Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te bieden die een vereenvoudigde manier van carbogenatie van kleine volumes gerecycled ACSF garandeert en om langdurige registraties van veldpotentialen mogelijk te maken met behulp van een registratiekamer die op een fluorescentiemicroscoop is gemonteerd. Deze methode kan ons helpen antwoord te geven op kernvragen op het gebied van neuroplasticiteit met betrekking tot de onderliggende ligninepaden die de synaptische transmissie en vorming van geheugen in een cellulaire modus van leren en herinneringen reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het helpt het zuurstofniveau van een klein bioreservoir te stabiliseren om de kostenefficiëntie van experimenten met specifieke antagonisten of agonisten te verhogen.

De bereiding van acute hippocampus-sneden wordt gedemonstreerd door de PhD-studenten, Xia en Weiguang van ons laboratorium. Om deze procedure te starten, gebruik een koud chirurgisch mesje om een stuk van de dorsale cortex onder een hoek van 70 graden langs de dorsale rand van elke hemisfeer te dissecteren. Verplaats elke hemisfeer met een koude spatel voor tandheelkundig cement naar een stuk filterpapier om het oppervlak kort te drogen.

Bevestig de twee hemisferen met vers gesneden oppervlakken op het ijskoud snijplatform met behulp van snelhardende lijm, zodanig dat het caudale uiteinde van de hemisferen naar het scheermes is gericht. Plaats vervolgens het snijplatform in de koelkamer van een vibratoom. Vul de kamer met de snijbuffer op twee tot vier graden Celsius en verzadig deze met carbogeen.

Snijd daarna coupes van 350 micrometer met behulp van geschikte vibrotoominstellingen. Isoleer de hippocampusformatie van het subiculum en de entorhinale cortexen met twee injectiecanules als scharen. Verwijder de luchtbellen uit het rooster voor de coupes van de eerder voorbereide incubatiekamer met een pasteurpipet.

Breng vervolgens de coupes die een zekere transparantie vertonen bij het stratum pyramidale vanuit het snijplatform over naar het gaas van de incubatiekamer met een pasteurpipet met een brede opening. Voeg bij deze stap een driewegslangconnector toe aan de uitstroom van het recyclagesysteem. Verbind de middelste arm van de driewegslangconnector met een carbogen-toevoerslang en reguleer de stroomsnelheid met een luchtstroommeter.

Voeg daarna een tweede driewegslangconnector toe aan de instroom van het recirculatiesysteem. Verbind de middelste arm met de slang die naar de inline-verwarmer is gericht, de bovenste arm met een dunne siliconenslang en de onderste arm met de instroomslang vanuit het reservoir. Plaats vervolgens een slangknijper op een dunne siliconenslang op een positie langs de slang waar de pulsatie van de ACSF in de slice-kamer, veroorzaakt door de peristaltische pomp, minimaal is.

Week nu een klein stukje lensreinigingspapier en een nylon gaas, dat is bevestigd aan een U-vormige platina draad, enkele minuten in de dompelkamer voor coupes. Verwijder daarna de U-vormige platina draad. Schakel de recirculatie uit en plaats een coupe op het lensreinigingspapier.

Plaats vervolgens onmiddellijk het rooster voor het vasthouden van de slice bovenop de slice. Zet de pomp aan en laat de slice 30 minuten equilibreren zonder dat de objectief in de ACSF wordt gedoopt. Vul ondertussen de registreerelektrode met ACSF en monteer deze in de pipethouder.

Controleer de isolatie van de metalen stimulatie-elektrode door deze in een natriumbicarbonaatoplossing te plaatsen. Verbind de elektrode met de negatieve pool van een DC-spanningsgenerator en observeer de vorming van belletjes bij de punt onder een dissectiemicroscoop. Plaats vervolgens de geteste, met epoxy geïsoleerde wolfraam stimulatie-elektrode in de houder van de manipulator en de referentiedraad in de slice-kamer.

Voeg een tweede referentie-elektrode toe aan de kamer en verbind deze met de referentiesaat van de head stage van de registratie-elektrode. Klik in de software voor de versterkerbesturing op het vakje voor de zero clamp-modus en dubbelklik vervolgens op de lijst met outputversterking. Kies een versterking van 100, dubbelklik op het vak voor het hoogpassfilter, kies drie kilohertz en dubbelklik op de lijst voor het laagpassfilter AC om 0,1 hertz te kiezen.

Klik in de opnamesoftware op 'acquire' en vervolgens op 'open protocol'. Kies een protocol met instellingen die episodische stimulaties en de digitalisering van versterkte potentialen bij 10 tot 20 kilohertz gedurende 50 tot 100 milliseconden mogelijk maken, en dat automatisch een stimulusisolator triggert 10 milliseconden na de start van een episodische opname. Plaats de stimulatie- en registratie-elektroden in lijn en parallel aan het stratum pyramidale.

Klik vervolgens op acquire, edit protocol en kies het tabblad trigger in het pop-upvenster. Klik op het vak trigger source en selecteer space bar als triggerbron. Klik daarna op de knop okay en klik op de knop record om de acquisitie te starten.

Klik in de software van de stimulusisolator op het vak voor de spanningsregeling en voer nul in. Klik op de downloadknop. Klik daarna op het venster van de opnamesoftware en druk op de spatiebalk.

Herhaal deze cyclus door opeenvolgend waarden van 1000 tot 8000 in te voeren. Correleer de stimulussterkte met de FEPSP-hellingswaarden en bepaal de stimulussterkte die nodig is om 40% van de maximale FEPSP-helling te bereiken. Klik op het vak voor de spanningsregeling en voer de bepaalde waarde in.

Klik vervolgens op de downloadknop. Klik in de opnamesoftware op de stopknop en daarna op het menu acquire. Klik op edit protocol en kies het tabblad trigger in het pop-upvenster.

Klik vervolgens op het vak voor de triggerbron en kies de interne timer als triggerbron. Klik op de ok-knop en daarna op de opnameknop om de automatische registratie van veldpotentialen om de 60 seconden te starten. Klik na 30 tot 60 minuten op de stopknop.

Klik in de opnamesoftware op acquire, open protocol, en kies hetzelfde protocol als voor de baseline-opname. Klik op de okay-knop en klik vervolgens op record. Laat de veldpotentiaalmetingen automatisch twee tot vier uur lang doorlopen.

Wanneer dit voltooid is, klikt u op de stopknop om de opname te beëindigen. Deze figuur toont de representatieve opnamen van activiteitsafhankelijke potentiëring van synaptische transmissie met gebruik van outflow-carbogenatie en reservoir-carbogenatie met recycling van een klein ACSF-reservoir. De potentiëring werd na tijdstip nul geïnduceerd door drie trains van 100 hertz per seconde.

Deze figuur laat zien dat carbogenatie van de uitstroom met recycling van een klein ACSF-reservoir de LTD-inductie verbeterde in vergelijking met experimenten waarbij alleen carbogenatie van het reservoir werd toegepast. Zodra de techniek onder de knie is, kan de preparatie van de slice in vijf tot 10 minuten worden voltooid en kan er, mits correct uitgevoerd, gedurende vele uren een stabiele registratie van het veldpotentiaal worden bereikt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het carbogenatieniveau, de perfusiesnelheid, de positie van de elektroden en de stimulatiestress voor uw specifieke opstelling aan te passen.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals de patchclamp en forensische microscopie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de virilisatie van sap, de cellulaire lokalisatie van ravin-probings in reactie op de inductie van activiteitsafhankelijke synaptische plasticiteit. Na de ontwikkeling hiervan maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neuroplasticiteit om activiteitsafhankelijke synaptische plasticiteit te onderzoeken als een cellulaire modus van leren en geheugen in in vitro hippocampale plakjes van wild-type en transgene muizenlijnen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u acute plakpreparaties van de temporale hippocampus maakt en hoe u stabiele condities verkrijgt voor langdurige registratie van synaptische transmissies met behulp van een klein volume gerecyclede ACSF.

Vergeet niet dat het werken met dieren en chemische verbindingen gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een juiste desinfectie, tijdens het uitvoeren van deze procedure.