Name: 簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ、ヒト全血から好中球細胞外トラップ（NET）を単離する簡便なプロトコル。PMA刺激によるNETosis誘導と、がん細胞接着アッセイを用いたNETの機能評価方法を解説します。

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著者は、この作品の構築において中心的な役割を果たしたポール・クベス博士の指導に感謝したいと思います。

注：全ての実験は、地元の機関倫理指針に従って行った。 1.採血<ol><li>肘前venipuctureを通じて、グリーントップ（ヘパリン処理）チューブに健康なボランティアからの血液の14のチューブを収集し、氷上にセトリングする前に、各チューブを反転させる。最適な好中球の収量を確保するために、実験の15分 - 10内の血液を収集する。 </li></ol>全血から2.好中球の単離<ol><li>血液を希釈するCaおよびMgを含まないPBS 5mlの血液の各緑のトップチューブを洗ってください。 4×50ミリリットルコニカルチューブのそれぞれにおいて、RTでリンパ球分離媒体（LSM）の15ミリリットルを追加します。 18 G針を使用すると、鋭いLSM-血液インタフェースを作成する、慎重にLSMに希釈された血液の層60 mlシリンジに取り付けられた。 注：可能な限り層の混合を避ける。 </li><li>休憩なしで21℃で30分間、800×gで遠心し。 注：突然の休憩することができます異なる層の混合を引き起こす。 </li><li>底に赤血球および好中球堆積物を観察します。吸引し、底面のみ赤色層を残して、リンパ球および単核細胞が含まれているこれらの層の間のインタフェースを取り除くことを確認して、トップ2層（プラズマとLSM）を捨てる。 </li><li>各チューブに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）20mlの6％デキストラン溶液20mlを加える。穏やかに赤血球および好中球の層と混合し、室温で30分間静置する各チューブを反転させる。 注：これは赤血球（RBC）は底に沈降することができます。 </li><li> 30分後、新鮮なチューブに好中球の豊富な上清を転送し、RBCペレットを捨てる。 5分間、4℃で450×gで遠心し上清。遠心分離後、上清を捨てる。ペレットは、主に好中球およびいくつかのRBCが含まれます。 </li><li>滅菌水の4.5ミリリットルに溶解緩衝液の0.5ミリリットルを追加することによって、溶解液を準備します。 TでRBCを残りの溶解彼は1チューブにすべて再懸濁させたペレットを転送する、ソリューションを溶解する5ミリリットルを用意しました。 10分間の暗所に室温で溶解を許可します。 </li><li> 5分間、4℃で450×gで遠心し。上清を捨て、残りの溶解溶液を取り除くために、4℃で450×gで再びCaおよびMgと遠心することなく、5ミリリットルのPBSでペレットを洗浄。この時点で得られたペレットは、好中球が含まれています。冷3％RPMI 30mlにペレットを再懸濁し、氷上に置く。 注：3％RPMI、3％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI培地を補充することにより行われる</li><li>メチレンブルー染色を使用してサンプルの純度を確認してください。 &gt; 95％の細胞は、マルチ肺葉核を有する顆粒にする必要があります。細胞の&gt; 95％の生存率を確認し、最終的な好中球の収量をカウントし、トリパンブルー染色を使用してください。 5×10 6の好中球/ mlの最終濃度を得るために、氷冷3％RPMI中の好中球を希釈する。 </li></ol> 3.のNETジェネレーション<ol><li> 500 nは好中球を刺激するPMAのM（好中溶液30ml当たり）、37℃、5％CO 2で4時間20mmのグリッド150×25ミリメートルフラット組織培養皿上でインキュベートする。これはNETosisできるようになります。 </li><li>刺激の4時間後、軽く底に付着したネットや好中球の層を残し、培地を吸引除去し、捨てる。この層を破壊しないでください。 </li><li>皿当たりCaおよびMgなし冷PBS 15mlの合計を使用して、底部からすべての付着性材料をリフトオフするためにシャーレの底にPBS 15mlをピペッティングすることによって、各皿の底を洗浄する。 </li><li> 4℃で450×gで10分間15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に各皿（ステップ3.3）を洗浄することから得られた溶液を収集します。好中球および残りの細胞は、無細胞NETリッチな上清を残して、底部にペレット化します。 </li><li>ディバイド1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに上清と4℃で18000×gで10分間スピン。これは、すべてのDNAがペレット化することができます。 注：より大きなTUでの遠心分離BESような高い速度は、通常の遠心分離機に達成可能であれば簡単に、より少ない時間がかかり、それ以外の場合は、高速のマイクロ遠心機を使用するために小さいチューブ内の上清を分割する必要があります。 </li><li>上清を捨て、100μlのPBSあたり2×10 7の好中球に相当する濃度に氷冷PBSで一緒に取得したすべてのペレットを再懸濁します。これは、その後の実験のために使用することができる無細胞NETストックが得られる。 </li><li>分光光度法または代替のDNAの定量化ツールを使用して得られた試​​料中のDNAの濃度を測定する。 180 ng /μLで - サンプル中の適切な濃度は、140との間の範囲でなければならない。 </li></ol> 4. NET-癌細胞の静的接着アッセイ<ol><li>以前に96ウェル平底プレートにウェル当たりNET株式を取得し、暗所で4℃でコートウェルO / Nに許可する100μlのを追加します。 </li><li> 12〜20時間後に、細胞の均一な単層の形成を確認顕微鏡下で井戸の底の自由のNET（ 図1）。この時点で、優しく下部にNET単分子層を破壊することを確認しないこと、ウェルからすべての非接着材料を吸引。 </li><li>各ウェルに、1％ウシ血清アルブミン（BSA）のブロッキング溶液100μlを加え、室温で1時間放置する。 </li><li> 0.25％トリプシン溶液2mlを用いたT-75フラスコからA549癌細胞を切り離す。一度、デタッチ5分間、4℃で450×gでトリプシン処理した細胞と遠心分離機にA549のメディアの10ミリリットルを追加します。 100μlのメディアごとに2×10 4癌細胞の濃度を得るために、メディアで上清と再懸濁細胞を捨てる。 NOTE：A549細胞を別々に増殖させた。簡単に述べると、細胞を培養し、10％FBSおよび1％ペニシリンストレプトマイシンを含有するDMEM F12培地中で維持し、37℃、5％CO 2でインキュベートした。 70一度 - 80％の細胞集密度に達した後、それらを0.25％トリプシン-EDTAを用いて剥離し、同じ培地に再懸濁した上述した。 </li><li>培地1ml当たりCFSEを1μl添加し、室温で10分間染色し去ることによりCFSEを用いて染色癌細胞。染色した後、5分間、4℃で450×gで遠心ダウンその後、100μlのメディアあたり2×10 4の癌細胞の濃度を得るために、培地の初期容量で上清を再懸濁細胞を捨てる。 </li><li>穏やかに吸引し、ブロッキング溶液とウェル当たりNETの単層の上に、100μlのと等価であるメディアに2×10 4がん細胞を追加し、37℃、5％CO 2で90分間付着させ、ブロッキングのNETの1時間後。静かに細胞を吸引し、非接着細胞を洗浄するために、各ウェルに100μlのPBSを追加。 </li><li>いくつかのウェルでは、ネットを分解するために洗浄を10分間ウェル当たりDNAse1の1000Uを追加します。これは、負の対照として役立つ。他のウェルでは、車両制御（VC）として機能するもの、10分間、ウェルあたり100μlの滅菌水を追加します。 注：conditioあたり3回の反復nは、通常、サンプルサイズを増加させるために行われる。 </li><li>吸引し、ウェルが底にのみNETは、接着、癌細胞を残すのすべての液を捨て、。 （ 図1）NETSに付着する癌細胞を固定し、蛍光顕微鏡下でアッセイを読み取るためにウェルあたり4％ホルムアルデヒド溶液100μlを加える。プロットし、結果を分析する（ 図3）。 </li></ol>

<ol><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873(2010).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs%3A+a+new+strategy+for+using+old+weapons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li>
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<li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Med+J+Malaysia%22%5BJournal%5D)">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li>
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<li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones%2C+acting+on+the+TERT+gene%2C+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li>
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<li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death%3A+a+predominant+role+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366(2012).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない

このビデオで実証好中球細胞外トラップ単離プロトコールは、好中球の単離およびNET形成のために文献で使用される様々なテクニックを兼ね備えています。これは、かなり複雑な変数のプロセスを簡素化し、他のプロトコルよりも少ない工程で精製された無細胞ネットを分離するための非常に信頼性と複製可能な方法を提供しています。また、容易に入手可能な試薬をプロトコル簡潔に追加し、大幅にコストを削減使用される。 NET濃度は容易に特定の目標（17）に合わせて操作することができるように、静的接着アッセイに向けてのNETのアプリケーションは、この分離技術によってもたらされる柔軟性を実証するのに役立つ。したがって、示された技法によって単離さNETは、様々な動的接着アッセイを含むアッセイの種類、遊走アッセイ、増殖アッセイの免疫蛍光および共焦点イメージング、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、ならびに伝統的なウェスタンブロッティングのために使用することができる。 </p&gt; その成功のために重要であるこのプロトコルのステップ数がある。まず、好中球が誤ってアポトーシスに至る分離プロセス中に活性化されてもよい。それは、ヒュー...

好中球細胞外トラップ（のNET）タンパク質とヒストンの何百によって装飾された外DNAの鎖から構成される新たに発見された好中球由来の要素です。これらは、特定の刺激後の感染および炎症の文脈における好中球によって分泌され、それらが最初に感染に対する好中球の防御機構の一部であることが認められた。これらは、最初の細菌、ウイルスおよび真菌1-3を含む種々の微生物の侵入者の捕獲を促進することが示された。微生物の捕捉することは、両方の直接NET関連タンパク質3,4及び間接的に食細胞5,6の地元の募集を通じてによってその破壊につながる。のNETの役割は、しかし、防衛をホストするために制限されていないようです。より最近では、彼らは、自己免疫疾患7,8、血栓9、妊娠関連障害10、さらに癌の進行において重要な役割を果たすことが示されている11,12。したがって、NETは、多様な生理学的プロセス、多数の重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような研究の新規な性質を考えると、多くのNETは、それらの効果を発揮するメカニズムについて解明されていない。ここで、我々は、好中球の不在内のネットの単離のための簡便法を提示する。 次のビデオでは、我々は、ヒト全血からのNETを単離するために簡略化され、容易な技術を実証する。無細胞のNETは、次いで、接着、増殖および遊走のような多くのアッセイならびにブロッティング、染色、imuunofluorescence含むインビトロの実験で使用することができる。他のプロトコルは、しかし、彼らは通常、長い複雑な、高価な、そして多くの場合、低い収率13である、13、19が存在する。この簡略化されたプロトコルは、基本的な試薬を使用し、好中球を単離するために必要なステップの数が減少するので。手順の長さを最小化する収量を最大化しながら、再。 以下の方法は、好中球の単離のための別の技術は、以前に生きた好中球の非常に純粋な試料を得た単純なプロトコルを得るために、文献に記載され組み合わせる。文献で ​​示唆したように、静脈血をEDTAチューブに回収し、好中球活性化14を回避するために10分以内に使用されている。我々は、ヘパリン化全血、最初にBoyumら15によって記載され、フィコール密度遠心分離技術から適応方法から顆粒球および赤血球を分離するためにリンパ球分離培地（LSM）密度勾配遠心分離を使用する。 LSMナトリウムピリオドンのためのジアトリゾ酸ナトリウムを代入し、好中16-18を単離するために多くの研究において成功裏に使用されてきたBoyum製剤の変形例である。 差動密度遠心分離後、単球およびリンパ球は廃棄される。赤血球は、次いで沈降さ6％デキストラン溶液14を使用して、残りのRBCをトリパンブルーおよびメチレンブルー染色によって確認された純粋な好中球の集団を得るために溶解される。 多くの物質は、リポ多糖（LPS）、および酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびインターロイキン（IL-8）-3,5,6-含む、 インビトロおよびインビボの両方NETosisを誘導するために使用されてきた。以下のプロトコールでは、単離された好中球はアポトーシス19,20を促進することなく一貫した信頼NET形成を可能にするのに十分な濃度であることが示されている4時間、500 nMのPMAで刺激する。 単離後、我々は、このプロトコルから得られた無細胞のNETは、接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。 DNAse1で消化し ​​、前述のようにのNETを分解するために使用されるので、制御2,3,11として機能する。他のオプションはNET formatiを阻害する好中球エラスターゼ阻害剤（NEI）の使用を含むこれ、上の目標は、NET形成を阻害するのではなく、それらの分解11を達成するためにあるときに許容可能な代替手段です。 NEIが変化多数の機能を有するが、それは以前にNET堆積が、クロマチン脱凝縮、核の脱顆粒及び好中球の死12の閉塞を通してNEIによって阻害され得ることが示されている

<table><tbody><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、変性、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>リンパ球分離培地 (LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン塩酸塩 (粉末)</td><td>Spectrum</td><td>DE130</td><td>6% デキストラン溶液は、PBSにCaおよびMgを添加し、6%デキストラン粉末</td></tr><tr><td>RPMI-1640培地にL-グルタミン</td><td>を添加することによって作られます</td><td>350-000-CL</td><td>3% RPMI 溶液は、3% ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse Lysing バッファー</td><td>BD Biosciences 555899</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)</td> <td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> を RPMI に添加して作られます。<td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>20 mm グリッド (150 x 25 mm)</td> <td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のnet）の単離と取扱い

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

好中球細胞外トラップ（ネットは）最近、好中球の抗菌装備一式の一部として同定されている。別に感染との戦いにおける役割から、最近の研究は、それらが癌の進行を含む多くの他の疾患プロセスに関与し得ることを実証した。精製されたネットを分離すること、これらの機能の研究を可能にする重要な要素である。 このビデオでは、我々は容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの無細胞NET単離の簡便法を実証する。単離されたNETは、その後、免疫蛍光染色、ブロッティングまたは様々な機能的アッセイのために使用することができる。これは、好中球自身の潜在的な交絡効果がない場合に、それらの生物学的特性の評価を可能にします。 密度勾配分離技術は、健康なドナーの全血から好中球を単離するために使用される。単離された好中球は、その後12-マイアにより刺激されるNETosisを誘導するISTATE 13-アセテート（PMA）。活性化された好中球は、その後破棄され、無細胞NETストックが得られる。 次に、A549ヒト肺癌細胞との接着アッセイにおいて使用することができる方法を孤立のNET実証する。 NETストックをコーティングするために追加された96ウェル細胞培養プレートのO / Nであり、ウェルの底に適切なNET単層形成を確認した後、CFSEで標識したA549細胞のウェルに使用される。接着細胞を、ニコンTE300蛍光顕微鏡を使用して定量化される。いくつかのウェルでは、1000U DNAse1はネットを分解するために数え10分前に追加されます

NETは静的接着アッセイの成功の達成は、癌細胞の添加前のNETの単層（ 図1）を有するウェルの適切なコーティングを必要とします。それ以降のすべてのステップは、その層を破壊しないように注意して行う必要があります。のNETの適切な層を形成する場合には、 図2Aおよび図2Cに示すようにのNETに大きな癌細胞の接着を見ることが期待される。この効果は、 図2B及び図2Dに示すようにのNETを分解するDNAse1の添加によって抑止される。逆に、車両制御（ 図3）の存在下でのNETにA549接着の有意な減少があってはならない。高倍率視野（HPF）当たりの平均癌細胞接着の良好な推定を得るためには、ウェル当たり少なくとも4つのランダムHPFSをカウントすることが推奨される。よく、技術的な問題が原因のNETでコーティングされていないフィールドはCOUNのために考慮されるべきではないこれらとしての設定結果を改ざんする可能性があります。 <p cla...

以下のプロトコールでは、容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの好中球細胞外トラップ（のNET）を単離するための非常に簡単な方法を記載している。次に、単離されたNETは、癌細胞を用いたin vitro接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

本実験の全体的な目的は、入手容易な試薬を用いて、ヒト全血から好中球細胞外トラップ（NETs）を単離するための簡便なプロトコルを提示することである。まず、分画遠心法を用いてヒト全血から好中球を単離し、次に、単離した好中球をPMAで刺激することで、NETosisとも呼ばれるNET形成を誘導する。次に、細胞遊離ネット分離物を用いてプレートを調製し、そこにがん細胞を添加して、ネットが細胞の接着にどのように影響するかを実証します。その結果、ネット単層の添加によってがん細胞の接着が改善され、ネットが分解されるとこの接着が減少することが示されます。DNase Iを用いたこの手法の視覚的な実演は極めて重要です。この手法は新規であり、好中球細胞外トラップ（NETs）は構造が極めて脆弱であるため、取り扱いが非常に困難です。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、ヘパリン処理済みの緑色キャップチューブ14本に、新鮮なヒト全血を計80 mL採取します。各チューブを開け、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBSを5 mLずつ加えます。次に、室温で4本の50 mLコニカルチューブそれぞれに、15 mLのリンパ球分離培地（LSM）を加えます。続いて、60 mLシリンジに装着した18ゲージの針を用いて、希釈した血液をLSMの上に慎重に層状に重ね、LSMと血液の間に明確な界面を作ります。チューブを21 °Cで800 ×g、30分間、ブレーキなしで遠心分離します。遠心分離停止後、上部の2つの液層とそれらの間の界面を慎重に吸引して廃棄し、最下層の赤色層のみを残します。このペレットには赤血球と好中球が含まれています。各チューブに20 millilitersのPBSと20 millilitersの6%デキストラン溶液を加えます。各チューブを静かに転倒混和し、室温で30分間静置します。これにより、赤血球がチューブの底に沈殿します。次に、上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。上清を4°C、450 ×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄して好中球に富むペレットを残します。4.5 mLの滅菌水に0.5 mLの溶解バッファーを加えて、溶解液を調製します。各チューブに溶解液を計5 mL加え、すべてのペレットを1つのフラスコにまとめます。残存する赤血球を溶解させるため、フラスコを室温の暗所に10分間置きます。好中球を4°C、450 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS 5 mLでペレットを洗浄します。その後、サンプルを4℃、450 ×gで再度遠心分離し、残存する溶解液を含む上清を除去します。好中球ペレットを3%胎児牛血清を添加した冷RPMI培地 30 mLで再懸濁し、好中球細胞外トラップ（NETs）の形成を促進させるため、チューブを氷上に置きます。150 mm × 25 mmの平底組織培養皿に入れた30 Lの好中球懸濁液に、500 nMのPMAを添加します。20 mmのグリッドを用いて、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で4時間インキュベートします。インキュベート後、培養皿の底に付着したNETsと好中球の層を乱さないように注意しながら、培地を緩やかに吸引して除去します。次に、ピペットを使用して、各ディッシュの底をカルシウムおよびマグネシウム不含の冷PBS 15 millilitersで洗浄し、底面からすべての付着物質を除去します。洗浄液を15 milliliter用コニカルチューブに回収し、450 ×gで10分間遠心分離します。4 °Cにおいて、好中球および残りの細胞が底面にペレットとして回収されます。細胞除去後のNETs含有上清を、複数の1.5 mLチューブに分注し、4 °Cで18,000 ×gにて10分間遠心分離します。DNAをペレット化させるため、上清を捨て、ペレットをPBSで再懸濁し、濃度がPBS 100 µLあたり2 × 10⁷ 個の好中球に相当するように調整します。この細胞除去済みNETsストックを、以降の実験に使用できます。分光光度法を用いてサンプルのDNA濃度を測定します。適切な濃度範囲は1 µLあたり140～180 ngとし、96ウェル平底プレートの各ウェルにネットストックを100 µLずつ分注します。ウェルをコーティングするため、プレートを4 °Cの暗所で一晩インキュベートします。12～20時間後、顕微鏡を用いて、ウェルの底にセルフリーネットの均一な単層が形成されていることを確認します。単層が確認できたら、ウェルから非付着物質を静かに吸引除去します。底面の単層を乱さないように注意してください。これが本手順において最も困難な点です。適切な単層を維持するためには、プレートを非常に慎重に扱う必要があります。すべての試薬と細胞をウェルの壁面に沿ってゆっくりと加え、非常に穏やかに吸引し、吸引チップでウェルの底に触れないようにしてください。非接着物質を除去した後、1% 牛血清アルブミンブロッキング溶液 100 µLを各ウェルに穏やかに加え、室温で1時間放置します。ネットモノレイヤーが乱れる可能性があるため、プレートを撹拌または振動させないでください。次に、70〜80% コンフルエントに達した時点で回収し、5 49 癌細胞を準備します。標準的な手法を用いて、100 µLあたり2 × 10⁴ 個の濃度になるように培地で細胞を再懸濁します。培地 1 mLあたり 1 µL のCFSeを添加して細胞を染色し、室温で10分間放置します。次に、細胞を4°Cで450 ×gにて5分間遠心分離します。上清を捨て、培地あたりの癌細胞濃度が2 × 10⁴ cells/100 µLになるように、元の体積の培地で細胞を再懸濁します。Netコートプレートを取り、ブロッキング溶液を穏やかに吸引除去します。次に、各ウェルにがん細胞懸濁液を100 µLずつ加え、37 °C、5% CO2条件下で90分間、細胞をプレートに接着させます。液体を完全に吸引し、一部のウェルにはNETsを分解させるためにDNase Iを1000 units加え、10分間静置します。また、別のウェルにはコントロールとして滅菌水を100 µLずつ加え、10分間静置します。続いて、各ウェルから液体を穏やかに吸引し、100 µLのPBSで洗浄して、非接着細胞を除去します。5〜49個の細胞を吸引し、ウェル内の溶液をすべて廃棄して、底面のネットと接着癌細胞のみを残します。次に、細胞を固定するために、1ウェルあたり100 µLの4%ホルムアルデヒド溶液を添加します。直ちにプレートを蛍光顕微鏡に移してアッセイを読み取り、データ解析ソフトウェアを用いて結果をプロットおよび解析します。細胞を含まないネットを、5 49がん細胞を用いた静的接着アッセイに使用した。光学顕微鏡観察により、がん細胞がネットの単層に強く接着することが示された。in vitro。この接着性は、ネット単層がDNAaseによって分解された後に低下しました。ラベル化したA549がん細胞の蛍光顕微鏡観察により、これらの結果が確認されました。ネット単層へのA549細胞の結合は、高倍率視野あたりの細胞数をカウントすることで定量化されました。ここに示すように、ビヒクルコントロールでは、ネットへのがん細胞の接着に変化は見られませんでした。しかしながら、DNAseが存在する場合、ネットへのがん細胞の接着は著しく減少しました。このビデオを視聴することで、全ヒト血からネットを単離し、処理する方法を十分に理解できるはずです。これらの細胞除去済みネット単離物は、免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、ウェスタンブロッティングなど、さまざまな手法に利用することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

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本稿では、膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせた生細胞解析システムを利用して、好中球細胞外トラップ(NET)を定量する自動化されたハイスループット法を紹介します。...

ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

この定義されたプロトコルは、 in...

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

学ぶ、ヒト全血から好中球細胞外トラップ（NET）を単離する簡便なプロトコル。PMA刺激によるNETosis誘導と、がん細胞接着アッセイを用いたNETの機能評価方法を解説します。

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

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