنين الأغشية الرقيقة سخانات إلى الجزء السفلي من الشريحة مع الشريط ناقلة للحرارة. الجانبين من سخانات تحتاج إلى أن تتماشى مع حافة واسعة لقنوات تمسخ والصلب بشكل منفصل (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتهت مكان خمس المزدوجات الحرارية في رقاقة من خلال قنوات القتلى الجانب المفتوح من كل رقاقة (انظر الشكل 2B). والمزدوجات الحرارية البقاء في هذه القنوات عبر الصحافة مناسبا. واستخدم الشريط لإصلاح مزيد من موقع المزدوجات الحرارية. </li></ol> 2. طريقة استخراج الصلبة المرحلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 96 ميكرولتر من الايثانول 70٪ مع الماء DEPC المعالجة وتعقيمها (منزوع الأيونات أو تصفيتها ميليبور). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من 25X تأمين RNA إلى 96 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في أنبوب واحد، وتكرار نفس الخليط مع الإيثانول بنسبة 100٪ في أنبوب منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 300ميكرولتر من العازلة قناة عن طريق خلط ما يلي: 75 ميكرولتر من 6 ثيوسيانات الجوانيدين M (GuSCN)، 150 ميكرولتر من بروبانول-2، 63 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز، و 12 ميكرولتر من 25X RNA الآمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 312 ميكرولتر من العازلة تحلل من خلط: 100 ميكرولتر من GuSCN M 6، 200 ميكرولتر من بروبانول-2، و 12 ميكرولتر 25X RNA الآمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الايثانول 70٪، 100٪ الإيثانول العازلة القناة، ومخازن تحلل في C ° 60 لمدة 10-20 دقيقة لتنشيط الآمنة RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتتوازن قناة ميكروفلويديك، تشغيل المخزن المؤقت القناة من خلال قناة SPE بمعدل تدفق قدره 0.8 مل / ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد سريعة عينة الاختبار في VTM في C ° 37 في حمام مائي، وإزالة عينة فورا من الحمام المائي بمجرد إذابة ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة عينة لمدة 10 دقيقة، ونقل 100 ميكرولتر من طاف إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت تحلل. استكمال الخليط بإضافة 6 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر RNA الناقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لخلط، وبعد زيادة ونقصان لل5 ثانية، تحميل المحللة بأكمله إلى حقنة سم مكعب بالتركيبة لوك 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل حلالة من خلال قناة SPE بمعدل تدفق قدره 0.8 مل / ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قناة SPE مع 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪، تليها الإيثانول ميكرولتر 100 of100٪ في 1 مل / ساعة. (هناك 50 قتيلا حجم ميكرولتر في الطرف المحاقن التي لن تحصل على دفع بها، في الواقع حتى بعد 50 ميكرولتر يمر القناة.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حقنة فارغة في علامة مل 0.5 و دفع الهواء من خلال قناة لتجف ذلك في 1 مل / ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل 67،5 ميكرولتر من نوكلياز خالية المياه من خلال القناة لأزل الأحماض النووية محددة عند 0.5 مل / ساعة، وجمع 13،5 ميكرولتر من nanoport في ميناء النفايات. (وفقدان السوائل ويرجع ذلك إلى حجم ميكرولتر 54 قتيلا في الطرف حقنة وقناة SPE). </li></ol> 3. RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 36،5 ميكرولتر من مزيج ماجستير RT-PCR خلال الخطوة الهواء الجاف (2.12) باستخدام الكواشف في مجموعات QIAGEN RT-PCR OneStep. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل RT-PCR الكاشف في nanoport في ميناء النفايات، وتخلط مع RNA للحصول على 50 ميكرولتر RT-PCR التالية رد فعل: 13.5 ميكرولتر مزال RNA في الماء مجانا نوكلياز، 4 ميكرولتر مزيج إنزيم RT-PCR، 10 ميكرولتر حل س، 10 μl1X 1 الخطوة العازلة، 2 ميكرولتر 25 ملم MgCl 2، 1 ميكرولتر التمهيدي 50 ميكرومتر إلى الأمام 5&#39;-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA &#39;C-3، 1 ميكرولتر التمهيدي ميكرومتر 50 العكسي 5&#39;-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 &quot;(2)، dNTP ميكرولتر، 0.75 ميكرولتر 1.0٪ W / V BSA، 0.73 ميكرولتر PEG8000 و5،02 المياه نوكلياز ميكرولتر مجانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخليط RT-PCR في قناة RT من فراغ لطيف (كنا الفراغ الجدار) وختم Nanoport مع تركيب مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 35 V لسخان 1. الحفاظ على الكواشف في قناة RT لمدة 30 دقيقة بعد سخان 1 equilibrates في C. ° 50 الحفاظ على الكواشف في قناة RT لمدة 15 دقيقة بعد equilibrates 1 سخان في 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق V 27 إلى 1 و 50 سخان V لسخان 2، الانتظار حوالي ثلاث دقائق أو حتى equilibrates 1 سخان في 60 و ديز؛ C وسخان 2 equilibrates في 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع الكواشف في القناة PCR عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة. وينبغي أن يستغرق حوالي 20 دقيقة لالكواشف لتدفق من خلال قناة اعوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يجعل من العينة إلى نهاية القناة اعوج، وجمع المنتجات PCR عند مخرج باستخدام pipettor بحجم مناسب والإكراميات. </li></ol> 4. PCR المنتجات كشفها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن استخدام DNA اجيلنت حساسية عالية في اختبار للكشف عن المنتجات. لتشغيل هذا الاختبار إخراج DNA اجيلنت حساسية عالية كيت من الثلاجة 30 دقيقة قبل إجراء الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على Bioanalyzer وفتح البرنامج الخبراء 2100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ميكرولتر 1 من المنتجات PCR في الاختبار واتبع بروتوكول اجيلنت ( <a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent 20Manual.pdf٪</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل وتسجيل البيانات. </li></ol>

<ol><li>Nicholls, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+Influenza%3A+The+Inside+Story%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Pandemic Influenza: The Inside Story.</a> PLoS Biol. 4, (2006).</li>
<li>WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/">http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/</a> (2009).</li>
<li>WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/">http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/</a> (2009).</li>
<li>Wenzel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+performance+determination+and+clinical+validation+of+the+novel+roche+realtime+ready+influenza+A%2FH1N1+detection+set%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).</li>
<li>Chan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+%28H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+the%22%5BJournal%5D)">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1.</a> Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).</li>
<li>Ginocchio, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiple+test+methods+for+the+detection+of+the+novel+2009+influenza+A+%28H1N1%29+during+the+New+York+City+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak.</a> Journal of. 45, 191-195 (2009).</li>
<li>Aeron, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+influenza+rapid+point-of-care+tests+in+the+detection+of+swine+lineage+A%28H1N1%29+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+and+Other+Respiratory+Viruses%22%5BJournal%5D)">Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).</li>
<li>Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+for+influenza+and+other+respiratory+viruses%3A+determining+performance+specifications+based+on+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).</li>
<li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Three+Influenza+A+and+B+Real-Time+Reverse+Transcription-PCR+Assays+and+a+New+2009+H1N1+Assay+for+Detection+of+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).</li>
<li>Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorthrup%2C+MA+%22Transducer%2793%2C+seventh+international+conference+on+solid+state+sensors+and+actuators%22">Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators</a>. , 924-926 (1993).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoplastic+microfluidic+device+for+on-chip+purification+of+nucleic+acids+for+disposable+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).</li>
<li>Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+microfluidic+chip+for+continuous-flow+polymerase+chain+reaction%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments.</a> Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chip+for+Molecular+Amplification+of+Influenza+A+RNA+in+Human+Respiratory+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens.</a> PLoS ONE. 7, e33176(2012).</li>
<li>Rådström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+PCR-Inhibitory+Components+in+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+PCR+Inhibitors+by+Silica+Membranes%3A+Evaluating+the+Amplicor+Mycobacterium+tuberculosis+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).</li>
<li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li>
</ol>

وقد أعلن الكتاب لا المصالح المتنافسة المالية.

قدم طريقة التشخيص هنا أثبتت قدرة على شريحة متكاملة من البلاستيك ميكروفلويديك لتضخيم أنفلونزا A RNA من عينات المرضى مع خصوصية عالية وحد اكتشاف أدنى مستوى في 13 قمنا بتصميم هذه الشريحة لنقطة المحتملة للتجارب الرعاية: (أ) درجة الحرارة وfluidic تم تبسيط السيطرة، (ب) هو رقاقة منخفضة التكلفة ومناسبة لتصنيع إنتاجية عالية باستخدام حقن صب، و (ج) هي رقاقة يمكن التخلص منها والمعدة للاستخدام مرة واحدة، وبالتالي تقليل القلق من التلوث المتبادل العينة. <p class="jove_content" styl...

تم الإبلاغ عن حالة وفاة الملايين من خلال أوبئة الأنفلونزا ثلاثة من القرن 20th 1. وعلاوة على ذلك، أعلن وباء أنفلونزا أحدث من منظمة الصحة العالمية (WHO) 2 في عام 2009، واعتبارا من أغسطس 1، 2010، 18449 حالة وفاة تم الإبلاغ من قبل منظمة الصحة العالمية 3. أظهرت هذا الوباء مرة أخرى عبء ارتفاع الأمراض المعدية، والحاجة إلى الكشف السريع والدقيق للأنفلونزا لتمكين سريع تأكيد المرض، حسب استجابة الصحة العامة والعلاج الفعال 4. هناك العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتشخيص الأنفلونزا، وتشمل هذه المناعية السريع، اختبار مستضد مباشرة الفلورسنت (DFA) وأساليب الثقافة الفيروسية. المناعية السريع تفتقر بشكل كبير حساسية 5-8، في حين أن الآخر طريقتين هي كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا 9. الاختبارات الجزيئية توفر مزايا متعددة بما في ذلك دورانها قصيرة sensit، الأوانivity، وأعلى نوعية. وقد تم العديد من الكيانات التجارية تعمل من أجل الاختبارات الجزيئية بسرعة (وتسمى أيضا اختبارات الحامض النووي أو ناتس) للأمراض المعدية، ويكون عدة فحوصات الانفلونزا في خطوط الأنابيب الخاصة بهم. لكن معظمها تتطلب خارج رقاقة إعداد العينات. أي من التعديلات مختبر تحسن سريري (CLIA) تنازلت الاختبارات الجزيئية دمج إعداد العينات في خرطوشة الفحص أو وحدة نمطية. المختبر على واحد في رقاقة التكنولوجيا تلعب دورا هاما في تطوير أجهزة اختبار نقطة من الرعاية. بعد إدخال شريحة PCR الأولى في 1993 10، وقد وضعت العديد من الجهود في تطوير رقائق النووي اختبار الحمض. ومع ذلك، سوى عدد قليل من هذه دمجت إعداد العينات الخام مع التضخيم المصب. لقد أثبتنا سابقا التصغير من عمود مرحلة استخراج الصلبة (SPE) في رقاقة ميكروفلويديك البلاستيك 11 و تطويرمنة وتعظيم الاستفادة من شريحة تدفق مستمر PCR 12. هنا، ونحن تمديد العمل السابق لدمج SPE مع RT PCR والخطوات في شريحة واحدة لإثبات التشخيص السريري وقدرتها على تضخيم الأحماض النووية من مريض مسحات (NP) والبلعوم aspirates.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> 1-dodecanol </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2،2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 196118-50G </td></tr><tr><td> 2100 Bioanalyzer </td><td> اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، كاليفورنيا </td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2-بروبانول </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 19516 </td></tr><tr><td> بينزفينون </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 239852-50G </td></tr><tr><td> BSA </td><td> الحرارية فيشر العلمية، pittsburge، PA </td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td> بوتيل ميتاكريليت </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 235865-100 مل </td></tr><tr><td> الناقل RNA </TD&gt; <td> QIAGEN، فالنسيا، CA </td><td> 1017647 </td></tr><tr><td> سيكلوهيكسانول </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> الاثيلين dimethacrylate </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 335861 </td></tr><tr><td> جلايكول الإثيلين dimethacrylate </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 335681-100ML </td></tr><tr><td> الزجاج حقنة 250 ميكرولتر </td><td> هاملتون، رينو، NV </td><td> 81127 </td></tr><tr><td> الجوانيدين ثيوسيانات </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 50981 </td></tr><tr><td> عالية الحساسية كيت DNA </td><td> اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، كاليفورنيا </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> الصحافة الساخنة </td><td> كارفر، اباش، IN </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JB ولد إيبوكسى </td><td> ماكماستر-CARR، إلمهورست، IL </td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td> بالتركيبة-لوك المحاقن </td><td> BD-الطبية، فرانكلين البحيرات، NJ </td><td> 309628 </td></tr><tr><td> المغنيسيوم كلوريد </td><td> الحرارية فيشر العلمية، pittsburge، PA </td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 494437 </td></tr><tr><td> ميتاكريليت الميثيل </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> M55909 </td></tr><tr><td> Nanoport </td><td> أبتشيرتش العلمية </td><td> N-333-01 </td></tr><tr><td> Nanoport تركيب </td><td> أبتشيرتش العلمية </td><td> F-120x </td></tr><tr><td> نوكلياز مجانا الماء </td><td> الحرارية فيشر العلمية، pittsburge، PA </td><td> PR-P1193 </td></tr><tr><td> OneStep RT-PCR عدة </td><td> QIAGEN، فالنسيا، CA </td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 41009 </td></tr&gt; <tr><td> إمدادات الطاقة </td><td> VWR، رادنور، PA </td><td> 300V </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز بعيدا </td><td> سيغما الدريخ، سانت لويس، MO </td><td> 83931-250ML </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td> النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا </td><td> AM7005 </td></tr><tr><td> السيليكا المجهرية </td><td> Polysciences، ارينغتون، PA </td><td> 24324-15 </td></tr><tr><td> حقنة مضخة </td><td> جهاز هارفارد، Holliston، MA </td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td> ناقلة للحرارة الشريط </td><td> ماكماستر، كار، إلمهورست، IL </td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td> المزدوجة الحرارية </td><td> أوميغا الهندسية، ستامفورد، CT </td><td> 5SRTC-TT-J-40-36 </td></tr><tr><td> الأغشية الرقيقة سخانات </td><td> مينكو، مينيابوليس، MN </td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td> الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker </td><td> UPV، اليابسة، CA </td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td> Zeonex </td> &lt;TD&gt; زيون المواد الكيميائية، لويزفيل، KY </td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

التشخيص السريع والفعال يلعب دورا هاما في السيطرة على الأمراض المعدية من خلال تمكين الإدارة الفعالة للمريض والعلاج. هنا، نقدم متكاملة رقاقة ميكروفلويديك بالحرارة مع القدرة على تضخيم الأنفلونزا الناجمة عن الفيروس في مسحات المريض (NP) والبلعوم aspirates. عند تحميل عينة المريض، الجهاز ميكروفلويديك يحمل بالتسلسل من على الرقاقة تحلل الخلايا وتنقية RNA والخطوات تركيز في المرحلة الصلبة استخراج (SPE)، النسخ العكسي (RT) وتفاعل البلمرة سلسلة (PCR) في RT-PCR الدوائر، على التوالي. يتم تنفيذ نقطة النهاية الكشف باستخدام Bioanalyzer خارج رقاقة (اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، كاليفورنيا). للأجهزة الطرفية، استخدمنا مضخة محقنة واحدة لدفع كاشف والعينات، في حين تم استخدام جهازي سخانات رقيقة مثل مصادر الحرارة لRT PCR والغرف. تم تصميم رقاقة لتكون طبقة واحدة ومناسبة لتصنيع إنتاجية عالية للحد من fabricatiفي الوقت المحدد والتكلفة. رقاقة ميكروفلويديك توفر منصة لتحليل طائفة واسعة من الفيروسات والبكتيريا، وقلة فقط من التغييرات في التصميم كاشف اللازمة لكشف مسببات الأمراض جديد لسعر الفائدة.

<html> ويرد نتيجة نموذجية في الشكل 3 لأنفلونزا A المصابة عينة غسل البلعوم. نظرا لكميات مختلفة من فيروس الانفلونزا في كل عينة مريض، فإن تركيز النهائي من الناتج PCR تختلف. وينبغي أن يكون نتيجة جيدة لديك انخفاض مستوى الضجيج، واثنين من قمم واضحة سلم (35 و10380 سنة مضت) وذروة منتج واحد في حجم المنتجات المصممة (107 بي بي) لعينة إيجابية. في حين أن المنتج يجب أن يكون ذروة نظريا غائبة لعناصر سلبية، لم نلاحظ زائفة قمم PCR بالقرب من مكان الانفلونزا محددة من التمهيدي-dimers تش...

وقد تم تطوير رقاقة متكاملة بالحرارة ميكروفلويديك لاستخدامها بوصفها التشخيص الجزيئي. رقاقة يؤدي استخلاص الحمض النووي، الناسخ العكسي، وPCR. يتم وصف طرق لانتاج وتشغيل الشريحة.

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن فيروس الإنفلونزا A باستخدام شريحة مائعية دقيقة. أولاً، يتم تمرير العينة مع محلول التحلل عبر قناة SPE لتحليل الفيروس واستخلاص الـ RNA، ثم يُحمّل كاشف R-T-P-C-R بالـ RNA المستخلص ويتم تشغيل قناة النسخ العكسي لتحويل الـ RNA الفيروسي إلى CDNA. بعد ذلك، يتم تمرير المزيج إلى قناة PCR لتضخيم الـ DNA، وتُستخلص النتائج التي توضح حجم وتركيز المنتج المضخم بناءً على إشارة الفلورة الناتجة عن الفصل الكهربائي الشعيري.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تقبل عينة المريض الخام، وتدمج عمليات استخلاص الحمض النووي، وتنقيتها، والنسخ العكسي، والتضخيم في شريحة واحدة. ولإنشاء لوحين، يتم توزيع حوالي تسعة جرامات من حبيبات XN X بالتساوي في مركز صفيحة معدنية، ثم توضع في مكبس ساخن عند 198 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم تطبيق ضغط ببطء ليصل إلى 2,500 PSI لمدة خمس دقائق أخرى. والآن، يتم وضع لوح واحد على قالب إيبوكسي تم تسخينه مسبقاً عند 157 درجة Celsius لمدة 10 دقائق، مع تطبيق ضغط ببطء ليصل إلى 1000 PSI لمدة 10 دقائق أخرى.بعد ذلك، وباستخدام قفازات حرارية، أخرج اللوحة والقالب من المكبس الساخن، ثم افصل اللوحة عن القالب قبل أن تبرد. قم بثقب ثلاث فتحات في الشريحة البارزة، فتحة واحدة عند كل من المدخل، ومنفذ التصريف، ومخرج القناة الموائعية الدقيقة. ثم اغسل الشرائح باستخدام IPA متبوعاً بـ RNAs away ومياه dianna's.جفف الرقاقات بالهواء، ولربط الرقاقات قم بالتسخين المسبق أولاً عند 131 degrees Celsius لمدة 10 دقائق، ثم اضغط عند 350 PSI لمدة 10 دقائق أخرى. باستخدام JB Weld Epoxy، قم بتثبيت المنافذ النانوية عند منافذ دخول النفايات ومنافذ الخروج بشكل منفصل، واتركها لتتصلب لمدة تتراوح من 15 إلى 24 ساعة. وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، اشطف قناة SPE بـ 50 µL من RNAs away متبوعة بـ 100 µL من الماء الخالي من النوكلياز.قم الآن بتعبئة قناة SPE بـ 4 µL من محلول التطعيم المُحضّر حديثاً لربط الميثاكريلات تشابكياً، ثم حضنها لمدة 10 دقائق في فرن UV، وأزل محلول التطعيم المتبقي باستخدام المفرغة. قم بتفكيك كتلة الكرات الدقيقة المجففة عن طريق النقر على الأنبوب وغطاؤه مغلق. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول عمود SPE المُحضّر حديثاً واستخدم جهاز vortex للمزج.قم بتحميل 4 µL من محلول SPE في نفس القناة، ثم أجْرِ الربط التشابكي عن طريق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 2.5 دقيقة على كل جانب، مما يؤدي إلى تكوين عمود SPE مبلمر أبيض معتم. اغسل القناة بـ 500 µL من الميثانول بتركيز 100% لشطف المتفاعلات الزائدة والمذيبات المسببة للحمى داخل البوليمر. قم بتثبيت سخانين ذوي غشاء رقيق في الجزء السفلي من الشريحة باستخدام شريط موصل حرارياً.لاحظ أنه يجب محاذاة جوانب السخانات مع حافة القنوات الواسعة لضمان المدة، وبشكل منفصل، ضع خمسة مزدوجات حرارية في الشريحة من خلال القنوات الجانبية المفتوحة والمسدودة لكل شريط شريحة. لتثبيت موقع المزدوجات الحرارية، أضف 4 µL من 25 XRNA secure إلى 96 µL من ethanol بتركيز 70% في أنبوب واحد، وإلى ethanol بتركيز 100% في أنبوب ثانٍ. قم أيضًا بتحضير 300 µL من channel buffer و 316 µL من lysis buffer.سخن المحاليل عند 60 °C لمدة 15 دقيقة، وذلك لتنشيط الـ RNA secure، ثم لموازنة القناة الموائعية الدقيقة. مرر منظم القناة عبر قناة SPE بمعدل تدفق 0.8 ml/h.الآن، يتم وضع عينة اختبار fava السريعة في وسط نقل الفيروسات (VTM) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تُخرج العينة فور ذوبانها. يتم طرد العينة مركزياً بسرعة 13,000 RPM لمدة 10 دقائق.انقل 100 µL من السائل الطافي إلى 300 µL من محلول التحلل (lysis buffer)، وأضف 6 µL من حامل RNA بتركيز 1 µg/µL، ثم استخدم جهاز المزيج الدوامي (vortex) للمزج. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي لمدة خمس ثوانٍ، ثم حمّل كامل المُحلل (lysate) في حقنة Luer-lock سعة 1 CC. مرر المُحلل عبر قناة SPE بمعدل تدفق قدره 0.8 mL/h.بعد ذلك، اغسل قناة SPE بـ 100 µL من الإيثانول بتركيز 70%، يليه 100 µL من الإيثانول بتركيز 100% بمعدل تدفق 1 mL/h. ضع حقنة فارغة عند علامة 0.5 mL وادفع الهواء عبر القناة لتجفيفها بمعدل 1 mL/h. الآن، قم بتمرير 67.5 µL من الماء الخالي من النوكلياز عبر القناة لاستخلاص الأحماض النووية المرتبطة بمعدل 0.5 mL/h، واجمع 13.5 µL من المنفذ النانوي عند منفذ النفايات.قم بتحميل 36.5 µL من المزيج الرئيسي لـ R-T-P-C-R. اخلط المزيج في منفذ النانو عند منفذ النفايات مع RNA القالب للحصول على تفاعل R-T-P-C-R بحجم 50 µL. ثم قم بتحميل مزيج R-T-P-C-R في قناة RT عن طريق تفريغ هوائي لطيف.أغلق المنفذ النانوي (nano port) باستخدام وصلة إغلاق. قم بتطبيق 35 فولت على السخان الأول. احتفظ بالكواشف في قناة RT لمدة 30 دقيقة بعد وصول السخان الأول إلى حالة التوازن عند 50 °C.احتفظ بالكواشف في قناة RT لمدة 15 دقيقة بعد وصول السخان الأول إلى حالة التوازن عند 95 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بتطبيق جهد كهربائي قدره 27 فولت على السخان الأول و50 فولت على السخان الثاني، وذلك لضبط السخان الأول عند 60 درجة مئوية والسخان الثاني عند 95 درجة مئوية. ادفع الكواشف إلى قناة PCR بمعدل 0.5 µL في الدقيقة.بعد حوالي 20 دقيقة، وعندما تصل الكواشف إلى نهاية القناة المتعرجة، اجمع نواتج PCR عند المخرج باستخدام ماصة ورأس ماصة بحجم مناسب لاختبار Agilent high sensitivity DNA. أخرج مجموعة Agilent high sensitivity DNA من الثلاجة قبل 30 دقيقة من الاختبار. قم بتشغيل جهاز bioanalyzer وافتح برنامج 2, 100 expert.قم بتحميل 1 µL من نواتج PCR الخاصة بالفحص واتبع بروتوكول Agilent. قم بتحليل البيانات وتسجيلها في سير العمل هذا. يتم خلط عينة البلعوم الأنفي للمريض مع محلول التحلل (lysis buffer) ثم وضعها على الشريحة.يتم تشغيل الشريحة وقراءة نواتج PCR لفيروس الإنفلونزا باستخدام شريحة الفصل الكهربائي الشعري التجارية. ونظرًا لاختلاف كميات فيروس الإنفلونزا في عينة كل مريض، فإن التركيز النهائي لناتج PCR سوف يتفاوت. يجب أن تظهر النتيجة الجيدة ضجيجًا منخفضًا مع قمم سلم واضحة عند 35 و10، و380 زوج قاعدي، وقمة ناتج واحدة عند حجم الناتج المصمم وهو 107 زوج قاعدي للعينة الإيجابية.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتشغيل شريحة الموائع الدقيقة للكشف عن فيروس الإنفلونزا.

microfluidic-chip-fabrication-and-method-to-detect-influenza

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

في هذه المقابلة ، والدكتور Klapperich يناقش تصنيع الأجهزة ميكروفلويديك بالحرارة وتطبيقها من أجل تطوير وسائل التشخيص الجديدة.

ميكروفلويديك طلبات للحصول على تشخيص احدة

وVirochip هو ميكروأري عموم الفيروسية في وقت واحد تهدف إلى الكشف عن جميع الفيروسات المعروفة فضلا عن الفيروسات الجديدة على أساس التماثل تسلسل الحفظ. نحن هنا لشرح كيفية تشغيل مقايسة Virochip لتحليل العينات السريرية عن وجود الفيروسات المعروفة وغير المعروفة على حد سواء.

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

وتقدم تكنولوجيا الكشف ampliPHOX اللونية كبديل غير مكلف للكشف عن ميكروأرس مضان. استنادا بلمرة ضوئية المنشأ ، ampliPHOX تنتج البقع البوليمر الصلبة مرئية للعين المجردة في دقائق معدودة. ثم يتم تصوير النتائج وتفسيرها تلقائيا مع حزمة برامج بسيطة لكنها قوية.

ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

قطيرة المنصات المرتكزة ميكروفلويديك من المرشحين واعدة للتجارب إنتاجية عالية نظرا لأنها قادرة على توليد بيكو لتر ، ذاتية مجزأة السفن بأسعار غير مكلفة كيلوهرتز. من خلال التكامل مع الأساليب مضان سريع وحساسة وعالية الدقة الطيفية ، يمكن أن كميات كبيرة من المعلومات التي يتم انشاؤها داخل هذه النظم استخراج بكفاءة ، وتسخيرها والاستفادة منها.

طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

هذه الطريقة يصف استخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ نظام التصوير القائم للكشف عن فيروس H1N1 في السائل قصيبية (بال) غسل من الفئران المصابة في حساسية عالية. لا يمكن أن يؤديها هذه المنهجية في 96 - أو 384 لوحة جيدا، يتطلب &lt;10 ميكرولتر من حجم المواد واختبار لديه القدرة على فحص متزامن من مسببات الأمراض متعددة.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.

رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

نقدم بيوشيب القائم ميكروفلويديك الكهروكيميائية للكشف عن تهجين الحمض النووي. التالية ssDNA التحقيق functionalization، يتم دراسة خصوصية وحساسية، والحد من الكشف مع أهداف ssDNA تكميلية وغير تكميلية. وتوضح النتائج أن تأثير الأحداث تهجين الحمض النووي على النظام الكهروكيميائية، مع حد الكشف عن 3.8 نانومتر.

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

باستخدام استراتيجية المصفوفة الدقيقة المطبوعة للجليكان ، تم تصغير مقايسة الألواح التقليدية المكونة من 96 بئرا لتحليل شفق هيماجلوتينين فيروس الأنفلونزا A وخصوصيتها للمستقبلات المحتوية على حمض السياليك.

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

صمم منصة biosensor موائع جزيئية وملفقة استخدام تكنولوجيا مقاوم الضوء الفيلم جافة منخفضة التكلفة للتحديد الكمي لمختلف التحاليل السريعة والحساسة. يسمح هذا النظام تستخدم مرة واحدة لقراءات الكهروكيميائية لفحوصات المرتبط بالانزيم على-رقاقة-معطلة عن طريق تقنية وقف التدفق.

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

الموائع الدقيقة هي أداة قوية لتطوير الاختبارات التشخيصية. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى معدات ومواد باهظة الثمن ، بالإضافة إلى تقنيات التصنيع والمناولة الشاقة. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول تصنيع جهاز الموائع الدقيقة الأكريليك للمقايسات المناعية المغناطيسية الدقيقة والجسيمات النانوية في بيئة منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام.

الطحن الدقيق للتحكم العددي بالكمبيوتر لجهاز أكريليك الموائع الدقيقة مع تقييد متداخل للمقايسات المناعية المغناطيسية القائمة على الجسيمات النانوية

يمكن أن تسبب مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة التهابات الجهاز التنفسي وتؤدي إلى مشاكل صحية خطيرة إذا لم يتم اكتشافها بدقة وعلاجها على الفور. يوفر الكشف السريع والدقيق عن هذه العوامل الممرضة عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة إدارة فعالة ومكافحة التهابات الجهاز التنفسي في البيئات السريرية.

الكشف السريع عن مسببات الأمراض البكتيرية التي تسبب التهابات الجهاز التنفسي السفلي عن طريق التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة القائمة على رقائق الموائع الدقيقة

اكتشف تصنيع رقاقة ميكروفلويدية حرارية بلاستيكية للكشف عن فيروس إنفلونزا أ باستخدام عينات المرضى الخام. تدمج الرقاقة استخراج الحمض النووي والتفاعل البوليميري المتسلسل في عملية واحدة مبسطة.

ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا

استكشف المزيد من الفيديوهات