Name: Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Изучите метод проточной цитометрии для измерения вложений и интернализации вируса гриппа А в клетках эпителия лёгких A549. Этот подход позволяет количественно оценить взаимодействие вируса с клетками-хозяевами.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантом Швейцарского национального научного фонда (31003A_135278) к SST. СС является бенефициаром докторской гранта Фонда исследований AXA. Мы благодарим Патриция Нигг за помощь в оформлении рисунке 1.

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Наш протокол описывает простой способ измерения вложение вирусов и интернализации с помощью проточной цитометрии. Это позволяет использование меченых вирус, который имитирует более близко вирусные инфекции по сравнению с использованием вирусоподобных частиц (VLP) дикого типа. В то время как наш протокол был оптимизирован для измерения привязанность и интернализации IAV он может быть легко адаптированы для других вирусов. Кроме того, как проточной цитометрии используется для считывания, со-окрашивание могут быть легко до...

Вступление вируса гриппа А (ИФО) является многоступенчатый процесс, который начинается с связывание вируса с рецепторами на плазматической мембране клеток-мишеней 1. Рецептор IAV является сиаловой кислоты который присутствует на большом разнообразии гликопротеинов и гликолипидов. Гемагглютинина (HA), белок IAV который присутствует в вирусной оболочке связывается с сиаловой кислотой и тем самым опосредует прикрепление вирусных частиц в плазменной мембране клеток-мишеней 2. Вирус проникает в клетки через клатрин эндоцитоза, но и альтернативные пути доступа, такие, как макропиноцитозом, были описаны 3-6. Взаимодействие между НА и сиаловой кислоты оказывается достаточным для опосредования и, привязанность и запуска интернализации вирусных частиц 7. Тем не менее, альтернативные рецепторы входа были предложены и их роли в IAV вступления в настоящее время расследуются 1,8,9. Дворняжкаrently, предпринимаются усилия для выявления факторов, принимающих, которые участвуют в жизненном цикле вируса с целью разработки крайне необходимых новых противовирусных лечения 10-12. Вирус запись будет благоприятным шагом для таргетинга рост ИФО для того, чтобы блокировать вирусную инфекцию при первой точки. Измерение различные этапы IAV вступления экспериментально сложным, как правило, большое количество вируса требуется, чтобы обнаружить входящий вирус. Кроме того, дальность обнаружения изменений в записи вируса только линейные связи с отсутствием репликации вируса. Это подчеркивает необходимость для анализов с высокой чувствительностью. Анализ приведем позволяет обнаруживать прикрепленной вируса на клеточной поверхности, а также обнаружение вируса интернализованной по отношению к общему количеству вируса клеточно-ассоциированного. Использование биотинилированного вируса дикого типа обеспечивает удобное измерение с помощью окрашивания СТВ-Cy3 и считывания с помощью проточной цитометрии. Биотинилированный вирус холодной границу к ячейкес, чтобы вложение, но предотвратить интернализацию вирусных частиц. Клетки могут быть фиксированной, проницаемыми и окрашивали STV-Cy3 для измерения прикрепленный вирус. Сигнал от внеклеточных вирионов, прикрепленных может быть отменен, если блокирующий шаг применяется до фиксации, при котором клетки инкубируют с немеченого стрептавидина (СТВ). На следующем этапе, после прикрепления биотинилированного IAV, температура сдвигается до 37 ° С и интернализации вирусных частиц дают проходить. Интернализованная частицы защищены от связывания СТВ тем самым позволяя дискриминацию между вне- и внутриклеточных вирусов. За экспериментальных условиях, четыре образца требуется: &#39;0 мин&#39;: Первый образец, обозначенный &quot;0 мин&quot;, состоит в измерении вирус холодной переплете на клеточной поверхности. &#39;0 мин + СТВ &quot;: Второй образец, обозначенный&quot; 0 мин + СТВ &quot;, дает интенсивность сигнала линии эксперимента. Прикрепленный вирус заблокировал остроумиеч СТВ и сигнала после окрашивания STV-Cy3 должны быть значительно ниже, по сравнению с &quot;0&quot; мин образца. &#39;30 Мин &quot;: Третий образец, &#39;30 мин &#39;содержит прилагается и внутреннюю вирус из-за температурного сдвига до 37 ° С в течение 30 мин. &#39;30 Мин + СТВ &quot;: Четвертый образец, &#39;30 мин + STV &#39;меры внутриклеточный фракция вирусов. Блокирующий шаг СТВ наносится после 30 мин инкубационного периода. В результате вирусные частицы на поверхности клетки связаны СТВ оставив только интернализированные вирусы для окрашивания СТВ-Cy3. Относительное количество интернализованной вируса может быть вычислена как отношение интернализованной вируса (измеренной в &#39;30 мин + СТВ &#39;образца), деленное на общее количество вируса (описываемой &#39;30&#39; мин образца). В качестве контроля мы предлагаем включить макет-инфицированные клетки. Сигнал после СТВ-Cy3 окрашивания макет-инфицированных клеток дает фонПолученный от протокола окрашивания. Контрольную для крепления IAV является предварительная обработка клеток с бактериальной нейраминидазы (НА). NA отщепляет сиаловой кислоты от гликопротеинов, сотовых удаляя рецепторы крепления с клеточной поверхности. Азид натрия (SA) является мощным ингибитором метаболических и, таким образом, блоки 13 эндоцитоза. Клетки, обработанные азида натрия должен быть положительным для вируса связывания, но отрицательным для интернализации.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Пенициллин-стрептомицин</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>глубокоскважинные пробирки (1,2 мл микропробирки)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; Lucerna chem&nbsp; Электронная микроскопия науки</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ультрацентрифужные пробирки</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>азид натрия</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>бактериальная нейраминидаза/ сиалидаза</td><td>Сигма-Олдрич</td><td>N6514-1УН</td><td></td></tr></tbody></table>

Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Прикрепление к клеткам-мишеням с последующей интернализацией является самым первым шагом в жизненном цикле вируса гриппа А (IAV). Здесь мы приводим подробный протокол измерения относительных изменений в количестве вирусных частиц, которые прикрепляются к клеткам A549, эпителиальной клеточной линии легких человека, а также в количестве частиц, которые интернализуются в клетку. Мы используем биотинилированный вирус, который легко обнаруживается после окрашивания стрептавидином, меченным Cy3 (STV-Cy3). Мы описываем выращивание, очистку и биотинилирование A/WSN/33, широко используемого лабораторного штамма IAV. Холодносвязанные биотинилированные частицы IAV на клетках A549 окрашивают STV-Cy3 и измеряют с помощью проточной цитометрии. Чтобы исследовать поглощение вирусных частиц, вирусу, связанному с холодом, позволяют интернализироваться при 37 °C. Для того чтобы дифференцировать внешние и внутренние вирусные частицы, применяется этап блокирования: свободные пятна связывания на биотине прикрепленного вируса на поверхности клетки связываются с немеченым стрептавидином (STV). Последующая пермеабилизация клеток и окрашивание STV-Cy3 позволяет обнаруживать внутренние вирусные частицы. Мы представляем расчет для определения относительного количества интернализованного вируса. Этот анализ подходит для измерения влияния медикаментозного лечения или других манипуляций на прикрепление или усвоение IAV.

Мультфильм описания четырех различных экспериментальных условиях показано на рисунке 1 Результаты типичного эксперимента представлены на рисунках 2 -. 5. В &quot;0&quot; образец мин, биотинилированный вирус холодной связаны с клетками-мишенями, которые могут быть визуализированы с помощью окрашивания СТВ-Cy3 (фиг.1 и 2). Когда блокирующий шаг (в &quot;0 мин + STV&quot; образца) применяется, вирус на поверхности клеток б...

Мы представляем протокол, описывающий полуколичественный метод измерения как прикрепления вируса гриппа А к клеткам A549, так и интернализации вирусных частиц в клетки-мишени с помощью проточной цитометрии.

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Общая цель данной процедуры заключается в измерении прикрепления и интернализации вируса гриппа A в эпителиальных клетках легких A549. Это достигается путем предварительного связывания инактивированного вируса гриппа A с клетками A549 при низкой температуре, что обеспечивает прикрепление, но предотвращает поглощение вирусных частиц.Затем, путем повышения температуры до 37 °C, создаются условия для интернализации вируса. После этого проводится этап блокировки, при котором немеченый strp Aden связывается с поверхностью клеток. Данная процедура выполняется для того, чтобы отличить прикрепившиеся вирусные частицы от интернализованных.Наконец, вирус, биотинилированный и ассоциированный с клеткой, инкубируют со стрептавидином, меченным CY3, и с помощью проточной цитометрии регистрируют окрашенные вирусы. В конечном итоге рассчитывают относительное количество прикрепившихся и интернализованных вирусов. Данный метод позволяет получить представление об относительном количестве вируса гриппа, который прикрепляется к клеткам 5 0 9 и интернализуется в них.Этот метод также может быть применен к другим системам с использованием иных клеточных линий или других вирусов. После получения биотинилированного вируса и определения необходимого количества меченого вируса, стрептавиднона и SI3-меченого стрептавиднона согласно текстовому протоколу, подготовьте четыре глубокие лунки, в каждой из которых содержится 200 000 клеток A549. Маркируйте лунки следующим образом: 0 минут, 0 минут + STV, 30 минут и 30 минут + STV. Затем центрифугируйте пробирки.Удалите супернатант и используйте 200 µL PBS для ресуспендирования осадка. Затем после повторного центрифугирования пробирок используйте 200 µL стандартной ростовой среды 5 49 для ресуспендирования клеток и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. После инкубации центрифугируйте образцы и ресуспендируйте осадок в 200 µL PBS. Повторив промывку еще раз, охладите пробирки на льду в течение 10 минут. После охлаждения пробирок снова центрифугируйте их и используйте 100 µL биотинилированного вируса, разведенного в PBS для инфицирования, чтобы ресуспендировать осадок. После инкубации на льду в течение одного часа повторите центрифугирование и дважды промойте PBS, обрабатывая следующие образцы для нулевой минуты максимально параллельно.После центрифугирования используйте 100 µL 3,7% параформальдегида или PFA для ресуспендирования клеточного осадка. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут, затем центрифугируйте и дважды промойте клетки с помощью PBS после фиксации. Храните при температуре 4 °C до завершения обработки всех образцов.Для обработки образцов нулевой минуты с STV центрифугируйте пробирки, удалите супернадант и используйте 15 мкл STV в 2% BSA и 0,1% азида натрия в PBS для ресуспендирования осадка клеток, затем инкубируйте на льду в течение 30 минут. После этого центрифугируйте и дважды промойте клетки PBS после фиксации PFA, как было продемонстрировано ранее; для образцов 30 минут храните их при температуре 4 °C. После центрифугирования и удаления супернаданта используйте PBS с 2% BSA для растворения образцов.Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, после чего промойте образцы раствором PBS и зафиксируйте с помощью PFA. Затем храните образцы при 4 °C в течение 30 минут, включая образцы STV. После центрифугирования для получения осадка суспендируйте образцы в 200 µL PBS с 2% BSA с последующей инкубацией при 37 °C в течение 30 минут.Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в 50 µL STV 2%BSA 0.1%Sodium azi в PBS, инкубируйте на льду в течение 30 минут перед промывкой и фиксацией. Затем, после пермеабилизации и окрашивания всех образцов STV SI three согласно подробному текстовому протоколу, храните образцы при температуре 4 °C. В завершение проанализируйте образцы методом проточной цитометрии.Определите процент CY three-положительных клеток в каждом образце. Рассчитайте процент прикрепившегося вируса и относительное количество интернализованного вируса. Согласно текстовому протоколу, представленному здесь, в образце с нулевой временной меткой прикрепившийся вирус холодово связан с клетками-мишенями, что визуализируется при окрашивании St.V.SI three.При использовании STV в качестве блокирующего этапа вирус на поверхности клеток больше не обнаруживается с помощью S St.V.SI, что приводит к сильному снижению сигнала. При повышении температуры до 37 °C прикрепленный вирус поглощается клетками. Интернализованный вирус нечувствителен к блокировке немеченым STV, в результате чего в представленных образцах, выдержанных с STV в течение 30 минут и более, наблюдается менее резкое падение интенсивности сигнала.Ниже представлены процентные доли положительных по SI трех клеток для всех экспериментальных условий, описанных в данном видео. Ложноинфицированные клетки обеспечивают фоновую интенсивность сигнала для эксперимента и служат отрицательным контролем прикрепления вируса. Другой контроль, нейраминидаза, значительно подавляет прикрепление IAV на 90% по сравнению с необработанными клетками.Азид натрия, который истощает TP, тем самым подавляя эндоцитоз, препятствовал интернализации вирусных частиц как во время, так и после инфицирования; как показано здесь, в клетках, инкубированных в течение 30 минут при 37 °C после обработки азидом натрия, наблюдалось резкое снижение интернализации по сравнению с необработанными клетками, инкубированными в тех же условиях. После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как измерять адсорбцию и интернализацию вируса гриппа в клетках 5 0 9. Данный протокол обеспечивает удобный анализ с помощью проточной цитометрии и может быть легко адаптирован к другим экспериментальным условиям.

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

Метод измерения Вирусный Кинетика Fusion на одном уровне частиц

Этот метод описывает использование инфракрасного краситель на основе системы визуализации для выявления H1N1 в bronchioalveolar лаважа (БАЛ) зараженных мышей при высокой чувствительности. Эта методика может быть выполнена в 96 - или 384-луночного планшета, требуется &lt;10 мкл объема испытуемого материала и имеет потенциал для одновременного обследования нескольких возбудителей.

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Мы описываем быстрого выделения первичных мышиных тип II альвеолярных эпителиальных клеток (AECII) методом проточной цитометрии отрицательного отбора. Эти AECII показывают высокую жизнеспособность и чистоты и подходят для широкого спектра функциональных и молекулярных исследований в отношении их роли в респираторных заболеваний, таких как аутоиммунные и инфекционные заболевания.

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

В этом видео мы обсуждаем корреляцию между CIT50 и множественностью вирусных инфекций. Инфицированные вирусом клетки проявляют цитопатические эффекты, вызывая их гибель и отслоение от золотого микроэлектрода, что, в свою очередь, снижает импеданс.

Импедансный клеточный анализ для измерения множественности инфекции вируса гриппа

Это видео демонстрирует анализ приверженности бактерий к культуре эпителиальных клеток, помеченный GFP, для изучения динамики взаимодействий хозяина и патогена с помощью визуализации на основе флуоресцентной микроскопии.

Обнаружение прилипания бактерий к клеткам-хозяевам с помощью флуоресцентной визуализации

Это видео демонстрирует анализ, измеряющий антитело-опосредованную активацию эффекторных функций Т-клеток. Добавление моноклонального антитела, специфичного к вирусу гриппа гемагглютинина (ГА), к трансфицированным клеткам млекопитающих, экспрессирующим ГК, приводит к образованию иммунных комплексов с ГК. При введении сконструированных Т-клеток, экспрессирующих Fc-рецепторы и люциферазный репортер, Т-клетки активируются комплексами антитело-HA, и эта активация обнаруживается путем добавления...

Измерение активации fc-опосредованных эффекторных функций антителами к ГК

Первым шагом в жизненном цикле аренавируса является прикрепление вирусных частиц к клеткам-хозяевам. Мы сообщаем о количественном анализе на основе (q)RT-ПЦР для сверхчувствительного обнаружения и количественной оценки событий прикрепления аренавируса.

Высокочувствительного анализа для измерения ареновирус-клеток Вложение

Мы описываем фермент-связанный анализ лектина (ELLA) для измерения титров антител, ингибирующих нейраминидазу гриппа (NA) в сыворотке крови. В анализе используется агглютинин арахиса для количественного определения остатков галактозы, которые становятся доступными, когда NA удаляет сиаловую кислоту из покрытых фетуином 96-луночных планшетов.

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Мы описываем метод измерения активации Fc опосредованной эффекторных функций антителами, предназначенных гемагглютинина вируса гриппа. Этот assay также может быть адаптирована для оценки способности моноклональных антител или поликлональных сыворотки против других вирусных поверхностных гликопротеинов побудить Fc опосредованный иммунитет.

Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела

Здесь представлен протокол количественной оценки инфекционных вирусных частиц с использованием мониторинга электрического импеданса инфицированных клеток в режиме реального времени. Практическое применение данного метода представлено путем количественной оценки распада вируса гриппа А при различных физико-химических параметрах, имитирующих условия окружающей среды.

Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени

Изучите метод проточной цитометрии для измерения вложений и интернализации вируса гриппа А в клетках эпителия лёгких A549. Этот подход позволяет количественно оценить взаимодействие вируса с клетками-хозяевами.

Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

Больше видео