Name: Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a gerar um fígado humanizado em camundongos usando células-tronco hepáticas humanas imaturas. Este método permite estudar metabolismo de fármacos e função hepática humana em modelo quimérico.

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Gostaríamos de agradecer ao Projeto de Genética de Mamíferos, Instituto Metropolitano de Ciências Médicas de Tóquio, por fornecer os camundongos. Também agradecemos a S. Aoyama e Y. Adachi do ADME (Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção) e Instituto de Pesquisa em Toxicologia, Sekisui Medical Company Ltd., Japão, e K. Kozakai e Y. Yamada pela assistência com a análise de LC-MS/MS. Este trabalho foi apoiado em parte por Grants-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão para YWZ (18591421, 20591531 e 23591872); pelo projeto inovador e empreendedor de Jiangsu para a introdução de talentos de alto nível e pelo projeto de planejamento científico e tecnológico de Jiangsu (BE2015669); e por doações à H.T. para Promoção Estratégica de Pesquisa e Desenvolvimento Inovadores (S-innovation, 62890004) da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão.

Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção aos Animais de Yokohama City University. 1. geração do modelo Hepática Aguda Lesão Rato <ol><li> Adicionar 1 ml de solução de NaCl a 0,85% de fenol (0,6 g de fenol em 100 ml de solução de NaCl a 0,85%) para 1 mg de toxina da difteria (DT) para fazer um / ml de solução stock de 1 mg DT. Nota: DT a uma concentração de 1 mg / ml pode ser armazenado por cerca de 2 anos a 3 ° C e 8 ° C. </li><li> Serialmente diluir a solução de 1 mg / ml da DT para 0,3 ug / mL em solução de DT fenol a 0,85% de NaCl e preparar-se uma alíquota da solução de DT / ml 0,3 ug como uma solução de trabalho. Nota: Esta solução de trabalho deve ser preparada. </li><li> Para realizar experiências utilizando uma dose subletal (~ 50% de letalidade), administrar ratinhos de 8 semanas de idade, um / kg de dose de 1,5 ug de DT. <ol><li> Realizar uma injeção intraperitoneal de DT, mantendo o rato em decúbito dorsal e inserir o needle abaixo da curva dos joelhos, para a esquerda ou direita da linha média. Evitar a linha média para evitar a penetração da bexiga. Ângulo a agulha em aproximadamente 45 ° em relação ao corpo. </li><li> Usando uma seringa de insulina, administrada a ratos com 100 uL de recém-preparados 0,3 ug / ml de DT por 20 g de peso do rato. Por exemplo, um 18-g rato deve recebem 90 ul da solução de DT / ml 0,3 ug. </li></ol></li><li> A 48 h após a injecção DT, recolha de sangue a partir da veia da cauda, ​​colocando o rato num limitador e o aquecimento da cauda do rato num banho de água a 37 ° C durante aproximadamente 10 min para dilatar os vasos sanguíneos. Em seguida, fazer uma de 1 mm do entalhe em cauda de 2 cm da ponta com um bisturi afiado da lâmina e recolher o sangue com um tubo microcapilar. <ol><li> Centrifuga-se o tubo microcapilar contendo o sangue a 1500 xg durante 5 minutos e recolher o soro, separando o sobrenadante e pelete de células. </li></ol></li><li> Pipeta 50 ul de 01:20 soro de ratinho diluído Onto GOT / AST-PIII desliza. Medir a absorvância do produto de reacção (corante azul) a 650 nm, utilizando um multi-usos analisador automático de química seca de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: A leitura de aspartato aminotransferase (AST) / atividade glutâmico transaminase oxalacética (GOT) é exibido automaticamente. 2 dias após a injecção de DT, cerca de 60% dos ratinhos exibiram valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L e foram consideradas como sofrendo de lesão hepática aguda. Estes ratos foram transferidos para uma gaiola nova e utilizada como receptores de transplante de células. </li></ol> 2. Preparação de células-tronco hepáticas humanas <ol><li> Isolar células estaminais hepáticas humanas a partir de células fetais humanas primárias do fígado, com um classificador de células utilizando os antigénios de células CDCP1, CD90, e CD66 para obter uma subpopulação CDCP1 + CD90 + CD66-, em seguida, propagar a população de células isoladas em placas de cultura de colagénio IV-revestidas, como relatado anteriormente 15. Use células fetais humanas primárias do fígado de um embriãoidade entre as semanas 14 e 18. </li><li> Recolher as células estaminais hepáticas humanas cultivadas para 80% - 90% de confluência em placas de cultura de 100 mm, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 10 ml de PBS, e em seguida remover o PBS. Tripsinizar as células com solução de tripsina / EDTA a 2 ml de 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: As células em mais do que 90% de confluência não são adequados para o transplante de células uma vez que a diferenciação das células pode influenciar a sua capacidade proliferativa em murganhos. </li><li> Monitorizar o estado de dispersão de células sob um microscópio. Quando as células parecem ser flutuante ou fluindo livremente, parar a digestão enzimática por adição de 8 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS. </li><li> Suspender as células lentamente com uma pipeta serológica de 10 ml e transferência das células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células durante 5 min a 100 xg e 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS e determinar o número de células utilizando um microscópio de câmara de contagem. </li><li>Dividir as células em 1,0 x 10 6 culas por 50 ul de PBS alíquotas para cada ratinho individual e armazenar em gelo até à transplantação. </li></ol> 3. interna do baço transplante de células-tronco hepáticas humanas <ol><li> Coloque uma gaiola limpa em uma temperatura de 37 ° C almofada de aquecimento elétrico. </li><li> Anestesiar o rato usando isoflurano inalação (1 - 1,5% (vol / vol) em 2 L de oxigénio por minuto), colocando-o por debaixo do bocal. Como alternativa, use tubos contendo gaze embebida com isoflurano. <ol><li> Certifique-se de que o rato é anestesiado por beliscar levemente na pata traseira. Se um empurrão de joelho é provocada, coloque o mouse de volta na câmara. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li></ol></li><li> Raspar o local da cirurgia usando cortadores elétricos e aplicar 70% (/ vol vol) de etanol e iodopovidona para esterilizar. Em seguida, fazer uma incisão na pele de 1 cm no flanco esquerdo, logo abaixo da borda costal das costelas, seguido por uma incisão naa parede abdominal, bem como o peritoneu. </li><li> Cuidadosamente expor o baço. Utilize uma seringa microinjecção de 100 ul, com uma agulha de 32 G 1/2-inch de injectar directamente 1,0 x 10 6 células estaminais hepáticas humanas em 50 ul de PBS para o baço de cada rato. Inclinar a agulha com um ângulo de 5 ° para injecção. <ol><li> Assegure-se que a profundidade de injecção é menos do que metade da espessura do baço. A agulha deve entrar no baço em uma extremidade (cabeça) e depositar as células na outra extremidade (a cauda). </li></ol></li><li> Para evitar vazamento das células após a injeção, aplicar suavemente pressão usando um dedo por 2 min e em seguida, remover a agulha. </li><li> Colocar o baço de volta para dentro do corpo do rato e fechar a cavidade com uma sutura contínua normal para a musculatura e da pele. </li><li> Transferir os ratos em uma gaiola de 37 ° C pré-aquecido imediatamente após o transplante. Para garantir o mouse é capaz de respirar confortavelmente, coloque o mouse sobre o seu lado na gaiola, umanulando o contacto entre a cama gaiola e no local da cirurgia. </li><li> Monitorar os ratos até que a anestesia desgasta fora para garantir as suturas permanecem fechados e os ratos regressar às condições-cirurgia pré. </li><li> Assegurar a ratinhos são fornecidas com água de beber normal e comida. Depois de 1 hora, volte a gaiola para a sala de rato do centro do animal e monitorar os ratos diariamente. </li></ol> 4. Detecção de Transplanted hepática estaminais humanas hepatócitos derivados de células do fígado do rato Nota: Para os seguintes procedimentos, todos os animais a eutanásia, usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical. <ol><li> Aos 4 - 6 semanas após o transplante, eutanásia os ratos e abrir a cavidade abdominal, cortando simultaneamente, a cútis e fáscia usando uma tesoura cirúrgica. </li><li> Dissecar o tecido conjuntivo acima do peritônio, usando a tesoura como um difusor, e cortar o peritônio ao longo da linha alba para abrir o peritonealcavidade. </li><li> Levante o esterno com uma pinça, perfurar o diafragma, e cortar cada lado do esterno-se através do cinto de colo do útero. </li><li> Cortar a veia cava do lado torácica do fígado e puxar o esófago através do fígado na direcção anterior. Remover o diafragma, a fim de remover o fígado. Nota: Tenha cuidado para manter as pontas das tesouras apontou para cima, a fim de evitar qualquer dano aos órgãos torácicos embaixo. O timo tem uma tendência a agarrar-se ocasionalmente para o lado dorsal do esterno e isso deve ser evitado com cuidado. </li><li> Usando o diafragma como uma pega, começam a puxar o fígado para fora da cavidade abdominal. A veia cava interior vai realizar o fígado no lugar. Corte o interior da veia cava; ter cuidado para não libertar prematuramente da adrenal direita. Nota: Os ratos têm um fígado de quatro lóbulos consistindo de um lobo médio, lobo esquerdo, lobo direito e do lobo caudado. A vesícula é suspenso na pequena bifurcaçãoo lobo mediano. </li><li> Separa-se os lóbulos de cada outro nas junções e incorporá-los no composto óptima temperatura de corte (OCT), de acordo com o protocolo do fabricante. Congelar o OCT contendo o tecido do fígado nas grades de metal do criostato. </li><li> Cortar secções de amostra de 5 um de espessura, utilizando um criostato a -18 ° C e montá-los em lâminas de microscópio RT. Armazenar o estoque a -80 ° C. Preparar as lâminas para hematoxilina e eosina (H &amp; E) e imunofluorescência de acordo com os procedimentos relatados anteriormente 16. </li></ol> 5. Detecção de albumina humana e Secreção Cálculo da proteína quimérica Classificação <ol><li> Para medir a reconstituição de fígado humano, albumina humana realizar ELISA utilizando soro de albumina e um kit de ELISA humano de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Calcula-se a taxa de fígado quimérico humanizado por em tempo real A análise de PCR dos níveis de expressão no todo-o fígado humanizado. Determine o ex relativapression rácio nível de actina específicos de humano para cruz actina de ratinho-humano (razão 1) e a razão entre actina específica-rato a cruz actina de ratinho-humano (razão 2). A taxa quimérica é calculado como a relação 1 / (proporção de 1 +, entre 2). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Estudos recentes têm mostrado que o fígado do rato podem ser repovoada com hepatócitos humanos, incluindo hepatócitos e células estaminais adultas hepáticas proliferativas 17. Estes repopulated fígados foram utilizados como modelos experimentais pré-clínicos para drogas de teste do metabolismo e da descoberta e desenvolvimento de medicamentos 18; Além disso, eles têm proporcionado um ambiente in vivo para a maturação e diferenciação celular 19. O principal objetivo do presente e...

Os camundongos são comumente usados para testes farmacêuticos, uma vez que a pesquisa biomédica em humanos é restrita1; no entanto, esses modelos nem sempre são úteis, pois podem simular de forma imprecisa os efeitos observados em humanos. A maioria dos medicamentos em uso médico atual é metabolizada principalmente no fígado. No entanto, a mesma droga pode ser metabolizada em diferentes metabólitos em fígados de camundongos e humanos devido a diferenças entre espécies. Assim, muitas vezes é difícil determinar durante o desenvolvimento se um medicamento potencial apresenta algum risco para aplicações clínicas2,3. 
Para resolver esse problema, fígados de camundongos "humanizados" foram desenvolvidos pelo cultivo de células hepáticas humanas dentro de camundongos4-6; esses modelos exibem respostas a medicamentos semelhantes às observadas no fígado humano. Os principais modelos de camundongos atualmente usados para geração de fígado humanizado incluem camundongos ativadores de uroplasminogênio (uPA+/+)4,7, camundongos fumarilacetoacetato hidrolase (Fah−/−) 6 e os camundongos timidina quinase (TK-NOG) recentemente relatados. 
No entanto, relatórios anteriores mostraram que células humanas imaturas transplantadas ou células-tronco são menos competitivas do que hepatócitos humanos adultos em fígados de camundongos Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. Além disso, os camundongos Fah−/− fornecem uma vantagem de crescimento apenas para hepatócitos diferenciados e não para células progenitoras hepáticas imaturas11. O transplante de células-tronco hepáticas humanas (HpSCs) em camundongos TK-NOG no laboratório não teve sucesso. Portanto, não existe atualmente nenhum modelo de camundongo útil para o enxerto eficiente de células hepáticas humanas imaturas. 
Assim, desenvolvemos um novo modelo de camundongo Alb-TRECK/SCID que poderia ser repovoado de forma eficiente com hepatócitos humanos imaturos. Este modelo de camundongo transgênico expressa receptores de fator de crescimento semelhante a EGF de ligação à heparina humana (HB-EGF) sob o controle de um promotor de albumina específico para células hepáticas. Após a administração da toxina diftérica (TD), esses camundongos desenvolvem hepatite fulminante devido à ablação condicional dos hepatócitos, permitindo a residência e proliferação de células doadoras12. Embora os hepatócitos de camundongos tenham sido transplantados com sucesso em camundongos Alb-TRECK / SCID em estudos anteriores13,14, a geração de um fígado humanizado usando camundongos Alb-TRECK / SCID ainda não foi relatada. 
Neste estudo, fígados humanizados foram gerados em camundongos Alb-TRECK/SCID via transplante de HpSCs. Este fígado humanizado fornece um ambiente in vivo para a diferenciação universal de células-tronco e a capacidade de prever padrões de metabolismo de drogas humanas e interações medicamentosas.

<table><tbody><tr><td>Albumina humana</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Camundongo</td></tr><tr><td>Humano CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Rato</td></tr><tr><td>Núcleos humanos</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Rato</td></tr><tr><td>Humano CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Cobaia</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Rato</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td></td><td>559869 Rato</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td></td><td>551479 Mouse</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Toxina Diftérica</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de Albumina Humana</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G 1/2" agulha</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound(118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japão</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células de alta velocidade MoFlo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de um humanizado rato liver usando células-tronco hepáticas humanas

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Um novo modelo animal envolvendo camundongos quiméricos com fígados humanizados estabelecidos por meio de transplante de hepatócitos humanos foi desenvolvido. Esses camundongos, nos quais o fígado foi repovoado com hepatócitos humanos funcionais, podem servir como uma ferramenta útil para investigar a biologia das células hepáticas humanas, o metabolismo de drogas e outras aplicações pré-clínicas. Um dos principais fatores necessários para o transplante bem-sucedido de hepatócitos humanos em camundongos é a eliminação dos hepatócitos endógenos para evitar a competição com as células humanas e fornecer um espaço e microambiente adequados para promover a expansão e diferenciação de células de doadores humanos. Até o momento, dois modelos principais de camundongos com lesão hepática utilizando camundongos fumarilacetoacetato hidrolase (Fah) e ativador de uroplasminogênio (uPA) foram estabelecidos. No entanto, os camundongos Fah são usados principalmente com hepatócitos maduros e a aplicação do modelo uPA é limitada pela diminuição da reprodução. Para superar essas limitações, camundongos nocaute celular mediado por receptor de toxina alb (TRECK)/SCID foram usados para diferenciação in vivo de hepatócitos humanos imaturos e geração de fígado humanizado. As células-tronco hepáticas humanas (HpSCs) repovoaram com sucesso os fígados de camundongos Alb-TRECK / SCID que desenvolveram insuficiência hepática fulminante letal após o tratamento com toxina diftérica (DT). Este modelo de fígado humanizado em camundongos Alb-TRECK/SCID terá aplicações funcionais em estudos envolvendo metabolismo de drogas e interações medicamentosas e promoverá outros estudos in vivo e in vitro.

Alb-TRECK / hepatócitos ratos SCID expressam o receptor DT gene HB-EGF humano sob o controlo de um promotor de albumina e exibem efeitos citotóxicos após a administração DT 12. Para avaliar os efeitos do tratamento sobre a lesão hepática DT, DT doses de 1,5 ug / kg foram injectadas em ratinhos SCID de 8 semanas de idade, Alb-TRECK / e as alterações patológicas no administração DT hr pós fígado 48 foram avaliados histologicamente. Em comparação com ratos de controlo (não tratad...

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico de transplante de células-tronco é gerar um novo modelo de camundongo quimérico com função hepática humana, utilizando células progenitoras hepáticas imaturas humanas que permitem a proliferação, maturação e diferenciação celular para a aquisição do metabolismo de fármacos. Este método fornece uma ferramenta poderosa para criar um microambiente que apoie a progação de células-tronco hepáticas doadoras humanas, permitindo sua expansão, diferenciação e reconstrução do fígado lesionado do camundongo receptor. A principal vantagem desta técnica é que as células proliferadas podem ser maduradas e utilizadas, e que o fígado é quase completamente repovoado.Para começar, prepare uma solução estoque de toxina da difteria ou DT a um miligrama por mililitro adicionando um mililitro de solução fenolizada de cloreto de sódio 0,85% a um miligrama de DT. Realize uma injeção intraperitoneal de DT segurando um camundongo albtrek scid em posição de decúbito dorsal e abaixo da curvatura dos joelhos, à esquerda ou à direita da linha média, inserindo a agulha em um ângulo de 45 graus em relação ao corpo. Usando uma seringa de insulina, injete 100 microlitros de DT recém-preparada a 0,3 micrograma por mililitro por camundongo de 20 gramas. Quarenta e oito horas após a injeção de DT, coloque o camundongo em um dispositivo de contenção e aqueça a cauda em um banho-maria a 30 graus Celsius por aproximadamente 10 minutos para dilatar os vasos sanguíneos.Em seguida, a dois centímetros da ponta da cauda, use uma lâmina de bisturi afiada para fazer um pequeno corte de um milímetro na cauda e utilize um tubo capilar para coletar o sangue. Centrifugue o tubo capilar microscópico contendo o sangue a 1500 × g por cinco minutos e colete o soro separando o sobrenadante do pellet celular. Pipete 50 microlitros de uma diluição de um para 20 do soro em lâminas GOT ASTP3.Em seguida, utilizando um analisador automático multifuncional de química seca de acordo com o protocolo do fabricante, meça a absorbância do produto da reação em 650 nanômetros. Usando um classificador de células, isole células-tronco hepáticas humanas de células hepáticas fetais primárias humanas com os antígenos celulares CDCP1, CD90 e CD66 para obter uma subpopulação positiva para CDCP1, positiva para CD90 e negativa para CD66. Plaque as células em placas de cultura codificadas com colágeno IV e incube a 37 graus Celsius.Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, use PBS para lavar as células uma vez. Em seguida, adicione tripsina 0,05% EDTA e incube à temperatura ambiente. Quando as células parecerem estar flutuando ou se movendo livremente ao microscópio, interrompa a digestão enzimática adicionando oito mililitros de DMEM-F12 contendo 10% de SBF.Com uma pipeta serológica de 10 mililitros, suspenda lentamente as células antes de transferi-las para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 100 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Usando 10 mililitros de DMEM/F12 com 10% de FBS, ressuspenda cuidadosamente o pellet celular e utilize um instrumento de contagem celular para determinar o número de células.Divida as células em alíquotas de um vezes 10 à sexta potência de células por 50 microlitros de PBS para cada camundongo e mantenha em gelo até o transplante. Após anestesiar um camundongo de acordo com o protocolo descrito, verifique a presença de reflexo apertando levemente a pata traseira. Em seguida, aplique pomada veterinária nos olhos para prevenir ressecamento.Com uma tesoura elétrica, barbeie a área cirúrgica e aplique etanol 70% e iodopovidona para desinfetar. Faça uma incisão de um centímetro na pele no flanco esquerdo, logo abaixo da borda costal das costelas. Em seguida, faça uma incisão na parede abdominal esquerda, seguida por uma incisão no peritônio.Em seguida, exponha cuidadosamente o baço. Depois, em um ângulo de cinco graus, insira uma seringa de microinjeção de 100 microlitros com uma agulha de 32 graus e meia polegada a uma profundidade equivalente à metade da espessura do baço e injete diretamente, de uma extremidade do órgão à outra, uma vez 10 à sexta potência de células-tronco hepáticas humanas em 50 microlitros de PBS no órgão e retire a agulha. Para prevenir o vazamento das células após a injeção, use um dedo para aplicar suavemente pressão durante dois minutos.Coloque o baço de volta no corpo do camundongo e use uma sutura contínua normal para a musculatura e a pele, fechando a cavidade. Transfira imediatamente o camundongo, de lado, para uma gaiola pré-aquecida a 37 graus Celsius. Evite o contato entre a cama da gaiola e o local da cirurgia e monitore o animal de acordo com o protocolo descrito no texto.Aos quatro a seis semanas após o transplante, após eutanasiar o camundongo de acordo com o protocolo descrito, use uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal cortando simultaneamente a pele e a fáscia. Usando a tesoura como afastador, dissecar o tecido conjuntivo acima do peritônio ao longo da linha alba para abrir a cavidade peritoneal. Com uma pinça, levante o esterno.Em seguida, perfure o diafragma e corte cada lado do esterno até o cinturão cervical. Seccione a veia cava no lado torácico do fígado e puxe o esôfago através do fígado em direção anterior. Remova o diafragma e, usando-o como alça, comece a puxar o fígado para fora da cavidade abdominal.A veia cava inferior estará mantendo o fígado no lugar. Portanto, corte a veia cava inferior tomando cuidado para não liberar prematuramente a glândula adrenal direita. Separe os lobos do fígado uns dos outros nas junções e incorpore-os em OCT de acordo com o protocolo do fabricante.Congele a OCT contendo o tecido hepático nas grades metálicas do criostato. Com o criostato, corte seções de amostra com cinco micrômetros de espessura a menos 18 graus Celsius e monte-as em lâminas de microscópio à temperatura ambiente. Armazene o estoque a menos 80 graus Celsius.Por fim, prepare as lâminas para coloração com H&E de acordo com procedimentos previamente descritos e para ELISA de acordo com o protocolo descrito no texto. Como mostrado nestas seções coradas com H&E, camundongos tratados com DT exibiram uma arquitetura hepática desorganizada e apresentaram correção da congestão com aumento da atividade sérica de AST. Seis semanas após o transplante, células derivadas de células-tronco hepáticas humanas reconstituíram a estrutura do fígado substituindo os hepatócitos residentes do camundongo.Macroscopicamente, quatro dias após o transplante, foram detectados pequenos aglomerados hepáticos humanos uniformemente distribuídos ao redor do fígado. Aos 45 dias, os aglomerados haviam proliferado formando grandes aglomerados. Como visto aqui, a presença de hepatócitos humanos em fígados de camundongos foi inicialmente confirmada seis semanas após o transplante por meio de coloração com anticorpos contra núcleos humanos e citoceratina 8/18.Hepatócitos humanos ALB positivos e CK19 negativos assemelhavam-se a hepatócitos funcionais, enquanto células que apresentaram dupla marcação positiva para ALB humano e CK19 exibiram capacidade bi-potencial de diferenciação em hepatócitos e colangiócitos. Detectou-se a presença de múltiplos agregados arredondados ao redor dos lóbulos hepáticos, com núcleos humanos evidentes e expressão de CK8/18, demonstrando a capacidade de formação de colônias das células-tronco hepáticas humanas nos fígados humanizados. Por fim, o nível de repovoamento atingiu até 90% um mês após o transplante, e a secreção de Albúmina humana foi detectada nos fígados de camundongos repovoados.Uma vez dominada, a transplantação cirúrgica de células pode ser realizada em 10 minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a lesão hepática deve ser restrita ao fígado suplente. Em caso de vazamento celular, a transplantação de células deve ser evitada.Combinado com este procedimento, outros métodos, como a transfeção gênica para reprogramação direta in vitro com células humanas, podem ser realizados a fim de explorar a convergência de células humanas com nosso modelo atual. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de hepatologia explorarem o metabolismo de medicamentos em humanos, interações entre medicamentos, toxicidade hepática e o vírus da hepatite em um modelo de fígado humanizado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e expandir a célula-tronco hepática, induzir lesão hepática e transplantar uma célula via baço para gerar um modelo de camundongo quimérico com função hepática humana.Não se esqueça de que a toxina da difteria pode ser controlada e de que precauções importantes, como evitar a necrose do coração e do fígado, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de camundongo humanizado duplo com um sistema imunológico humano e células hepáticas. Envolve o transplante de células hepáticas humanas e células-tronco hematopoiéticas e progenitoras em um camundongo imunodeficiente transgênico por meio de injeção intraesplênica, levando ao enxerto de células hepáticas e ao desenvolvimento de células imunes humanas.

Desenvolvendo um modelo de camundongo humanizado com células hepáticas humanas e células imunológicas

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de rato quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar, usando hepatócitos de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas. Este é um modelo valioso para testar novas terapias para hipercolesterolemia.

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Aprenda a gerar um fígado humanizado em camundongos usando células-tronco hepáticas humanas imaturas. Este método permite estudar metabolismo de fármacos e função hepática humana em modelo quimérico.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

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