Name: Analyse van de SCAP N -glycosylation En handel in menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Ontdek een vereenvoudigde methode voor analyse van SCAP N-glycosylering en transport in menselijke cellen. Deze techniek maakt detectie van migratieverschuiving na N-glycaanverwijdering mogelijk voor onderzoek naar lipidenmetabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn Drs. Mike S. Brown en Joseph L. Goldstein dankbaar voor hun akkoord om deze methode te publiceren volgens de methoden beschreven in hun publicaties. We waarderen Dr. Peter Espenshade voor het delen van de GFP-SCAP plasmide. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies NS072838 en NS079701 aan D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM aan D.G., en OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship aan C.C. We waarderen ook de steun van de Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) en OSUCCC Translationeel Therapeutisch Programma seed grant en start-up fondsen aan D.G.

1. Detectie van endogene SCAP eiwit in menselijke cellen <ol><li> Celkweek en behandeling <ol><li> Zaad ~ 1 x 10 6 U87 cellen in een 10 cm schaal met Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voor de behandeling. </li><li> Was de cellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), schakel cellen vers DMEM-medium met of zonder glucose (5 mM) gedurende 12 uur. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de celmembraan fracties en nucleaire extracten <ol><li> Was de cellen eenmaal met PBS, schrapen in 1 ml PBS en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in een ijskoude buffer die 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium- ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 mM natrium ethyleenglycol azijnzuur (EGTA), 250 mM sucrose en een mengsel van proteaseremmers (5 μg / ml pepstatine A, 10 pg / ml leupeptine, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT) en 25 ug / ml N-acetyl-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) gedurende 30 min op ijs. </li><li> Celextracten passeren door een 22 G x 1 1/2 naald 30 keer en centrifugeer bij 890 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten om kernen te isoleren. </li><li> Met de bovenstaande vloeistof voor de scheiding van membraanfracties (stap 1.2.7). Resuspendeer de nucleaire pellet in 0,1 ml buffer C (20 mM HEPES / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v / v) glycerol, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium-EDTA, 1 mM natrium EGTA en een mengsel van proteaseremmers (5 ug / ml pepstatine A, 10 pg / ml leupeptine, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, en 25 ug / ml ALLN)). </li><li> Draai de suspensie bij 4 ° C gedurende 60 minuten en centrifugeer bij 20.000 x g in een microcentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 ° C. De supernatant wordt aangeduid als &quot;nucleaire extracten&quot;. </li><li> Verwarm de nucleaire extracten bij 100 ° C gedurende 10 minuten met 5 x laadbuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-mercaptoethanol en 0,05% broomfenolblauw) voor het onderwerpen aan SDS-PAGE. </li><li> Centrifugeer de supernatant van de oorspronkelijke 890 xg centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Voor daaropvolgende Western blotanalyse los de pellet in 0,1 ml SDS-lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 100 mM NaCl, 1% (v / v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 mM natrium-EDTA, en 1 mM natrium EGTA). Dit wordt aangeduid als &quot;membraanfractie&quot;. LET OP: We maken gebruik van 20.000 xg gedurende 20 min aan membranen pellet. 100.000 xg gedurende 10 - 20 minuten is gebruikt in de papieren van de Brown en Goldstein laboratorium 15. </li><li> Incubeer het membraan fractie bij 37 ° C gedurende 30 minuten en bepaal de proteïneconcentratie door Bradford eiwitbepaling. Voeg 1 pl 100x broomfenolblauw oplossing vóór het onderwerpen van de monsters aan SDS-PAGE. </li><li> Load 25-50 ug totaal membraaneiwitten op een 10% SDS-PAGE gel 39. Voer het gelbij 80 V gedurende 15 minuten, dan veranderen tot 130 V en uit te voeren voor een ander 115 min. Transfer bij 140 mA gedurende 130 min 39. <ol><li> Voor Western blot analyse gebruik van anti-SCAP antilichaam aan het totale SCAP eiwit detecteren. Gebruik eiwit-isomerase (PDI), een ER-resident-eiwit 40, als een interne controle. Met anti-SREBP-1 antilichaam aan het N-terminale groep SREBP-1 te detecteren. Gebruik Lamin A als een interne controle voor nucleaire extracten 31. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Analyse van SCAP N -glycosylation in menselijke cellen <ol><li> Celkweek, transfectie en behandeling <ol><li> Voor membraan analyse zaad ~ 1 x 10 6 HEK293T cellen in een 10 cm schaal met DMEM aangevuld met 5% FBS en incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voor transfectie. </li><li> Verdunnen 4-8 ug GFP-SCAP plasmide (een gift van Dr. Peter Espenshade) 22 in 1 ml gereduceerd serum medium en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 8-16 ul DNA transfectiereagens door direct pipetteren in de 1 ml gereduceerd serum medium dat plasmiden en meng voorzichtig. </li><li> Incubeer de transfectiereagens / plasmide complex gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg transfectie complex aan de cellen met vers medium en blijven kweek gedurende 24 uur bij 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> Was eenmaal met PBS en behandeling van de cellen gedurende 12 uur met of zonder glucose (5 mM) in aanwezigheid of afwezigheid van tunicamycine (1 ug / ml), een N -glycosylation inhibitor. </li></ol></li><li> Bereid celmembraan pellets zoals beschreven in de stappen 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3 en 1.2.7. </li><li> Detectie van SCAP N -glycosylation <ol><li> trypsine Proteolyse <ol><li> Resuspendeer het membraan pellets uit cellen tot overexpressie GFP-SCAP in 114 pl buffer die 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 1 mM natrium EDTA en 100 mM NaCl. </li><li> Incubate 5781, l aliquots van membraaneiwitten in afwezigheid of aanwezigheid van 1 pl trypsine (1 pg / pl), in een totaal volume van 58 ui, gedurende 30 minuten bij 30 ° C. </li><li> Stop de reacties door toevoegen van 2 pl (400 eenheden) sojaboon trypsineremmer. </li></ol></li><li> Deglycosylatie door peptide-N- glycosidase F (PNGase F) <ol><li> Met aansluitende behandeling met PNGase F, voeg 10 ul oplossing die 3,5% (gew / vol) SDS en 7% (vol / vol) 2-mercaptoethanol aan elk monster. </li><li> Na verwarmen bij 100 ° C gedurende 10 min, achtereenvolgens voeg 7 pl 0,5 M natriumfosfaat (pH 7,5), 7 gl 10% (v / v) Nonidet P-40 met 12 × proteaseremmers, en 2 ui (0,5 U / pl) van PNGase F. </li><li> Na incubatie bij 37 ° C gedurende 3 uur, stop reactie door de toevoeging van 5 x laadbuffer (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 12,5% β-mercaptoethanol en 0,05% broomfenolblauw). Verwarm het mengsel bij 100 ° C gedurende 10 min en onderworpen aan SDS-PAGE. Laad 25-50 ug totaal membraaneiwitten op een 10% SDS-PAGE gel 39. Voer de gel bij 80 V gedurende 15 minuten, dan veranderen tot 130 V voor nog eens 115 min. Transfer bij 140 mA gedurende 130 min. </li><li> Voor de Western blot gebruikt 10 ug / ml anti-SCAP (9D5) antilichaam tegen N -glycosylation en totale SCAP eiwit detecteren. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Detectie van SCAP Trafficking van ER naar het Golgi met behulp van GFP-SCAP in menselijke cellen <ol><li> Zaad 2,5 x 10 5 U87 cellen in een 60 mm schaal met DMEM aangevuld met 5% FBS en incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voor transfectie. </li><li> Verdun 4 ug GFP-SCAP plasmide in 0,5 ml gereduceerd serum medium en meng. </li><li> Voeg 8 ul DNA transfectiereagens door pipetteren direct in 0,5 ml gereduceerd serum medium dat plasmiden en meng voorzichtig. </li><li> Incubeer de transfectiereagens / plasmide complex gedurende 25 minuten bij kamertemperatuurtemperatuur. </li><li> Voeg transfectie complex aan de cellen met vers medium en blijven kweek gedurende 24 uur bij 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> Reseed 5-10 x 10 4 cellen in een 6-wells plaat met een dekglaasje (22 mm x 22 mm) en verder kweken bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur. </li><li> Was eenmaal met PBS en behandeling van de cellen gedurende 12 uur met of zonder glucose (5 mM) in aanwezigheid of afwezigheid van tunicamycine (1 ug / ml). </li><li> Was de cellen eenmaal met PBS en fixeer 4% formaldehyde gedurende 10 minuten. </li><li> Was de cellen drie keer met PBS, keren de dekglaasjes, monteren op dia&#39;s samen met antifade reagens, en sluit de dekglaasjes met behulp van nagellak. </li><li> Controleer de GFP-SCAP handel met behulp van een 63x olie-immersie objectief in een laser scanning confocale microscoop 41. </li></ol>

<ol><li>Ru, P., Williams, T. M., Chakravarti, A., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metabolism+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor metabolism of malignant gliomas.</a> Cancers (Basel). 5, 1469-1484 (2013).</li>
<li>Moon, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scap%2FSREBP+pathway+is+essential+for+developing+diabetic+fatty+liver+and+carbohydrate-induced+hypertriglyceridemia+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">The Scap/SREBP pathway is essential for developing diabetic fatty liver and carbohydrate-induced hypertriglyceridemia in animals.</a> Cell metabolism. 15, 240-246 (2012).</li>
<li>Guo, D., Bell, E. H., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+emerges+as+a+promising+target+for+malignant+glioma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism emerges as a promising target for malignant glioma therapy.</a> CNS Oncology. 2, 289-299 (2013).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+agonist+AICAR+inhibits+the+growth+of+EGFRvIII-expressing+glioblastomas+by+inhibiting+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The AMPK agonist AICAR inhibits the growth of EGFRvIII-expressing glioblastomas by inhibiting lipogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12932-12937 (2009).</li>
<li>Menendez, J. A., Lupu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+synthase+and+the+lipogenic+phenotype+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 763-777 (2007).</li>
<li>Guo, D., Cloughesy, T. F., Radu, C. G., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK%3A+A+metabolic+checkpoint+that+regulates+the+growth+of+EGFR+activated+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">AMPK: A metabolic checkpoint that regulates the growth of EGFR activated glioblastomas.</a> Cell Cycle. 9, 211-212 (2010).</li>
<li>Goldstein, J. L., DeBose-Boyd, R. A., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sensors+for+membrane+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein sensors for membrane sterols.</a> Cell. 124, 35-46 (2006).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+Roles+for+SREBP+in+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">Expanding Roles for SREBP in Metabolism.</a> Cell metabolism. 16, 414-419 (2012).</li>
<li>Nohturfft, A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+lipid+metabolism+in+membrane+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 25, 539-566 (2009).</li>
<li>Jeon, T. I., Osborne, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBPs%3A+metabolic+integrators+in+physiology+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">SREBPs: metabolic integrators in physiology and metabolism.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 23, 65-72 (2012).</li>
<li>Sato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+membrane+attachment%2C+DNA+binding%2C+and+transcriptional+activation+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+protein-1+%28SREBP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Assignment of the membrane attachment, DNA binding, and transcriptional activation domains of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1).</a> The Journal of biological chemistry. 269, 17267-17273 (1994).</li>
<li>Sakai, J., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+at+site-1+requires+interaction+with+SREBP+cleavage-activating+protein.+Evidence+from+in+vivo+competition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cleavage of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) at site-1 requires interaction with SREBP cleavage-activating protein. Evidence from in vivo competition studies.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 5785-5793 (1998).</li>
<li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+complexes+between+the+COOH-terminal+domains+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+and+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of complexes between the COOH-terminal domains of sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) and SREBP cleavage-activating protein.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 20213-20221 (1997).</li>
<li>Hua, X., Nohturfft, A., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+resistance+in+CHO+cells+traced+to+point+mutation+in+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sterol resistance in CHO cells traced to point mutation in SREBP cleavage-activating protein.</a> Cell. 87, 415-426 (1996).</li>
<li>Nohturfft, A., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+SREBP+cleavage-activating+protein%2C+a+polytopic+membrane+protein+with+a+sterol-sensing+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Topology of SREBP cleavage-activating protein, a polytopic membrane protein with a sterol-sensing domain.</a> The Journal of biological chemistry. 273, 17243-17250 (1998).</li>
<li>Nohturfft, A., Hua, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+G-to-A+substitution+in+a+single+codon+of+SREBP+cleavage-activating+protein+causes+sterol+resistance+in+three+mutant+Chinese+hamster+ovary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recurrent G-to-A substitution in a single codon of SREBP cleavage-activating protein causes sterol resistance in three mutant Chinese hamster ovary cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13709-13714 (1996).</li>
<li>Espenshade, P. J., Hughes, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+sterol+synthesis+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of sterol synthesis in eukaryotes.</a> Annu Rev Genet. 41, 401-427 (2007).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+step+in+cholesterol+homeostasis%3A+sterols+promote+binding+of+SCAP+to+INSIG-1%2C+a+membrane+protein+that+facilitates+retention+of+SREBPs+in+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crucial step in cholesterol homeostasis: sterols promote binding of SCAP to INSIG-1, a membrane protein that facilitates retention of SREBPs in ER.</a> Cell. 110, 489-500 (2002).</li>
<li>Yabe, D., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insig-2%2C+a+second+endoplasmic+reticulum+protein+that+binds+SCAP+and+blocks+export+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insig-2, a second endoplasmic reticulum protein that binds SCAP and blocks export of sterol regulatory element-binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12753-12758 (2002).</li>
<li>Yabe, D., Xia, Z. P., Adams, C. M., Rawson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+mutations+in+sterol-sensing+domain+of+SCAP+block+interaction+with+insig+and+render+SREBP+cleavage+insensitive+to+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 16672-16677 (2002).</li>
<li>Espenshade, P. J., Li, W. P., Yabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterols+block+binding+of+COPII+proteins+to+SCAP%2C+thereby+controlling+SCAP+sorting+in+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterols block binding of COPII proteins to SCAP, thereby controlling SCAP sorting in ER.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11694-11699 (2002).</li>
<li>Nohturfft, A., Yabe, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+step+in+cholesterol+feedback+localized+to+budding+of+SCAP+from+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated step in cholesterol feedback localized to budding of SCAP from ER membranes.</a> Cell. 102, 315-323 (2000).</li>
<li>Sakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol-regulated+release+of+SREBP-2+from+cell+membranes+requires+two+sequential+cleavages%2C+one+within+a+transmembrane+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sterol-regulated release of SREBP-2 from cell membranes requires two sequential cleavages, one within a transmembrane segment.</a> Cell. 85, 1037-1046 (1996).</li>
<li>Wang, X., Sato, R., Brown, M. S., Hua, X., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBP-1%2C+a+membrane-bound+transcription+factor+released+by+sterol-regulated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SREBP-1, a membrane-bound transcription factor released by sterol-regulated proteolysis.</a> Cell. 77, 53-62 (1994).</li>
<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteolytic+pathway+that+controls+the+cholesterol+content+of+membranes%2C+cells%2C+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11041-11048 (1999).</li>
<li>Rawson, R. B., DeBose-Boyd, R., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+cleave+sterol+regulatory+element-binding+proteins+%28SREBPs%29+causes+cholesterol+auxotrophy+in+Chinese+hamster+ovary+cells+with+genetic+absence+of+SREBP+cleavage-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein.</a> J Biol Chem. 274, 28549-28556 (1999).</li>
<li>Zelenski, N. G., Rawson, R. B., Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+of+S2P%2C+a+protein+required+for+intramembranous+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane topology of S2P, a protein required for intramembranous cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> J Biol Chem. 274, 21973-21980 (1999).</li>
<li>Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Century+of+Cholesterol+and+Coronaries%3A+From+Plaques+to+Genes+to+Statins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Century of Cholesterol and Coronaries: From Plaques to Genes to Statins.</a> Cell. 161, 161-172 (2015).</li>
<li>Espenshade, P. J., Cheng, D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocatalytic+processing+of+site-1+protease+removes+propeptide+and+permits+cleavage+of+sterol+regulatory+element-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Autocatalytic processing of site-1 protease removes propeptide and permits cleavage of sterol regulatory element-binding proteins.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 22795-22804 (1999).</li>
<li>Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAP+links+glucose+to+lipid+metabolism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Oncol%22%5BJournal%5D)">SCAP links glucose to lipid metabolism in cancer cells.</a> Mol Cell Oncol. 3, (2016).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li>
<li>Shao, W., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+Makes+Fat+by+Talking+to+SCAP%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sugar Makes Fat by Talking to SCAP.</a> Cancer Cell. 28, 548-549 (2015).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+through+an+Akt-SREBP-1-dependent%2C+rapamycin-resistant+pathway+sensitizes+glioblastomas+to+antilipogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling through an Akt-SREBP-1-dependent, rapamycin-resistant pathway sensitizes glioblastomas to antilipogenic therapy.</a> Sci Signal. 2, 82(2009).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR+agonist+promotes+GBM+cell+death+through+inhibition+of+an+EGFR%2FAKT%2FSREBP-1%2FLDLR-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">An LXR agonist promotes GBM cell death through inhibition of an EGFR/AKT/SREBP-1/LDLR-dependent pathway.</a> Cancer Discov. 1, 442-456 (2011).</li>
<li>Guo, D., Bell, E. H., Mischel, P., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SREBP-1-driven+lipid+metabolism+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Targeting SREBP-1-driven lipid metabolism to treat cancer.</a> Curr Pharm Des. 20, 2619-2626 (2014).</li>
<li>Bell, E. H., Guo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Malignant+Gliomas%2C+Radiation+Medicine+Rounds%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for malignant gliomas.</a> Malignant Gliomas, Radiation Medicine Rounds. 3, 339-357 (2012).</li>
<li>Geng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SOAT1+suppresses+glioblastoma+growth+via+blocking+SREBP-1-mediated+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SOAT1 suppresses glioblastoma growth via blocking SREBP-1-mediated lipogenesis.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li>
<li>Ru, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+Loop+Regulation+of+SCAP%2FSREBP-1+by+miR-29+Modulates+EGFR+Signaling-Driven+Glioblastoma+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Feedback Loop Regulation of SCAP/SREBP-1 by miR-29 Modulates EGFR Signaling-Driven Glioblastoma Growth.</a> Cell Rep. , (2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Uehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylated+protein-disulphide+isomerase+links+protein+misfolding+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylated protein-disulphide isomerase links protein misfolding to neurodegeneration.</a> Nature. 441, 513-517 (2006).</li>
<li>Miyashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+for+intracellular+co-localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy for intracellular co-localization of proteins.</a> Methods Mol Biol. 1278, 515-526 (2015).</li>
<li>Cao, J., Guo, S., Arai, K., Lo, E. H., Ning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+extracellular+signaling+utilizing+a+glycoproteomic+approach%3A+lectin+blot+surveys%2C+a+first+and+important+step%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying extracellular signaling utilizing a glycoproteomic approach: lectin blot surveys, a first and important step.</a> Methods Mol Biol. 1013, 227-233 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie beschrijven we een protocol voor de isolatie van membraanfracties in menselijke cellen en voor de bereiding van de monsters voor de detectie van SCAP N -glycosylation en totaal eiwit door Western blot. Wij bieden verder een methode om SCAP mensenhandel te controleren met behulp van GFP-etikettering en confocale microscopie. De methode wordt specifiek gebruikt om membraaneiwit te analyseren en is een belangrijk instrument om SCAP N -glycosylation en mensenhandel te onderzoeken. <p cla...

Deregulering van het vetmetabolisme is een gemeenschappelijk kenmerk van kanker en metabole ziekten 1-6. Bij deze werkwijzen, sterol-regulerende element bindende eiwitten (SREBPs), een familie van transcriptiefactoren, spelen een cruciale rol in de expressie van genen betrokken in de opname en de synthese van cholesterol, vetzuren en fosfolipiden 7-10. SREBPs, waaronder SREBP-1a, SREBP-1c en SREBP-2, worden gesynthetiseerd als inactieve precursors die binden aan het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan vanwege twee transmembraandomeinen 7. De N-terminus van SREBPs bevat een DNA-bindingsdomein voor de transactivatie van doelgenen 11. De C-terminus van SREBP precursors bindt aan SREBP-splitsing activerend eiwit (SCAP) 12,13, polytopisch een membraaneiwit dat een centrale rol in de regulatie van SREBP stabiliteit en activering 14-16 speelt. de uitvoelegging van transcriptionele functie vereist de translocatie van de SCAP / SREBP complex uit het ER naar het Golgi, waar twee proteases sequentieel SREBP splitsen en laat de N-terminale fragment, dat vervolgens gaat in de kern van de transactivatie van lipogene genen 7. Bij deze werkwijzen, de niveaus van sterolen in het ER membraan controle van de uitgang van de SCAP / SREBP complex uit het ER 7,17. Onder hoge sterol omstandigheden, sterol bindt aan SCAP of ER-resident insuline-geïnduceerde gen-eiwit-1 (Insig-1) of -2 (Insig-2), het verbeteren van de associatie van SCAP met Insigs dat de SCAP / SREBP complex in het behouden ER 18-20. Wanneer sterolen verlagen, SCAP distantieert met Insigs. Dit leidt tot een SCAP conformationele verandering die SCAP interactie gemeenschappelijke manteleiwitten (COP) II complex maakt. Het complex bemiddelt de opname van de SCAP / SREBP complex in de ontluikende blaasjes en richt haar vervoer van het ER naar het Golgi 21,22. Bij Translocatie het Golgi worden SREBPs achtereenvolgens gesplitst door site-1 en Site-2 proteasen, wat leidt tot de afgifte van N-terminus 7,23-29. SCAP eiwit draagt drie N-gebonden oligosachariden op asparagine (N) positioneert N263, N590, N641 en 15. We hebben onlangs onthuld dat glucose-gemedieerde N -glycosylation van SCAP in deze sites is een voorwaarde voorwaarde voor SCAP / SREBP mensenhandel uit het ER naar het Golgi onder lage sterolen omstandigheden 30-32. Verlies van SCAP glycosylering via mutatie van alle drie de asparagine naar glutamine (NNN naar QQQ) schakelt de handel in de SCAP / SREBP complex en resulteert in de instabiliteit van SCAP eiwit en vermindering van SREBP activering 31. Onze recente gegevens tonen ook aan dat SREBP-1 is zeer actief in glioblastoma en gereguleerd door SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1-signalering is in opkomst als een nieuwe strategie om maligniteiten en metabole s behandelenyndromes 1,3,35-38. Daarom is het belangrijk om een effectieve methode om SCAP eiwit en N -glycosylation niveaus analyseren en controleren de handel in menselijke cellen en weefsels patiënten ontwikkelen. De luminale regio SCAP eiwit (aminozuren 540-707) in het ER bevat twee N -glycosylation sites (N590 en N641), die worden beschermd tegen proteolyse wanneer intacte membranen worden behandeld met trypsine 15. Deze luminale fragment heeft een molecuulgewicht van ~ 30 kDa die klein genoeg is om de oplossing van individuele geglycosyleerde varianten van SCAP door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) 15,31 toelaten. Hier geven we een methode om N -glycosylation van SCAP en de totale hoeveelheid eiwit in menselijke cellen te detecteren. Dit protocol is afgeleid van de in de publicaties van Brown en Goldstein laboratorium 15 en onze recente publicatie 31 beschreven werkwijze. Het protocol kan worden gebruikt in thij bestuderen van SCAP eiwit uit zoogdiercellen.

```html
<table><tbody><tr><td>X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEMI medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>trypsin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>soybean trypsin inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCAP (9D5) antibody&nbsp;&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>GFP antibody&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>SREBP-1 antibody (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>PDI Antibody (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A Antibody (H-102)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>SCAP antibody (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine&nbsp;&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>Voeg 1 mM Pyruvaat en 4 mM Glutamine toe voor gebruik</td></tr><tr><td>22 G x 1 1/2 needle</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Solution 0.5 M pH 8.5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0.5 M steriele (pH 8.0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>prolong gold antifade reagent with dapi</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>
```

analyse van de scap<em&gt; n</em&gt; -glycosylation en handel in menselijke cellen

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Verhoogde lipogenese is een veelvoorkomend kenmerk van kanker en metabole ziekten. Sterol regulatorische element-bindende eiwitten (SREBPs), een familie van membraangebonden transcriptiefactoren die de expressie van genen controleren die belangrijk zijn voor de synthese van cholesterol, vetzuren en fosfolipiden, worden vaak opgereguleerd in deze ziekten. In het proces van SREBP-nucleaire translocatie speelt SREBP-cleaving activerend eiwit (SCAP) een centrale rol in het transport van SREBP van het endoplasmatisch reticulum (ER) naar de Golgi en in de daaropvolgende proteolyse-activering. Onlangs ontdekten we dat glucose-gemedieerde N-glycosylering van SCAP een voorwaarde is voor de uitgang van SCAP/SREBP uit het ER en beweging naar de Golgi. N-glycosylering stabiliseert SCAP en geeft richting aan het SCAP/SREBP-transport. Hier beschrijven we een protocol voor de isolatie van membraanfracties in menselijke cellen en voor de voorbereiding van de monsters voor de detectie van SCAP N-glycosylering en totaal eiwit met behulp van western blot. We bieden verder een methode om SCAP-transport te monitoren met behulp van confocale microscopie. Dit protocol is geschikt voor de onderzoek van SCAP N-glycosylering en transport in zoogdiercellen.

Figuur 1 toont de detectie van endogene SCAP eiwit en SREBP-1 nucleair vorm humane glioblastoma U87 cellen als reactie op stimulatie met glucose western blot. Het membraaneiwit SCAP wordt gedetecteerd in de &quot;membraanfractie&quot;. De kern vorm (N-terminale) van SREBP-1 gedetecteerd in de &quot;nucleaire extracten&quot;. Het niveau van SCAP eiwit (PDI fungeert als een interne controle van ER membraaneiwitten) en SREBP-1 nucleair vorm worden aanzienlijk verbeter...

We beschrijven een aangepaste werkwijze voor membraanfractie isolatie uit humane cellen en monstervoorbereiding voor de detectie van SCAP N -glycosylation en totaal eiwit door Western blot. We verdere invoering van een GFP-labeling methode om SCAP mensenhandel te monitoren met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan in normale biologische laboratoria.

Analyse van de SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation En handel in menselijke cellen

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige aanpak te bieden voor het analyseren van de N-glycosylering van SCAP en het transport ervan in menselijke cellen. Deze methode wordt gebruikt om de N-glycosylering van SCAP te analyseren, welke onmisbaar is voor het transport van SCAP en de activering van het SREBP-gemedieerde lipidenmetabolisme in zoogdiercellen. In vergelijking met de conventionele methode waarbij lectines worden gebruikt, biedt onze methode een eenvoudige procedure voor het identificeren van SCAP N-glycosylering, waarbij de migratieverschuiving wordt gedetecteerd na het verwijderen van N-glycaan met PNGase.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in kanker, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals hart- en vaatziekten en metabole syndromen. Om deze procedure te starten, zaait u 1×10⁶ U87-cellen in een schaal van 10 cm met DMEM aangevuld met 5% FBS, en incubeert u de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 vóór de behandeling. Was vervolgens de cellen eenmaal met PBS.Vervang vervolgens de PBS door vers DMEM-medium met of zonder glucose gedurende 12 uur. Om celmembraanfracties en nucleaire extracten te bereiden, worden de cellen één keer gewa

analysis-of-scap-n-glycosylation-and-trafficking-in-human-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

We beschrijven een standaard protocol antilichaam kleuring voor microscopie aan het membraan expressie en localisatie van gangliosiden in rustende en geactiveerde humane naïeve CD4 + T-cellen te bepalen. Ook beschreven zijn real-time PCR experimenten met &lt;40.000 cellen die geen extra lage input RNA kits vereisen.

Bereiding van CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen voor analyse van GD3 ganglioside GD2 en Membraanexpressie door Microscopie

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Gepresenteerd hier is een protocol dat combineert een in vitro neurale-endotheliale co-cultuur systeem en metabole opname van sialoglycan met bioorthogonal functionele groepen uit te breiden primaire zenuw stam en voorlopercellen en label hun oppervlak sialoglycoproteïnen voorbeeld vorming of massaspectrometrie analyse van celoppervlak markeringen.

Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Retrograde vervoer van eiwitten uit het celoppervlak naar het Golgi is essentieel voor het handhaven van de membraan homeostase. Hier beschrijven we een methode om biochemically cel oppervlak-te-Golgi vervoer van recombinante eiwitten matiemaatschappij nanobodies met HeLa cellen te analyseren.

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Dit protocol beschrijft verschillende methoden die kunnen helpen bij de studie van ATG9A-biologie, waaronder immunofluorescentie gevolgd door beeldanalyse, overwegingen met betrekking tot voorbijgaande overexpressie en het onderzoeken van de ATG9A-glycosyleringsstatus met behulp van western blot.

Beeldvorming van ATG9A, een multi-overspanning membraaneiwit

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Hier stellen we een eenvoudig protocol voor dat metabole oligosacharide-engineering, klikchemie en expansiemicroscopie combineert en dat bioimaging van intracellulaire gesialyleerde N-glycoproteïnen met verbeterde resolutie mogelijk maakt met behulp van routinematige microscopieapparatuur.

Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie

Ontdek een vereenvoudigde methode voor analyse van SCAP N-glycosylering en transport in menselijke cellen. Deze techniek maakt detectie van migratieverschuiving na N-glycaanverwijdering mogelijk voor onderzoek naar lipidenmetabolisme.

Analyse van de SCAP

Meer video's verkennen