Name: Targeting biofilm Associated Staphylococcus aureus Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri come coltivare biofilm di Staphylococcus aureus in piastre 96-well per testare la sensibilità agli antibiotici con un saggio basato sulla resazurina. Questo metodo supporta la scoperta di nuovi agenti antimicrobici.

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Ringraziamo Saran Kupul per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione NIH R01-AI104952 a FW. Un ulteriore supporto è stato fornito dal Center for AIDS Research (CFAR) dell'Università dell'Alabama a Birmingham (UAB), un programma finanziato dal NIH (P30 AI027767) che è stato reso possibile dai seguenti istituti NIH: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. biofilm Initiation <ol><li> Crescere una cultura di biofilm producono organismo in un mezzo ricco di nutrienti. Seminare Staphylococcus aureus ceppo Newman in 10 ml di terreno Mueller-Hinton da uno stock di glicerolo. Eseguire tutti i lavori che coinvolgono la gestione di S. aureus con i guanti e all&#39;interno di un armadio biosicurezza. </li><li> Incubare per 16 ore a 37 ° C su shaker rotativo (100-200 rpm). </li><li> Determinare OD 600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro ed una cuvetta standard (lunghezza del percorso: 1cm). </li><li> Calcolare il volume (V) della cultura necessari per preparare 20 ml di inoculo con OD 600 (inoculo) di 0,1 in chelexed mezzi Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) 9 utilizzando la formula: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (cultura )] Nota: Riferimento 9 fornisce dettagli sulla preparazione CRPMI. <ol><li> Aggiungere il volume coltura calcolata (dall&#39;alto) in una provetta da centrifuga e cellule pellet mediante centrifugazione per 1 min a 10.000 x g. per prepare biofilm inoculo, aspirare il mezzo di crescita e risospendere pellet cellulare trascorso in 20 ml CRPMI. </li></ol></li><li> Versare inoculo in un serbatoio 25 ml. </li><li> Rimuovere con cautela il coperchio da una piastra sterile piolo 96 pozzetti tirandola verso l&#39;alto. Nota: Fare attenzione a non contaminare i pioli che pendono dal coperchio. Il coperchio può essere posizionato a testa in giù su una superficie pulita all&#39;interno di un armadio biosicurezza. </li><li> Usando una pipetta microlitri 200 multicanale, aggiungere 125 microlitri inoculo in ciascun pozzetto di righe da A a G della piastra inferiore. </li><li> Riempire media 125 ml sterile CRPMI in ciascun pozzetto di fila H come controllo di sterilità. </li><li> Prendere la peg-coperchio e tenerlo sopra il fondo piatto con i pioli rivolti verso il basso. Allineare con cura i singoli pioli con relativi pozzetti. Evitare il contatto fisico tra la piastra e le spine. Una volta allineati, abbassare il coperchio con cautela verso il basso. Evitare disallineamenti come aggiustamenti eseguiti dopo i picchetti hanno toccato la piastra inferiore può contcontrolli di sterilità aminate in fila H. </li><li> Sigillare il coperchio alla piastra con la pellicola di paraffina per evitare l&#39;evaporazione e mettere in un sacchetto di plastica richiudibile, tenuta saldamente. Mantenere il volume dell&#39;aria nel sacchetto più basso possibile per minimizzare l&#39;evaporazione. </li><li> Incubare senza agitazione a 37 ° C per 48 ore in un incubatore CO 2 5%. Nota: 48 ore di crescita è stato ottimale per S. aureus, ma varierà basato sul organismo utilizzato. Nota: Anche se l&#39;incubazione statico è un buon punto di partenza per ottimizzare il dosaggio, scuotendo leggermente a 150 giri al minuto, un vortex è una delle variazioni che possono migliorare la formazione di biofilm di alcuni S. aureus isolati. </li></ol> 2. Preparazione della piastra biofilm sfida <ol><li> Il giorno della sfida biofilm prendere una piastra a 96 pozzetti fresco e aggiungere 100 ml di CRPMI, equilibrati a RT, a ciascun pozzetto di righe B a H. Per evitare risultati inconsistenti, utilizzare una piastra a 96 pozzetti che può contenere 200 mldei media quando i pioli sono all&#39;interno, e dispone pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra biofilm iniziazione. </li><li> Diluire fino a 4 composti di prova separatamente in 1,0 ml di CRPMI a 2x la concentrazione finale desiderata, al fine di spiegare una diluizione finale nel passo 2.7. Nota: un buon punto di partenza è di 8 volte superiori alla concentrazione inibitoria delle cellule planctoniche. </li><li> Aggiungere 200 ml di composto 1 a Wells A1 a A3, composto di 2 pozzi in A4 A6, composto di 3 pozzi in A7 a A9 e composto 4 in pozzi A10 a A12. </li><li> In serie diluire i composti di prova utilizzando una pipetta multicanale e trasferire 100 ul dalla fila A alla fila B e mescolare. </li><li> In questo modo, continuare a trasferire 100 ul pozzetto a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e sosta in fila F. </li><li> Dopo la miscelazione, espellere i 100 ml di fila F in un contenitore per rifiuti. Non trasferire alcun liquido alle righe G e H. </li><li> Aggiungere 100 ml di CRPMI a ciascun pozzetto della piastra con una pipetta multicanale perportare il volume a 200 ml. Vedere la Figura 1 per il layout piatto finale. </li></ol> 3. biofilm Sfida <ol><li> Aggiungere 200 ml di tampone fosfato salino (PBS) ad un nuovo sterile 96 pozzetti che dispone pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra biofilm iniziazione. </li><li> Rimuovere il sacchetto di plastica e pellicole di paraffina dalla piastra biofilm iniziazione incubate. </li><li> Sollevare il coperchio verso l&#39;alto. Evitare il contatto tra i picchetti e il fondo piatto come questo può danneggiare il biofilm. Tenere la parte inferiore per la successiva analisi OD 600 (vedi 3.8). </li><li> Risciacquare cellule planctoniche posizionando il peg-coperchio sulla piastra contenente PBS (dal punto 3.1). Immergere pioli per 5 secondi, sollevare dalla PBS, e immergere ancora una volta, facendo attenzione a non colpire i picchetti contro i lati pure. </li><li> Mettere il coperchio peg-risciacquato nella piastra sfida. Evitare il contatto inutili tra i picchetti e piastra di fondo per non danneggiare il biofilm che porta arisultati inconsistenti. </li><li> piastra di tenuta con la pellicola di paraffina e riporre in un sacchetto di plastica richiudibile come descritto al punto 1.10. </li><li> Incubare la piastra senza agitazione per 24 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Prendere parte inferiore della piastra di biofilm iniziazione da 3.3. Risospendere i batteri in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e misurare il diametro esterno 600 con un lettore di micropiastre adatto per confermare la crescita che si verificano in tutti i pozzetti, ma i controlli di sterilità in fila H. </li></ol> 4. Determinazione biofilm <ol><li> Utilizzare un lettore di piastre dotato di una camera di incubazione e in grado di prendere letture di fluorescenza cinetici per la rilevazione resazurina conversione. Impostare una misurazione della fluorescenza cinetica 24 ore utilizzando una eccitazione 530 nm e 590 nm di emissione. </li><li> Impostare la temperatura della camera a 37 ° C e ha la piastra letto ogni 20 min. Impostare il lettore di piastre per misurare dal fondo della piastra base alle istruzioni del produttorezioni. </li><li> Preparare Lavare la piastra con l&#39;aggiunta di 200 ml di PBS con una pipetta multicanale ad una sterile 96 pozzetti. </li><li> Preparare mezzo di recupero biofilm con l&#39;aggiunta di 400 ml di 0,8 mg / ml resazurina soluzione madre a 20 ml di terreno CRPMI ad una concentrazione finale di 16 mg / ml resazurina. Nota: resazurina è irritante per la pelle conosciuta. Uso di un camice, occhiali anti-schizzo, e guanti durante la manipolazione. CRPMI come supporti di ripristino biofilm è stato usato perché fornisce il segnale di fondo più basso, ma può essere sostituito da mezzi di Mueller Hinton, se del caso. </li><li> Aggiungere 150 pl di mezzo di recupero biofilm con una pipetta multicanale a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fresco. </li><li> Trasferimento piatto sfida da incubatrice in un armadio biosicurezza e con attenzione rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola sigillante. </li><li> Togliere il peg-coperchio dalla piastra sfida e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come descritto in 3.4. Mantenere il fondo della piastra sfida per successiva OD 600 analisi (vedi 4.10). </li><li> Dopo il risciacquo, inserire il piolo-coperchio nella piastra inferiore contenente il mezzo di recupero biofilm. </li><li> Avvolgere il lato della piastra con la pellicola di paraffina, facendo attenzione a non ostacolare il fondo dei pozzetti perimetrali. Subito dopo aver terminato la piastra, collocarlo sul lettore di piastre e iniziare una lettura cinetica in un periodo di 24 ore, avviando il già fatto resazurina protocollo cinetica dal punto 4.1. </li><li> Per quantificare la crescita di cellule planctoniche che possono o non possono verificarsi durante sfida, leggere la OD 600 dell&#39;intera piastra inferiore sfida utilizzando un lettore di micropiastre. Seguire le istruzioni riportate al punto 3.8. Nota: risospendere accuratamente il contenuto di ogni pozzetto come cellule spargimento fuori dal biofilm tendono a crescere in ciuffi sul fondo del pozzo. Eventuali bolle all&#39;interno del pozzo saranno fortemente interferire con OD 600 letture e devono essere evitati o rimossi prima della lettura. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto un saggio biofilm modificato per determinare l&#39;attività di inibitori testati su S. biofilm aureus concentrandosi sullo stato metabolico delle cellule biofilm associato. Mentre il biofilm iniziazione descritto e procedure di contestazione per lo più imitate raccomandazioni del produttore, l&#39;uso di resazurina colorante per rilevare e quantificare le cellule biofilm associato che sopravvivono una sfida inibitore 24 ore semplifica notevolmente la procedura raccomandata di rec...

Microbi patogeni possono formare biofilm in vivo che portano a infezioni croniche non acute 1. Infezione biofilm-associata è un grave fattore di rischio di procedure mediche che coinvolgono l&#39;impianto di corpi estranei (ad esempio, la sostituzione di ossa artificiali, le protesi mammarie) o l&#39;installazione di tubi tracheali o cateteri urinari 2. In questi contesti, terapia anti-infettiva è quasi sempre necessario come infezioni biofilm-based sono raramente cancellati da soli, anche in individui immunocompetenti. Staphylococcus aureus è uno dei patogeni più frequentemente osservati implicati nella complicazioni biofilm correlati che si verificano durante l&#39;uso di dispositivi medici invasivi 3. Purtroppo, la natura stessa del biofilm da barriera protettiva rende più resistenti al trattamento delle cellule planctoniche 1,4, e la valutazione della efficacia clinica predetto è una parte critica sia inizialelo sviluppo di farmaci così come la sorveglianza della resistenza ai farmaci. Vi è un crescente riconoscimento che condizioni di laboratorio, si è concentrata sulle culture planctonici, potrebbero non rappresentare fedelmente la malattia del mondo reale 5. Ulteriori aggravando il problema, la replica di fenotipi biofilm è difficile, e modelli biofilm esistenti sono noioso e soffrono di alta inter- e intra-assay variabilità 6. Così, molti ricercatori, per necessità, di default per saggi cellulari planctonici di sensibilità ai farmaci, quindi potenzialmente trascurare un aspetto importante della virulenza batterica e la malattia. Qui si descrive il protocollo per il saggio di batteri, in particolare S. aureus, in biofilm pre-grown utilizzando una base di 7,8 sistema di biofilm ben 96. Mentre il protocollo per la formazione di biofilm e la sfida segue essenzialmente la raccomandazione del costruttore, presentiamo una metodologia ricca di informazioni alternative per quantificare la fattibilità del BIOFilm dopo sfida. Brevemente, i batteri sono coltivate in piastra piolo, dove biofilm formano sui pioli sporgenti collegati al coperchio della piastra. Dopo la formazione di biofilm, i pioli sono delicatamente immersi in pozzetti di una piastra fresca ripiena con PBS per rimuovere le cellule planctoniche. Il peg-coperchio, con biofilm allegate, viene trasferito in una nuova piastra sfida, contenente varie concentrazioni di antibiotici da dosare. Dopo una seconda incubazione, coperchi sono nuovamente rimosso, lavato, e trasferiti ad una piastra di recupero contenente resazurina tintura, dove subiscono una incubazione finale. conversione resazurina può essere registrata cineticamente o preso come una lettura finale dopo un periodo di recupero definito. Questo metodo di tintura a base di quantificare la vitalità del biofilm si differenzia notevolmente dalle noiose CFU (unità formanti colonie) metodologia basata su conteggio descritto nel protocollo originale 7. OD 600 misurazioni della piastra sfida droga e resazurina cinetiche di conversione fungono redditività letturaout di cellule planctonici e biofilm, rispettivamente, offrendo un test veloce, affidabile e tecnicamente semplice ricco di informazioni per la sopravvivenza biofilm.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>Segui le raccomandazioni del produttore</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 medio chelexato per 1 ora con resina Chelex 100 e poi integrato con 10% non chelexed RPMI-1640</td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>Piastre MBEC</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Sale di sodio</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &; g/ml in acqua deionizzata &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>Piattaforma di agitazione per micropiastre sterile con filtro&nbsp;</td><td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Registrazione e analisi della conversione della resazurina</td></tr><tr><td>Neocuproine</td><td>Sigma</td><td>N1501&nbsp;</td><td>preparare 10 mM di stock in etanolo al 100%, conservare a -80 &ordm; C</td></tr><tr><td>Solfato di rame</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>preparare una soluzione madre da 100 mM in acqua, conservare a 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Cu-Neocuproina</td><td>Autoprodotto</td><td></td><td>Generato mescolando molarità uguali di neocuproina e solfato di rame. La miscela è stata diluita in mezzo CRPMI alla concentrazione desiderata.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

targeting biofilm associated<em&gt; staphylococcus aureus</em&gt; uso resazurina base assay farmaco-sensibilità

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

La maggior parte dei batteri patogeni è in grado di formare biofilm durante l'infezione, ma a causa della difficoltà di manipolare e valutare i biofilm, la stragrande maggioranza del lavoro di laboratorio viene condotto con cellule planctoniche. Qui, descriviamo un saggio di biofilm su piastra a pioli eseguito con Staphylococcus aureus. I biofilm batterici vengono coltivati su pioli attaccati a un coperchio per piastra per microtitolazione a 96 pozzetti, lavati attraverso una delicata immersione in tampone e posti in una piastra di provocazione farmacologica. Dopo la successiva incubazione, vengono nuovamente lavati e spostati in una piastra di recupero finale, in cui il colorante fluorescente resazurina funge da indicatore di vitalità. Questo test offre una maggiore facilità d'uso, affidabilità e riproducibilità, nonché una grande quantità di dati se condotto come lettura cinetica. Inoltre, questo test può essere adattato a un approccio di screening farmacologico a medio rendimento mediante il quale viene invece eseguita una lettura fluorescente dell'endpoint, offrendo un percorso per gli sforzi di scoperta farmacologica.

Il saggio resazurina è abbastanza sensibile per rilevare in modo affidabile pochissime cellule vitali in grado di replicare in terreno privo di droga dopo la sfida. In questa metodologia, definiamo la concentrazione di biofilm sradicare minima come la concentrazione più bassa alla quale nessuna conversione resazurina è visto entro 24 ore. Il test si basa su resazurina molecole ossidanti presenti nelle cellule metabolicamente attivi che convertono il colore della tintura dal blu al rosa. ...

La maggior parte delle infezioni batteriche produce un biofilm. In virtù del loro ambiente, i batteri associati al biofilm sono spesso fenotipicamente resistenti ai farmaci. Le nuove molecole antibatteriche che uccidono i batteri nei biofilm sono quindi una priorità assoluta. Stabiliamo un test per lo screening rapido di composti antimicrobici efficaci nell'eradicazione dei biofilm.

Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare in modo semplice e riproducibile biofilm batterici in una piastra a 96 pozzetti su perni fissati al coperchio, per test di suscettibilità agli antibiotici mediante un colorante di vitalità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta e dello sviluppo di antibiotici, esplorando l'attività su cellule associate ai biofilm, che spesso rappresentano in modo più accurato gli stati di infezione in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di sottoporre facilmente a sfida biofilm preformati in un saggio trifasico e determinare l'inibizione utilizzando un comune colorante di vitalità.Per iniziare, coltivare una cultura di organismo produttore di biofilm in un mezzo ricco di nutrienti. Inoculare il ceppo di Staphylococcus aureus Newman da un'ampolla di glicerolo in 10 millilitri di mezzo Muller-Hinton. Eseguire tutti i passaggi che prevedono la manipolazione di S.aureus indossando guanti e all'interno di una cappa a sicurezza biologica.Incubare per 16 ore a 37 gradi Celsius su un agitatore rotatorio. Aggiungere il volume di coltura calcolato in un tubo da centrifuga e pellettizzare le cellule centrifugando per un minuto a 10.000 G. Per preparare l'inoculo del biofilm, aspirare il mezzo di crescita esausto e risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di CRPMI. Utilizzando una pipetta multicanale da 200 microlitri, aggiungere 125 microlitri di inoculo da un serbatoio di 25 millilitri in ciascuna pozzetta delle righe da A a G della piastra inferiore.Aggiungere 125 microlitri di mezzo CRPMI sterile in ciascun pozzetto della riga H come controllo di sterilità. Prendere il coperchio con i perni e tenerlo sopra il fondo della piastra con i perni rivolti verso il basso. Allineare con attenzione ciascun perno con il rispettivo pozzetto.Evitare il contatto fisico tra la piastra e i perni. Una volta allineato, abbassare con cura il coperchio. Sigillare il coperchio alla piastra con pellicola di paraffina per prevenire l'evaporazione e collocare il tutto in un sacchetto di plastica richiudibile, sigillandolo accuratamente.Mantenere il volume d'aria nel sacchetto il più basso possibile per minimizzare l'evaporazione. Incubare la piastra senza agitazione a 37 gradi Celsius per 48 ore, in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Nel giorno della sfida con il biofilm, prelevare una nuova piastra a 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di CRPMI, equilibrato a temperatura ambiente, in ciascun pozzetto delle righe da B a H. Diluire separatamente fino a quattro composti in esame, in 1,0 millilitro di CRPMI, fino a una concentrazione finale 2x rispetto a quella desiderata.Aggiungere 200 microlitri del composto 1 nei pozzetti A1-A3. 200 microlitri del composto 2 nei pozzetti A4-A6. 200 microlitri del composto 3 nei pozzetti A7-A9. E 200 microlitri del composto 4 nei pozzetti A10-A12. Diluire in serie i composti in prova utilizzando una pipetta multicanale.Trasferire inizialmente 100 microlitri dalla riga A alla riga B e mescolare. Procedere in questo modo trasferendo 100 microlitri da pozzetto a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e fermarsi alla riga F. Dopo il mescolamento, espellere 100 microlitri dalla riga F in un contenitore per rifiuti.Non trasferire alcun liquido nelle righe G e H. Infine, aggiungere 100 microlitri di CRPMI in ogni pozzetto della piastra utilizzando una pipetta multicanale, portando il volume finale a 200 microlitri. Aggiungere 200 microlitri di soluzione salina fosfato tamponata in una piastra sterile da 96 pozzetti, fresca, che presenti pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra per l'iniziazione del biofilm. Successivamente, rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola di paraffina dalla piastra per l'iniziazione del biofilm incubata.Sollevare il coperchio verticalmente, evitando il contatto tra i perni e il fondo della piastra, poiché ciò potrebbe danneggiare il biofilm. Conservare la parte inferiore per l'analisi successiva dell'OD600. Rimuovere le cellule planctoniche lavando il coperchio con i perni posizionandolo sulla piastra contenente PBS.Immergere i perni per cinque secondi. Estrarli dal PBS e immergerli nuovamente, avendo cura di non farli urtare contro i lati delle pozzette. Posizionare il coperchio con i perni risciacquati nella piastra di prova.Evitare un contatto eccessivo tra i perni e la piastra inferiore, poiché ciò danneggerebbe il biofilm, portando a risultati non riproducibili. Sigillare la piastra con pellicola di paraffina e inserirla in un sacchetto di plastica richiudibile, come in precedenza. Incubare la piastra, senza agitazione, per 24 ore a 37 gradi Celsius, in un incubatore con 5% di anidride carbonica.Prendere il fondo della piastra per l'inizio della formazione del biofilm e risospendere i batteri in ogni pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Misurare l'OD600 con un lettore di micropiastre adeguato, per confermare la crescita avvenuta in tutti i pozzetti tranne nei controlli di sterilità della riga H. Utilizzare un lettore di piastre dotato di camera di incubazione e in grado di effettuare letture cinetiche di fluorescenza per rilevare la conversione del resazurin. Impostare una misurazione cinetica di fluorescenza di 24 ore con un'eccitazione a 530 nanometri e un'emissione a 590 nanometri.Impostare la temperatura della camera a 37 gradi Celsius e programmare la lettura della piastra ogni 20 minuti. Impostare il lettore di piastre per effettuare la misurazione dal fondo della piastra seguendo le istruzioni del produttore. Prepararsi a lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di PBS in ogni pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti mediante una pipetta multicanale.Quindi, preparare il mezzo di recupero del biofilm aggiungendo 400 microlitri di soluzione madre di resazurina 0,8 milligrammi per millilitro a 20 millilitri di mezzo CRPMI, ottenendo una concentrazione finale di 16 microgrammi per millilitro di resazurina. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di mezzo di recupero del biofilm, utilizzando una pipetta multicanale, in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti. Trasferire la piastra di prova dall'incubatrice in una cappa a sicurezza biologica e rimuovere con attenzione il sacchetto di plastica e il film sigillante.Rimuovere il coperchio con perni dalla piastra di sfida e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come in precedenza, mantenendo il fondo della piastra di sfida per l'analisi successiva dell'OD600. Dopo il risciacquo, posizionare il coperchio con perni nel fondo della piastra contenente il mezzo di recupero del biofilm. Avvolgere i lati della piastra con pellicola paraffinata, avendo cura di non ostruire il fondo delle pozzette perimetrali.Immediatamente dopo aver sigillato la piastra, posizionarla sul lettore di piastre e avviare una lettura cinetica per un periodo di 24 ore, attivando il protocollo cinetico per la resazurina precedentemente impostato. Per quantificare la crescita di cellule planctoniche, che potrebbe verificarsi o meno durante la prova, leggere l'OD600 dell'intera superficie inferiore della piastra mediante un lettore per micropiastre. Qui viene mostrato un esempio di disposizione di una piastra di prova, che utilizza due diluizioni complete per titolare le concentrazioni del composto.I biofilm coltivati sono stati trattati con neocuproina o con il suo complesso rameico. Letture dell'OD600 del fondo della piastra di sfida dopo 24 ore hanno rivelato che il complesso rameico della neocuproina, ma non la neocuproina da sola, ha impedito il distacco e la successiva crescita di cellule vitali dai biofilm trattati a concentrazioni di 1,25 micromolare o superiori. I corrispondenti biofilm sono stati quindi testati mediante saggio con resazurina.L'ispezione visiva dopo 24 ore consente una risposta rapida di tipo sì-no qualora si eseguano in parallelo più piastre. La resazurina diventa rosa nelle pozzette con biofilm vitali, ma rimane blu quando il biofilm è stato eradicato. Una lettura cinetica della conversione della resazurina può rivelare effetti dipendenti dalla concentrazione sulla vitalità del biofilm, come mostrato qui con la gentamicina.Il ritardo dipendente dalla concentrazione nell'inizio della conversione del colorante indica una riduzione della vitalità del biofilm. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di non urtare i perni contro i lati delle pozzette.

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