Оценка первичного нейрогенеза в
12 апреля 2016 г.
Данная статья представляет собой удобный и быстрый способ для визуализации различных популяций клеток нейронов в центральной нервной системе Xenopus эмбрионов с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания на участках.
Общая цель данного эксперимента заключается в обеспечении возможности быстрой и удобной визуализации различных популяций нейронных клеток в развивающемся эмбриональном мозге xenopus. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области первичного нейрогенеза, например, при изучении процесса регуляции дифференцировки нейронов в центральной нервной системе xenopus. Основным преимуществом данной методики является возможность одновременного наблюдения за пулом нейральных стволовых клеток-предшественников, а также за пулом дифференцированных первичных нейронов в рамках одного эксперимента.
Для начала данной процедуры осторожно аспирируйте от пяти до десяти эмбрионов из стеклянного флакона с помощью пластиковой или стеклянной пипетки, избегая образования пузырьков воздуха. Перенесите эмбрионы в монтажную камеру и осмотрите их под стереомикроскопом. Заполните монтажную камеру раствором желатина для обеспечения жесткости блока сечений.
Затем с помощью тонких пинцетов расположите эмбрионы рядом друг с другом. Отметьте направление головы, нарисовав стрелку на ободке камеры криостойким маркером. При наличии нескольких групп эмбрионов запишите описание каждой группы на ободке соответствующей камеры.
Затем осторожно поместите камеру горизонтально в пенопластовый бокс, наполовину заполненный сухим льдом. Закройте крышку и дайте камерам для крепления заморозиться по одной в течение пяти-десяти минут. После этого приступайте к криосекционированию или храните замороженные образцы при температуре -80 °C в течение как минимум одной-двух недель без потери иммуногенности.
В данной процедуре извлеките замороженный блок образца из камеры, нажав на дно камеры тупым стержнем или пальцем. Затем нанесите несколько капель среды для заморозки тканей на диск для удержания образца. Установите блок образца так, чтобы передний конец эмбрионов был направлен вверх, и оставьте установленный блок в камере криостата примерно на одну минуту или до тех пор, пока среда для заморозки тканей не станет матовой.
Сразу после этого установите диск для образцов в микротом так, чтобы нижняя сторона блока с образцом была обращена вверх. Срежьте часть блока с помощью лезвия, пока блок еще относительно мягкий. Затем оставьте диск для образцов в микротоме минимум на пять минут, чтобы его температура стабилизировалась.
После этого постепенно подрезайте блок образца, пока головки головастиков не станут видны сквозь полупрозрачный желатин. Для ускорения обрезки увеличьте толщину среза. Контролируйте работу криостата, в частности остроту и угол наклона ножа, чтобы последующие срезы формировались в виде длинной ленты.
Как только головы головастиков станут видны, верните настройки криостата в обычный режим, чтобы готовые срезы могли формировать ленты и не накладывались друг на друга и не прилипали к ножу. Затем продолжайте подрезать ткань до тех пор, пока головы головастиков не будут почти полностью открыты. Перед началом сбора срезов образцов смахните щеткой все остатки тканей со столика.
Сделайте примерно от 10 до 15 срезов, чтобы они образовали длинную ленту. Откиньте толстую покровную пластинку в сторону и осторожно снимите ленту с лезвия с помощью кисти с тонким ворсом. Затем поместите ее на предметный столик так, чтобы ее длинная ось была параллельна лезвию.
Сформируйте от 10 до 15 срезов, чтобы они образовали длинную непрерывную ленту. Это может быть непросто и потребует определенной сноровки. Один из приемов заключается в том, чтобы не вращать маховик слишком быстро.
Вместо этого осторожно и медленно вращайте маховик. После этого возьмите один положительно заряженный предметный стеклом при комнатной температуре и подпишите его карандашом. Затем быстро и плотно прижмите его к полоске подпиशानной стороной вниз.
Затем извлеките предметное стекло из камеры криостата. Повторяйте этот шаг, пока на каждом стекле не будет расположено от 20 до 30 срезов параллельно друг другу. Высушите срезы на воздухе в течение 10 минут, после чего немедленно переходите к процедуре иммуноокрашивания или поместите стекла в контейнер для хранения при температуре -80 °C на срок до трех-шести месяцев до начала процедуры иммуноокрашивания.
Здесь представлены соответствующие плоскости сечения переднего, среднего, заднего мозга и спинного мозга головастика Xenopus, которые будут использоваться для определения пространственной привязки на последующих изображениях. Соответствующие поперечные срезы, окрашенные Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin и DAPI, демонстрируют относительное расположение пулов нейральных стволовых клеток, а также нейрофиламентов внутри нейральной трубки. А здесь приведены соответствующие поперечные срезы, окрашенные Anti-MyT1 и DAPI, которые показывают относительное расположение дифференцированных первичных нейронов внутри нейральной трубки.
После освоения эта методика может быть выполнена за два часа при соблюдении всех правил. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости обеспечения достаточного времени охлаждения блока образца в сухом льду. В противном случае блок образца может оказаться недостаточно твердым, что затруднит его резку.
После разработки эта методика позволила исследователям в области нейробиологии развития изучать нейрональную дифференцировку в центральной нервной системе Xenopus. После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как делать срезы и наблюдать за определенными группами нейрональных клеток в центральной нервной системе Xenopus.
Обзор
В данной статье представлен экспресс-метод визуализации различных популяций нейронов в центральной нервной системе эмбрионов Xenopus с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Эта методика позволяет наблюдать процессы нейральной дифференцировки в рамках одного эксперимента.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Методы иммунофлуоресценции
Теоретические сведения
- Понимание нейрональной дифференцировки имеет решающее значение в нейробиологии развития.
- Эмбрионы Xenopus служат моделью для изучения нейрогенеза.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание позволяет визуализировать специфические популяции нейронов.
- Данный метод может дать представление о регуляции нейральных стволовых клеток.
Цель исследования
- Разработать методику одновременного наблюдения за предшественниками нейральных стволовых клеток и дифференцированными нейронами.
- Облегчить изучение первичного нейрогенеза в эмбрионах Xenopus.
- Предложить надежный метод визуализации популяций нейронов в центральной нервной системе.
Используемые методы
- Аспирация эмбрионов и их подготовка к криосекционированию.
- Использование криостата для получения тонких срезов эмбрионов.
- Окрашивание срезов специфическими антителами для визуализации популяций нейронов.
- Изучение окрашенных срезов под микроскопом для анализа результатов.
Основные результаты
- Успешная визуализация пулов нейральных стволовых клеток и дифференцированных нейронов.
- Идентификация специфических популяций нейронов в переднем, среднем и заднем мозге, а также в спинном мозге.
- Демонстрация эффективности метода, позволяющего выполнить процедуру примерно за два часа.
- Валидация метода для последующих исследований в области нейробиологии развития.
Выводы
- Данный метод расширяет возможности изучения дифференцировки нейронов у Xenopus.
- Он представляет собой ценный инструмент для исследователей в области нейробиологии развития.
- Будущее применение этого метода может способствовать более глубокому пониманию нейрогенеза и сопутствующих процессов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет одновременно визуализировать предшественники нейральных стволовых клеток и дифференцированные первичные нейроны в эмбрионах Xenopus, что способствует снижению рисков при механистическом обосновании на ранних этапах валидации мишеней. Обеспечивая количественные пространственные данные о дифференцировке нейронов, этот подход повышает прогностическую достоверность при изучении сигнальных путей и функциональной оценке мишеней. Данный метод представляет собой релевантную для изучения заболеваний систему оценки нейрогенных механизмов с трансляционной преемственностью в отношении доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации пулов нейральных стволовых клеток и дифференцированных нейронов в рамках одного эксперимента.
- Практическая ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет прямого наблюдения за динамикой нейрональной дифференцировки.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, связывая молекулярные пертурбации с наблюдаемыми изменениями в нейрогенных популяциях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых срезов, подходящих для высококонтентного имиджинга и количественного анализа.
- Масштабируемость: позволяет подготавливать от 20 до 30 параллельных срезов на одном предметном стекле для мультиплексного скрининга антител.
- Повторное использование платформы: обеспечивает возможность длительного хранения стекол при -80°C до шести месяцев, что позволяет проводить серийную обработку и сравнивать результаты разных экспериментов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: предоставляет модельную систему позвоночных для изучения консервативных механизмов первичного нейрогенеза, применимых к нейроонтогенетическим расстройствам человека.
- Трансляционная преемственность: связывает результаты фундаментальных исследований с доклинической валидацией, обеспечивая стабильную считываемость фенотипических признаков на разных стадиях развития.
- Принятие решений с учетом рисков: облегчает проведение оценки «продолжать/прекратить» (go/no-go) путем количественного анализа изменений в популяциях клеток-предшественников и дифференцированных нейронов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска препаратов, предоставляя пространственно-разрешенные количественные данные о дифференцировке нейронов, которые используются на стадиях валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей развития за счет прямой визуализации нейрогенных ниш и результатов дифференцировки.
- Скрининг: Позволяет получать готовые к анализу срезы стандартизированной толщины и ориентации для надежного иммуноокрашивания и визуализации.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели на основе интенсивности флуоресценции и метрик колокализации (например, популяций Sox3+/AcTub+ по сравнению с MyT1+) для сопоставления экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает с доклинической работой через консервативные нейрогенные механизмы у моделей позвоночных, способствуя согласованию биомаркеров.
- Корпоративное использование: Создает многократно используемую платформу гистологического анализа для итеративного изучения мишеней в рамках нескольких проектов и временных точек.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем прямой связи генетических или фармакологических воздействий с изменениями в популяциях стволовых клеток и дифференцированных нейронов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию за счет протоколов криосекционирования и условий хранения предметных стекол, сохраняющих антигенность в течение нескольких месяцев.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования ресурсов, позволяя проводить мультиплексный анализ мишеней в рамках одного гистологического рабочего процесса.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков, предоставляя объективные визуальные критерии нейрогенной активности на этапе перехода от поиска хитов к оптимизации соединений-лидеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с эмбрионами, навыками криосекционирования и методами иммунофлуоресценции.
- Необходима инфраструктура, включающая криостат, микротом и флуоресцентный микроскоп.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется межкомандная стандартизация ориентации срезов и протоколов окрашивания.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации параметров заливки и секционирования.
- Практические ограничения включают хрупкость тканей при изготовлении срезов и необходимость точного контроля температуры для сохранения целостности образцов.
