Name: 成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶ成人骨髄由来CD133+造血幹細胞の非ウイルス磁気ナノ粒子ベース転染法。miRNA導入により細胞特性を保持し再生医療への応用可能性を示す安全な細胞修飾プロトコルです。

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この仕事は、連邦教育省とドイツ研究 (FKZ 0312138A、FKZ 316159)、EU 構造基金 (ESF/IVWM-B34-0030/10 と ESF/IVBM-B35-0010/12) と状態 Mecklenburg 西部の Pomerania、DFG (DA1296/2-1) に支えられ、ドイツ心臓財団 (F/01/12)、(VIP + 00240) BMBF と湿気がある財団。さらに、f. H. と午後は、FORUN プログラムのロストック大学医療センター (889001) でサポートされます。

著者は利益相反を宣言しません。

近年では、CD133+ SCs 有望な細胞集団として登場した SC 基づかせていた療法のいくつかによって証明されるようフェーズ I、II、および III の臨床43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,<sup class="xref"...

CD133+ SCs は再生医療の可能性を有望な異種幹・前駆細胞の人口を表します。CD133 を有効に、造血、血管内皮、筋分化ポテンシャル1,2,3 +の細胞、例えば、差別化による血管新生のプロセスに貢献するには新しく成形容器とプロ新生パラクライン機構4,5,6,7シグナル伝達の活性化。
以上 30 承認された臨床試験 (ClinicalTrails.gov) に示す彼らの高可能性にもかかわらずその治療成績は物議を醸す議論4中です。確かに、SCs の臨床応用は、関心と大規模な初期細胞死5,8,9器官の低保持によって妨げられています。CD133 のエンジニア リング追加+ SCs 事前移植は、これらの課題を克服を助けることができます。
効率的な細胞療法のための 1 つの前提条件を治療関連細胞10の生着を強化する大規模な初期細胞死の減少となります。現在研究が最初 1-2 h、移植細胞型の独立の間に高い脳や心臓など臓器の 90-99% の巨大なセル損失を実証またはアプリケーション ルート11,12,13 、14,15,16,17,18,19,20,21。関心22,23,24,25,26 のサイトに標的細胞に革新的な非侵襲的戦略により、SC は、磁性ナノ粒子 (MNPs) を使用したラベリングと同時に携帯の MRI27と磁性粒子 (MPI) をイメージングを使用して監視できます。生体内で最も効率的な静脈注射23,24,28 後セル指導に優先してローカル投与後に使用されるセルの保持を対象と適用の磁化細胞を研究します。.したがって、私たちのグループには、超常磁性酸化鉄ナノ粒子の29から成る配信システムが設計されています。この手法では、CD133 で+ SCs とひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) をターゲット効率的に、体外30,31の試みによって示されるように。
SC 療法のもう一つのハードルは、影響を受ける組織の敵対的な炎症性環境を初期細胞死32に貢献、移植後です。いくつかの前処理研究に加えて治療関連 miRs のアプリケーションはテスト33;抗アポトーシス miRs体外アポトーシスを阻害させ、体内細胞の生着33正常に実証されています。20-25 のヌクレオチドの構成これらの小さい分子はメッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として重要な役割を果たすし、幹細胞の運命や行動34影響を及ぼします。また、miRs の外因性の導入は望ましくない安定したホストのゲノム34統合を避けてください。
プライマリ SCs に核酸 (NAs) の効率的な導入のため現在試行は組換えウイルス8,35に大抵基づいています。にもかかわらず高いトランスフェクション効率組換えウイルス操作提示ベンチ-ベッドサイド翻訳、例えば、手に負えない遺伝子発現、病原性、免疫原性、および挿入変異35 の主要な障害 ,36。したがって、ポリマー ベースの構成などの非ウイルスの伝達システムの開発にとって重要です。中でもポリエチレンイミン (PEI) は、miRs 細胞取り込みの劣化から保護するために NA 結露などのメリットを提供する有効な配信手段を表し、エンドソームを介して細胞内放出脱出37,38。さらに、ミール PEI 錯体は、臨床試験第39高い生体親和性を示した。したがって、当社の配信システムから成って、ビオチン標識ストレプトアビジン コーティング MNP コア30,31,40行きの分岐 25 kDa プリンスエド ワード島。
本稿では, (i) CD133 の手動分離を記述する包括的なプロトコルを提案する+ SC SC 製品および (ii) の効率的かつ穏やかなトランスフェクション戦略の詳細な特性解析とひと骨髄 (BM) 寄付金から、CD133 の遺伝子工学のための磁気的非ウイルス性ポリマー ベース配信システム+ SCs miRs を使用します。CD133+ SCs 隔離され、人間胸骨 BM 吸引、表面抗体を用いた磁気活性化細胞選別 (MAC) システムを使用して磁気濃縮しました。その後、細胞と細胞の純度によっては、フローサイトメトリー分析されます。ミール/プリンスエド ワード島/MNP 錯体の調製後、CD133+ SCs が transfected。トランスフェクション後 18 h、吸収効率とトランスフェクション SC マーカーの発現と細胞の生存率に与える影響を分析します。また、トランスフェクションの複雑な化合物の細胞内の分布の評価は、4 色ラベルと構造化照明顕微鏡を用いて (SIM) を使用して実行されます。

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid with Methylene Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (クローン: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (クローン: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>560178ローダミン染料;Atto 565 色素をビオチンに結合</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva ソフトウェア 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 抗体結合超常磁性鉄デキストラン粒子;CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>計数室</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3 色素標識前駆体 miR;Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 5 色素 miR ラベリングキット;Cy5色素 ラベル IT miRNA ラベリングキット</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>明るい緑色のタンパク質ラベリングキット;Oregon Green 488 Protein Labeling Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤;Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配遠心分離チューブ;ロイコセップ遠心分離管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACSマグネットホルダー;MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS事前分離フィルター</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 & micro;m</td></tr><tr><td>MACS分離カラム(MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS永久磁石;MACSセパ</td><td>レーターMiltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDFフィルター</td>メル<td>ク</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu;m</td></tr><tr><td>マウスIgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>アミン反応性色素;Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>ヒトリンパ球分離培地;Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>密度: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>CaおよびMg なし</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>分岐; 25 kDa</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>非標識前駆体 miR;Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 除染液;RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ヒトリンパ球培地;ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアム</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトサイトカインサプリメント。StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>無血清造血細胞増殖培地。StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere 常磁性粒子</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0.5 M; pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH超音波水浴</td><td>バンデリン電子</td><td></td><td>超音波公称出力:80 W;超音波周波数:35 kHz</td></tr></tbody></table>

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ rna の転送のためのプロトコル

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

一方、CD133+造血幹細胞 (SCs) は、再生医療の分野で高い可能性を提供するために証明されている、負傷者の組織として観察された大規模な細胞の死亡率への注入後、低定着率が非常につながる制限された治療効果。これらの制限を克服するために我々 は、投与前に適切な細胞工学のための非ウイルス性ベースのプロトコルを確立しようと思う。人間の CD133 の変更+吸収効率と安全性、細胞のターゲットの可能性に関して対処されたマイクロ Rna (ミール) 読み込まれた磁気 polyplexes を利用した SCs を表現します。我々 のプロトコルに依存している、CD133 80-90% の高いミール取り込み率を達成できる+幹細胞特性に影響はありません。さらに、これらの変更されたセルは、磁気ターゲットのオプションを提供しています。我々 は CD133 の修正のため安全かつ非常に効率的な手順をここに記述する+ SCs。幹細胞の治療効果の最適化および磁気共鳴画像 (MRI) を介して投与細胞製品のモニターの標準技術を提供するためにこのアプローチを見込んでいます。

提案するプロトコルは、手動分離とひと骨髄由来 CD133 の磁気濃縮について説明します+ SCs エンジニア リング戦略、体外細胞操作とのための非侵襲的技術としてその後ウイルス独立セルvivo監視ツール。
この 3 つのステップの分離技術は、密度勾配遠心法による事前消化胸骨 BM から多国籍企業の分離を許可しません。その後、CD133+細胞画分は適切な分離技術を使用して磁気濃縮することができます。これにより、CD133 の濃縮+ SCs 生存率とフローサイトメトリー (図 1) によって決定することができます 80% 以上の高純度。以下、要件に一致する SC 製品のみは、さらに実験に使用されました。
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このプロトコルは、CD133 を変更する安全で効率的な手順を示しています+造血幹細胞。提示された非ウイルス性、磁気 polyplex ベースのアプローチ治療幹細胞効果だけでなく磁気共鳴イメージ投射を介して投与細胞製品を監視の最適化のための基礎があります。

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

私たちのプロトコールは、細胞を有益な特性に改善できるかどうか、関心のある部位に標的を絞ることができるかどうかなど、再生医療の分野における重要な質問に答えることができます。私たちのプロトコルの主な利点は、細胞を非ウイルストランスフェクション法を使用して一過性に遺伝子操作できるため、細胞の特性を保持できるという事実です。Sauterの方法は、間葉系幹細胞など、移植に使用される他の細胞タイプに適用できる造血幹細胞の改変に関する洞察を提供することができます。プロトコールを開始するには、ヒトリンパ球を温め、中程度に室温で温め、コラゲナーゼBおよびDNaseを解凍します。骨髄(BM)を50ミリリットルの円錐管に集めます。既存の血栓はすべて廃棄します。その後のフローサイトメトリー解析のために、200マイクロリットルのBMサンプルを採取します。必要になるまで、サンプルを摂氏4度で保存します。次に、10ミリリットルのBMを新しい50ミリリットルの円錐管に移し、6ミリリットルのPBS EDTA、20ミリリットルのヒトリンパ球培地、175マイクロリットルのコラゲナーゼB、および175マイクロリットルのDNaseを追加します。溶液を穏やかに混合し、シェーカーで室温で30分間インキュベートします。50ミリリットルのチューブに15ミリリットルのヒトリンパ球分離培地を適用し、1, 000倍Gで30秒間遠心分離することにより、50ミリリットルの密度勾配遠心分離チューブをプライミングします。密度勾配遠心分離チューブフィルターの上に希釈したBM35ミリリットルを慎重に重ね、チューブをGの445倍で35分間遠心分離します。チューブを振らずに遠心分離機からそっと取り外します。フィルターの上の曇った層に直接触れることなく、上部クリア溶液から最大20ミリリットルを慎重に廃棄します。単核細胞(MNC)を含む曇った層を新しい50ミリリットルの円錐管に慎重に移し、PBS EDTAで最終容量50ミリリットルまで充填します。50ミリリットルの細胞懸濁液の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移すことにより、多国籍企業を数えます。メチレンブルーと3%酢酸を10マイクロリットル加えます。内容物を穏やかに混合し、計数室に10マイクロリットルを塗布します。多国籍企業の数を計算し、MNC懸濁液をGの300倍で10分間遠心分離します。上清を捨てます。1×10〜8番目の総セル数の磁気選択を準備するには、MNCを300マイクロリットルのMACSバッファーに慎重に再懸濁します。100マイクロリットルのFCRブロッキング試薬と100マイクロリットルのCD133抗体結合超常磁性鉄デキストラン粒子を添加します。次に、細胞懸濁液を穏やかに混合し、摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーション中に細胞懸濁液を2〜

protocol-for-microrna-transfer-into-adult-bone-marrow-derived

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

標的細胞送達は、さまざまな生物医学的応用に有用です。...

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必​​要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。...

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

このプロトコルでは、人間の歯小嚢から抽出された歯の幹細胞の一時的な遺伝子工学について説明します。適用の非ウイルス性変更戦略は治療幹細胞製品の改善のための基礎になることがあります。...

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我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

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疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

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生きたマウスを使用した簡略化された大腿内注射により、継続的な骨髄分析が可能

学ぶ成人骨髄由来CD133+造血幹細胞の非ウイルス磁気ナノ粒子ベース転染法。miRNA導入により細胞特性を保持し再生医療への応用可能性を示す安全な細胞修飾プロトコルです。

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

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