Name: Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer de isolatie van extracellulaire blaasjes uit murine bronchoalveolaire spoelvloeistof met ultrafiltratiecentrifugatie. Deze methode biedt hoge zuiverheid en schaalbaarheid voor kleine volumes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk wordt ondersteund door de NHLBI/NIH subsidies HL103868 (voor pct.) en HL137076 (tot pct.), de American Heart Association Grant-in-Aid (naar pct.) en de Samuel Oschin uitgebreide kanker instituut (SOCCI) Lung Cancer Research Award (naar pct.). Wij zouden graag onze grote waardering uitspreken voor de Smidt Heart Institute in het Cedars-Sinai Medical Center waarmee ons een Nanosight machine voor EV nanoparticle bijhouden van analyse.

Het gebruik van dieren en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC) bij het Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof (BALF) verzameling en voorbereiding
<ol><li>BALF collectie<ol>
<li>Euthanaseren muizen met een cocktail van ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) via de intraperitoneaal route gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
		<li>Plaats een 22 G-angiocatheter in de luchtpijp. Een insuline spuit 1 mL (mL) ijskoude steriele Dulbecco fosfaat buffer zoutoplossing (DPBS) met hechten en inboezemen 1 mL van DBPS in beide longen via de angiocatheter.</li>
		<li>Langzaam trekt de plunjer van de injectiespuit te halen BALF en afzien van de BALF in een conische buis van 50 mL. Houd de BALF op ijs.</li>
		<li>Herhaal stap 1.1.2 en 1.1.3 3 x (4 x in totaal in elke muis). Opmerking: Ongeveer 0,8 mL is over het algemeen herstellen per milliliter van instillation. Ook de volgende stappen kunnen worden uitgevoerd voor individuele muizen (dat wil zeggen, 3 mL BALF), maar de isolatie van een grotere partij van EVs voor consistentie in downstream experimenten bundeling van meerdere BALF monsters zal toestaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BALF voorbereiding<ol>
<li>BALF zwembad van 25 muizen en verdeel het in twee gelijke sets (~ 35 mL per hoeveelheid).</li>
		<li>Centrifugeer het BALF bij 400 x g, bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijderen van cellen en andere cellulaire puin te verzamelen van de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatant bij 1.500 x g, bij 4 ° C gedurende 10 min, schakel cel puin. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en gaat u verder met de stappen van de isolatie EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof
Opmerking: In deze studie, twee EV isolatie technieken, namelijk UFC en ultracentrifugatie met uitbundige gebruikt om te isoleren van de EVs van BALF. Het gedetailleerd protocol van elke methode vindt u hieronder.
<ol><li>
Ultrafiltratie centrifugeren (UFC) verrijking methode Opmerking: Deze methode werd gewijzigd van een eerder beschreven protocol10.<ol>
<li>De bovendrijvende vloeistof uit stap 1.2.3 door een 0,2 micrometer steriele injectiespuit filter filteren en houden de gefilterde BALF op ijs. Nota: Dit is een stap grootte uitsluiting waarbij alleen de blaasjes die kleiner is dan 200 nm worden verzameld.</li>
		<li>Equilibreer de 100 kDa MWCO centrifugaal filter unit met steriele DPBS voor 10 min. Centrifuge de centrifugaal eenheid bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C als u wilt verwijderen van de DPBS. Let op: Zodra het membraan in de filter-apparaat wordt geëquilibreerd met DPBS, het membraan moet worden gehouden natte te allen tijde totdat het apparaat wordt gebruikt.</li>
		<li>Vul de filter eenheid met 15 mL BALF monster uit stap 2.1.1 en centrifuge op 3000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. De doorstroming BALF kan worden weggegooid of verzameld in een aparte canonieke buis en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
		<li>Herhaal stap 2.1.3 voor de resterende 0,2 µm-gefilterd BALF. Opmerking: Het duurde drie herhalingen van centrifugations voldoende concentreren de EVs BALF van het oorspronkelijke uitgangspunt volume van 35 mL. Dit resulteerde in 1-1.5 mL retentate.</li>
		<li>De retentate met 14 mL steriele DPBS door een zacht pipetteren herhaaldelijk wassen. Centrifugeer de filter-unit 3000 x g bij 4 ° C gedurende 30 minuten, te verwijderen van de DPBS en te concentreren van de EV-retentate.</li>
		<li>De geconcentreerde BALF afkomstige EVs ophalen door het filter apparaat door het invoegen van een pipet in de onderzijde van het apparaat van de filter of de intrekking van het monster met behulp van een side-to-side ingrijpende motie om ervoor te zorgen volledige terugvordering.</li>
		<li>Aliquot de EVs BALF-afgeleide en bewaar ze bij-80 ° C voor verdere kwantificering van de deeltjes en karakterisering (zie stap 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ultracentrifugatie (UC) met uitbundige dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC) Opmerking: Het volgende protocol werd gewijzigd van de eerder beschreven protocol24.<ol>
<li>Het supernatant van stap 2.1.1 overboeken naar een buis 37 mL ultracentrifuge samen en Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C met behulp van de ultracentrifuge. De bovendrijvende vloeistof en centrifuge bij 100.000 x g, bij 4 ° C gedurende 60 minuten te verzamelen. Terwijl de EV-pellets worden gecentrifugeerd, voorbereiden op verschillende concentraties van uitbundige dichtheid kleurovergang buffers (tabel 1) stap 2.2.3.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de EV-pellets in 200 μL van DPBS.</li>
		<li>Meng de EV schorsing met 300 μL van 50% iodixanol werkoplossing (tabel 1) en het overbrengen van de ultracentrifuge tube van 15 mL. Op de top van de 50% iodixanol-EV mengsel schorsing, laag achtereenvolgens de volgende bufferoplossing in de volgorde van de bodem naar de top: 30% iodixanol (4.5 mL), 25% van de iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2,5 mL) en 5% iodixanol (6 mL). Centrifugeer bij 100.000 x g, bij 4 ° C voor 230 min. Opmerking: Het verloop van de uitbundige dichtheid is gebaseerd op het percentage van iodixanol schalen met de hoogste concentratie (50%) aan de onderkant bij de laagste concentratie (5%) aan de bovenkant. Voor het genereren van verschillende concentraties van iodixanol, werden verschillende hoeveelheden van homogenisering medium (tabel 1) gemengd met werkoplossing (50% iodixanol).</li>
		<li>Verzamelen van de 15% en 25% breuk en vul ze in steriele DPBS om het volume tot 15 mL. Overbrengen naar een nieuwe kleine ultracentrifuge buis en centrifuge bij 100.000 x g, bij 4 ° C gedurende 60 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de EV-pellets in 50 μl van steriele DPBS voor verdere karakterisering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de extracellulaire vesikel kwantificering
Opmerking: De EVs BALF afkomstige herstel opbrengst is quantitated met twee statistieken.
<ol><li>Nanoparticle tracking analyse (NTA) meting<ol>
<li>Verdun het EV monster bij 1:200-1:500 in DPBS en belasting van het monster af in een insuline spuit 1 mL. Een monster spuit hechten aan een spuitpomp en beginnen de deeltje nummers en grootte (Zie Tabel van materialen) te meten.</li>
		<li>Vastgesteldop de camera recht op 14 en de detectie drempel 1 voor alle monster metingen. Vijf herhaalde metingen met 1.500 frames in 30 s werden opgenomen voor elk monster, met een vertraging van 20 s tussen leest. Combineer en gemiddelde van de gegevens voor de eindconcentratie en grootte rapporten. Opmerking: Voor het nauwkeurig vastleggen van alle deeltjes, pas het niveau van de camera zo nodig om te visualiseren van alle deeltjes en soortgelijke instellingen gebruiken voor alle monster metingen in elk experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eiwit kwantificering Opmerking: De bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling werd gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie van het EVW BALF-afgeleide.<ol>
<li>Solubilize de EV monsters in 1 x lysis-buffermengsel.</li>
		<li>Kwantificeren van de hoeveelheid eiwit in de EVs BALF afkomstige per BCA standaardprotocol colorimetrische detectie met door het meten van de absorptie bij 560 nm in een afleesapparaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. detectie van extracellulaire blaasjes BALF-afgeleide
Opmerking: Algemeen bekende exosome oppervlakte marker eiwitten (TSG101, CD63, CD81 en CD9) werden gebruikt om te controleren of EV terugvorderingen van SDS-pagina en immunoblotting en stroom cytometry analyse.
<ol><li>SDS-pagina en immunoblotting<ol>
<li>Los een gelijke hoeveelheid van EV eiwitten van elk monster met een bevlekken laden 50 mM dithiothreitol (DTT) in een 1.6 mL tube en een buffer (lithium dodecyl sulfaat). Verwarm de monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>De monsters van stap 4.1.1 in een 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel laden en uitvoeren van elektroforese (150 volt, 35 mA) voor 35 min.</li>
		<li>Eiwitten overbrengen in een membraan van de nitrocellulose met een droge overdrachtmethode.</li>
		<li>Het blokkeren van het membraan met 5% magere melk voor 60 min, rocken bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Incubeer het membraan met een antilichaam aan een EV oppervlakte-proteïne marker, Gene 101 (TSG101), van de gevoeligheid van de Tumor bij 1:500 verdunning in 5% BSA in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween-20 (TBST) bij 4 ° C, 's nachts schommelen.</li>
		<li>De volgende dag was het membraan 3 x, 10 minuten elk, in buffer TBST wassen en Incubeer het met anti-konijn IgG, een HRP-linked antilichaam, bij 1:5,000 verdunning gedurende 60 minuten op RT.</li>
		<li>Wassen van het membraan 3 x, 10 minuten elk, in de buffer TBST wassen. Het ontwikkelen van het membraan met chemiluminescentie HRP antistof detectie reagens en beeld (Zie Tabel van materialen voor imaging systeem).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stroom cytometry<ol>
<li>Verdun BALF afkomstige EVs in 49 μL van PEB kleuring buffer (PBS + 5 mM EDTA 0.5% BSA, gefilterd door een membraan van 0,1 μm spuit filter).</li>
		<li>Toevoegen van elk van de volgende antistoffen in elk afzonderlijke monster: 1) rat anti-muis PE CD63 antilichaam (100 ng per reactie); 2) rat-antimuis PE CD81 (500 ng); 3) rat-antimuis FITC-CD9 (200 ng). Incubeer bij 4 ° C, schommelen gedurende 60 min. in het donker.</li>
		<li>Verdun de monsters met 450 μL van membraan gefiltreerd PEB kleuring buffer en de monsters aan stroom cytometry analyse onderworpen (Zie Tabel van materialen)25.</li>
		<li>Aanpassen van de stroom cytometer-instellingen als volgt: 1) alle kanalen instellen op hyper log (hlog); 2) vastgesteldop de trigger op WS 4; 3) uitschakelen van de secundaire trigger. De monsters worden uitgevoerd in een omgeving met lage snelheid en het verwerven van ten minste 10.000 gebeurtenissen in elk monster.</li>
		<li>Lage cytometry gegevensanalyses uitvoeren in elk monster met behulp van analysesoftware (Zie Tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Secretion%2C+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li>
<li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://tcr.amegroups.com/article/view/16316/html">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li>
<li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+systems+for+exosome+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Exosome-Based+Therapeutics%3A+Isolation%2C+Heterogeneity%2C+and+Fit-for-Purpose+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
<li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).</li>
<li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium%3A+a+possible+role+in+innate+defense%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li>
<li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li>
<li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).</li>
<li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li>
<li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).</li>
<li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li>
<li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li>
<li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+it+out%3A+Regulation+of+exosome+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exosome+Total+Isolation+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li>
<li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li>
<li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).</li>
<li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de afgelopen decennia, hebben de wetenschappers de betekenissen van het EVW in cellulaire homeostase ontrafeld. Nog belangrijker, spelen EVs een grote rol in vele ziekteprocessen door modulerende ver en naburige cellen via hun bioactieve lading moleculen1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,</sup...

Exosomes zijn de kleinste deelverzameling van het EVW, 50-200 nm in diameter, en meerdere biologische functies overal een veelzijdige signalering processen1,2,3,4,5. Ze regelen cellulaire en weefsel homeostase voornamelijk doordat intercellulaire communicatie via lading moleculen zoals lipiden, eiwitten en nucleïnezuren6,7,8,9 . Een kritieke stap in EV-onderzoek is het proces van isolement. Differentiële ultracentrifugatie (UC), met of zonder dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC), wordt beschouwd als de gouden standaard aanpak, maar deze methode draagt grote beperkingen, met inbegrip van inefficiënte EV herstel tarieven en lage schaalbaarheid10 , 11 , 12, beperken die het beste gebruik te groter volume monsters, zoals cel cultuur bezinken of hoge exosome productie exemplaren. De voor- en nadelen van andere methoden, zoals grootte uitsluiting door ultrafiltratie of chromatografie, immunoaffinity isolatie door kralen of meer sorteerkolommen en microfluidics, worden goed beschreven, en moderne aanvullende procedures zijn ontwikkeld om overwinnen en technische beperkingen in elke aanpak11,12,13,14,15te minimaliseren. Anderen hebben aangetoond dat een ultrafiltratie centrifugeren (UFC) met een nanoporeuze membraan in de filter-eenheid is een alternatieve techniek waarmee vergelijkbare zuiverheid een UC methode16,17,18. Deze techniek kan worden beschouwd als een van de methoden van alternatieve isolatie.
Bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) bevat EVs die talrijke biologische functies in verschillende luchtwegen19,20,21,22 bezitten. Studeren BALF afkomstige EVs houdt sommige uitdagingen als gevolg van de invasiviteit van de bronchoscopie procedure bij de mens, alsmede een beperkte hoeveelheid lavage vloeistof herstel. In kleine laboratoriumdieren zoals muizen, alleen een paar milliliter in normale longaandoeningen kunnen worden hersteld, zelfs minder in longen ontstoken of fibrotische23. Bijgevolg, het verzamelen van een voldoende hoeveelheid BALF voor EV isolatie door een differentiële ultracentrifugatie voor downstream toepassingen kan niet haalbaar. Isoleren van juiste EV populaties is echter een cruciale factor voor het bestuderen van de biologische functies van de EV. Het delicate evenwicht tussen efficiëntie en werkzaamheid blijft een uitdaging in gevestigde EV isolatie methoden.
In deze huidige studie, wij laten zien dat een centrifugaal ultrafiltratie benadering, met gebruikmaking van een 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) nanomembrane filter unit, geschikt voor kleine hoeveelheden biologische specimen zoals BALF. Deze techniek is eenvoudig, efficiënt en biedt hoge zuiverheid en schaalbaarheid ter ondersteuning van de studie van het EVW BALF-afgeleide.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>EMD8550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International, Prospect, IL</td><td>75277-39-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>MKCD9753</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>VetOne, Boise, ID</td><td>13985-702-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 1 mL</td><td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter 20 G</td><td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td><td>381703</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen 50 mL</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td><td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-muis TSG101 Antilichaam</td><td>AbCam, Cambridge, MA</td><td>AB125011</td><td></td></tr><tr><td>Ratten anti-muis PE-CD63 Antilichaam</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td>143904</td><td></td></tr><tr><td>CD81</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Reducing agent (Bolt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Lysis buffer (Bolt)</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>NW04120</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>IB23002</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescerend HRP-antilichaam detectie reagens HyGLO</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA</td><td>E2400</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen 17 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen 38,5 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Corning SFCA Spuitfilters 0,2 &micro;m porie</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>09-754-13</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Duitsland</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight (NS300)</td><td>Malvern, Worcestershire, VK</td><td>-</td><td>Om de deeltjesgrootteverdeling en deeltjesconcentratie te meten</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Apparaat</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v. 10</td><td></td><td></td><td>Analysesoftware</td></tr></tbody></table>

isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn pas ontdekte subcellular componenten die spelen een belangrijke rol in vele biologische functies signalering tijdens fysiologische en pathologische staten. Het isolement van het EVW blijft een grote uitdaging op dit gebied, als gevolg van beperkingen die inherent is aan iedere techniek. De differentiële ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren methode is een veel gebruikte aanpak en wordt beschouwd als de gouden standaard procedure voor EV isolatie. Deze procedure is echter tijdrovend, arbeidsintensief, en over het algemeen resulteert in lage schaalbaarheid, die mogelijk niet geschikt voor kleine aantallen monsters zoals bronchoalveolar lavage vloeistof. We laten zien dat een ultrafiltratie centrifugeren isolatie methode eenvoudig is en tijd en arbeid-energiezuinige nog een hoge herstel opbrengst en zuiverheid biedt. Wij stellen voor dat deze isolatie-methode kan een alternatieve benadering die geschikt is voor EV isolatie, met name voor kleine hoeveelheden biologische specimens.

We EV isolatie van muis BALF uitgevoerd met behulp van de UFC en UC-DGC isolatie-methoden op dezelfde dag. De UFC-methode vereist ongeveer 2,5-3 h, overwegende dat de UC-DGC techniek 8 h verwerkingstijd vereist. Worden hier niet meegerekend buffers en reagens voorbereidingstijd. Opgemerkt moet worden dat bepaalde andere taken kunnen worden uitgevoerd tijdens de perioden van de lange centrifugeren. Echter duurde de gehele procedure bijna een hele dag voor de UC-DGC isolatie-techniek.
<...

Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van vragen met betrekking tot de efficiëntie, herstelopbrengst en zuiverheid van bronchoalveolaire lavage vloeistof afgeleid extracellulaire vesicles met behulp van een ultrafiltratie centrifugatie benadering. We hebben deze techniek direct vergeleken met een ultracentrifugatie- en dichtheidgradiënt zuiveringstechniek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, efficiënt en geschikt is voor kleine volumemonsters zoals murine bronchoalveolaire lavage vloeistof.Wat nog belangrijker is, het biedt een hoge zuiverheid en aanzienlijk hogere schaalbaarheid in vergelijking met een ultracentrifugatie-isolatiemethode. Het aantonen van de procedure zal mr. Norman Garrett III zijn, onderzoeksmedewerker voor mijn laboratorium. Om te beginnen plaatst u een angiocatheter van 22 meter in de luchtpijp van een geëuthanaseerde muis.Bevestig een insulinespuit met een milliliter ijskoud steriele DPBS, en inboezemen een milliliter in beide van de longen. Trek langzaam de spuitzuiger terug om bronchoalveolar lavage vloeistof, of BAL vloeistof op te halen. En doseer de BAL-vloeistof in een conische buis op ijs.Trek hierna BAL-vloeistof uit 25 muizen en verdeel het in twee gelijke sets. Centrifuge de BAL vloeistof op 400 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en centrifuge het op 15.000 keer G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verzamel vervolgens de supernatant en ga onmiddellijk naar de EV isolatiestappen. Filtreer eerst de supernatant door een 0,2 micrometer steriel spuitfilter. Daarna moet u de centrifugaalfiltereenheid gedurende 10 minuten met steriele DPBS in evenwicht brengen.Dan centrifugeren de centrifugaal eenheid op 15.000 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Vul het filter met 15 milliliter BAL-vloeistof. En centrifugeren het op 3.000 G's gedurende 30 minuten op vier graden Celsius.Daarna was je het retentaat met 14 milliliter steriele DPBS door herhaaldelijk voorzichtig te pipetten. Verheerlijk de filtereenheid op 3,000 G's bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten om de DPBS te verwijderen en het retentaat te concentreren. Om de geconcentreerde BAL vloeistof afgeleide EV's te verzamelen, steek je een pipetter in de bodem van de filterunit en trek je het monster terug met behulp van een veegbeweging van links naar rechts.Dan aliquot de BAL vloeistof afgeleide EV's en bewaar ze op min 80 graden Celsius. U ook beginnen met het overbrengen van de vorige verworven supernatant naar een ultracentrifuge buis. En centrifugeren het op 10.000 G's gedurende 30 minuten op vier graden Celsius.Verzamel dan de supernatant en centrifuge. Gooi de supernatant weg en hang de EV-pellet opnieuw op in 200 microliters van DPBS. Meng hierna de EV-vering met 300 microliters van 50%iodixanol werkoplossing.En breng het over op een 15 milliliter ultracentrifugebuis. Voeg vervolgens bufferoplossing toe volgens het tekstprotocol om een verloop van een dichtheidsgradiënt te maken en deze gedurende drie uur en 50 minuten te centrifugeren bij 100, 000 G's. Verzamel de 15% en de 25%iodixanol fracties, en verdun ze in DPBS om het volume te brengen tot 15 milliliter.Breng de fracties over op een nieuwe ultracentrifugebuis en centrifuge bij 100.000 G's bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten. Gooi de supernatant weg en hang de EV-pellets opnieuw op in 50 microliter van steriel DPBS. Om te beginnen nano deeltjes tracking analyse, verdun het EV monster in een milliliter van DPBS.En laad het monster in een insulinespuit. Bevestig hierna de spuit aan een spuitpomp en meet de deeltjesnummers en -grootte. Stel het cameraniveau in op 14 en de detectiedrempel op één.Gebruik vervolgens een plaatlezer om de hoeveelheid eiwit in het EV-monster te kwantificeren via colorimetrische detectie. Los een gelijke hoeveelheid EV-eiwit uit elk monster op met een blotting-laadbuffer en DTT. Verwarm vervolgens de monsters op 70 graden Celsius gedurende 10 minuten.Laad de monsters in een Bis-Tris Plus acrylamide gel en voer elektroforese gedurende 35 minuten. Breng de eiwitten vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan met behulp van een droge overdrachtsmethode. Daarna, blokkeer het membraan met vijf procent magere melk gedurende 60 minuten met zachte schommelen.Incubeer het membraan met een antilichaam aan een EV oppervlakte eiwitmarkering bij vier graden celsius met zacht schommelen 's nachts. Ontwikkel het membraan door het membraan 60 minuten lang uit te broeden met HRP-verbindingsantilichaam bij kamertemperatuur. Was het membraan 10 minuten met tbst-buffer drie keer.Ten slotte, ontwikkel het membraan met chemiluminescent HRP-antilichaamdetectiereagens voordat u overgaat tot beeldvorming. Om te beginnen met de stroom cytometrie, verdun bal vloeistof afgeleide EV's in 49 microliters van PEB kleuring buffer. Voeg vervolgens drie antilichamen toe aan elk van de monsters, voordat u de monsters bij vier graden Celsius uitbroedt met 60 minuten schommelen in het donker.Ten slotte verdun de monsters met 40 microliters membraan gefilterde PEB-kleuringsbuffer en voer de stromingscytometrieanalyse uit. In dit protocol werden EV's geïsoleerd van muis BAL vloeistof met behulp van een UFC en UC-DGC methoden. BAL vloeistof afgeleid EV's van normale muizen geïsoleerd door de UFC methode weergegeven kleinere maten en meer uniforme grootte distributie dan de UC-DGC-EV's.De UFC-techniek had ook aanzienlijk hogere totale deeltjestellingen in vergelijking met de UC-DGC-techniek. De totale eiwitterugwinning gemeten in milligram van de UFC-EV's was ook hoger dan die van de UC-DGC-EV's, wat aangeeft dat de UFC-techniek meer tijd en moeite efficiënt is. Ten slotte werden de BAL vloeistof afgeleide EV's ook verder gekenmerkt via flow cytometrie.De UFC-EV's en UC-DGC-EV's hebben beide cd63, CD9 en CD81 uitgedrukt. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de ultrafiltratie-eenheid membraan rehydrateren met DPBS. Zodra het membraan gehydrateerd is, moet het apparaat te allen tijde nat worden gehouden totdat het wordt gebruikt.Het ophalen van extracellulaire vesicle retentate uit de filterunit kan een uitdaging zijn. Zorg ervoor dat de pipettepunt van links naar rechts wordt geveegd om de meeste EV's uit de filterunit te halen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van extracellulaire blaasisolatie om de biologische functies van bronchoalveolaire lavage afgeleide extracellulaire blaasjes te verkennen in zowel normale als pathologische omstandigheden bij kleine dieren.

isolation-extracellular-vesicles-from-murine-bronchoalveolar-lavage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Watson, D. C., et.al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the isolation and concentration of extracellular vesicles (EVs) derived from the outer membrane of genetically engineered bacteria. The process involves culturing the bacteria to release EVs, followed by sequential centrifugation and filtration steps to remove cells and debris. Finally, ultrafiltration is used to...

Isolation and Enrichment of Outer Membrane-Derived Extracellular Vesicles from Bacteria

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.

Een eenvoudige benchtop-filtratiemethode om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van menselijke mesenchymale stamcellen

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).

Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers

Dit protocol is ontworpen om de effectieve isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijke moedermelk met hoge zuiverheid te versnellen en mogelijk te maken.

Snelle isolatie van extracellulaire blaasjes afkomstig van menselijke moedermelk

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Leer de isolatie van extracellulaire blaasjes uit murine bronchoalveolaire spoelvloeistof met ultrafiltratiecentrifugatie. Deze methode biedt hoge zuiverheid en schaalbaarheid voor kleine volumes.

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren (Video) | JoVE Journal

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Meer video's verkennen