Name: 緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶPseudomonas aeruginosaの遺伝子欠失変異体生成とマウス感染モデルによる毒性評価法。この再現性の高いプロトコルは細菌の病原性メカニズム解明に有用です。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R44GM113545およびP20GM103434によって支えられた。

<ol><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li>
<li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li>
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<li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+%28sigmaE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li>
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<li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58(2013).</li>
<li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17(2009).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li>
<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
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<li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells%3A+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209(2010).</li>
<li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria%3A+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li>
<li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li>
<li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li>
<li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+and+prospects+of+microbial+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li>
</ol>

著者のホンウェイ・D・ユーは、創世記テクノロジーズ合同会社の最高科学責任者兼共同創設者です。

pEX100T-Not1プラスミドは、マーカーフリーでフレーム内の逐次ゲノム欠失の効率的なメディエーターです。減衰した毒性に対する細菌株を工学的に行う場合、点突然変異を発生させるのではなく、遺伝子配列全体を欠失すると、毒性表現型への復帰の可能性が減少する。さらに、各病原性遺伝子欠失は、さらに病原体を減衰させ、減衰の安定性を強化する。
この方法は、プラスミド挿入物の設計を改変するだけで、点突然変異や挿入などの欠失以外のゲノム修飾を生成するためにも使用できる。これらのタイプの修飾は、例えば、改変代謝を有する細菌を工学するための遺伝子欠失全体よりも有用である可能性がある。逐次ゲノム修飾は、研究および産業における特定の目的に合わせてデザイナー細菌株を生成する大きな可能性を有する。細菌における所望のマーカーフリーゲノム修飾を生成する他の方法は、15、16、17、18に記載されている。<...

緑膿菌は、ヒト、特に免疫不全において生命を脅かす疾患を引き起こす可能性のある日和見細菌病原体である。P.エルギノーサの病原性は、プロテアーゼおよびリポ多糖を含む多くの毒性因子の発現、ならびに保護バイオフィルム1を形成する能力に起因する。病原性因子を産生し、ヒトに疾患を引き起こす能力のために、P.アルギノーサを使用して市販品を安全上の懸念を提示する。大腸菌の非病原性株は、伝統的に人間の使用のためのバイオエンジニアリング医療および商業製品に使用されてきました。しかし、大腸菌が作るのが難しい製品もあれば、封入体に包装されている製品も多く、抽出に手間がかかるものもあります。特定の製品を作り、分泌する能力を持つ操作された細菌株は、分泌が収率を増加させ、精製プロセスを容易にする可能性が高いので、非常に望ましいです。したがって、細菌の他の種の非病原性株(例えば、より多くの分泌経路を利用する種)は、大腸菌に有用な代替手段を提供し得る。我々は最近、生物の病原性及び毒性が高く減衰するP.アルギノーサ、PGN5の株の開発を報告した2.重要なことに、この株はまだ多糖アルギン酸塩を大量に生成し、P.エルギノーサバイオフィルムの商業的に興味深い成分である。
PGN5株は、pEX100T-NotIプラスミドとの2段階のアレル交換手順を用いて生成され、生物の病原性に寄与することが知られている5つの遺伝子(toxA、plcH、phzM、wapR、aroA)を順次削除した。 pEX100T-NotIは、ハーバート・シュバイツァーの研究室3、4で開発されたプラスミドpEX100Tの多重クローニング部位内のNotI制限酵素認識部位にSmaIを変更することによって生成された。制限酵素NotIの認識部位は、SmaIに比べて稀なDNA配列であり、クローン化される配列中に存在する可能性が低いため、クローニングの目的でより便利である。プラスミドは、β-ラクタマーゼをコードし、カルベニシリンに対する耐性を付与するブラ遺伝子や、スクロースに対する感受性を付与するB.サチリサッカB遺伝子を含む、選択を可能にする遺伝子を運ぶ(図1A)。プラスミドはまた、大腸菌と互換性のある複製(ori)の起源、および結合を介して大腸菌からシュードモナス種へのプラスミド移動を可能にする転写(oriT)の起源を運ぶ。しかし、プラスミドはシュードモナスと互換性のある複製の起源を欠いているため、シュードモナス種内で複製することはできません(すなわち、シュードモナス自殺ベクターです)。これらの特性は、シュードモナス染色体からの遺伝的欠失を標的とするのにpEX100T-NotIを理想的にする。プラスミドクローニング工程は大腸菌を用いて行われ、得られたプラスミドは形質転換または結合によってシュードモナスに移される。そして、相同組換えイベントおよび選択的ステップを介して、標的化されたフレーム内欠失が生成され、マーカーフリーである。P.アルギノーサの染色体からゲノム領域を順次削除するこの方法は、PGN5のような高度に減衰したシュードモナス株を生成するために、または他の特定の用途のための株を設計するために使用することができる(例えば、プラスミド伝播のためのエンドヌクレアーゼの株欠乏またはプロテアーゼの株欠乏)。
細菌株の全体的な毒性は、突然変異が頻繁に起こる増殖条件および相の影響を受ける。したがって、遺伝子組み換え株の安全性を測定することは困難な場合があります。全身性毒性に対する細菌分離株を評価するために、C57BL/6マウス5の腹腔内注射による感染の以前に公表されたプロトコルを適応させた。注射に冷凍細菌ストックを使用するようにこの手順を変更し、正確な検査と使用する株の簡単な検証を可能にしました。このモデルでは、バイオ医薬品の製造に対してFDA承認されている大腸菌株BL21を、株6、7、8の相対病因を決定するための制御安全基準として用いた。この方法を使用する主な利点は、感染株が感染の前後の両方の細菌細胞数、表現型、および遺伝マーカーについて検証されるため、再現性があり、変動の原因を最小限に抑えるということです。これらの制御されたステップによって、必要な動物の数は減少する。このモデルでは、P.アルギノーサ株は、腹腔内注射時にC57BL/6マウス死亡率が大腸菌BL21以下をもたらすと考えられ得る。この単純なマウスモデルの感染は、FDA承認大腸菌株を基準として、他の種由来の遺伝子操作株の減衰病原性を評価するためにも使用され得る。ステップ1~7は、P.アルギノーサにおける逐次ゲノム欠失の生成を詳細に説明し(図1)、ステップ8~12は、P.アルギノーサ株の病原性を試験するためのマウスモデルの使用について詳述する。

<table><tbody><tr><td>フラットキャップ付き0.2 mL</td>チューブ <td>ThermoScientific</td><td>AB-0620</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>22-253-260</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1.5 mL 使い捨てポリスチレンキュベット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 極低温バイアル</td><td>コーニング</td><td>フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td></tr>経由の<tr><td>430659 27Gニードル</td><td>BD</td><td>14-821-13B</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td></tr>ック<tr><td>50mLチューブ経由</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-539-13</td><td></td></tr>経由 <tr><td>アキュブロック デジタルドライバス</td><td>ラブネット</td><td>NC0205808</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機5804R</td><td>エッペンドルフ</td><td>経由 04-987-372</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr>経由<td>卓上型微量遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>キャビネット インキュベーター</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン二ナトリウム塩</td><td>フィッシャーサイエン</td>ティフィック <td>BP2648250</td><td></td></tr><tr><td>培養試験管、ポリスチレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-956-6D</td><td>via フィッシャーサイエンティ</td></tr>フィック <tr><td>ディポーザブル接種ループ</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td><td>ック22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>12224-50</td><td>または推奨方法/ベンダー</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td><td>Omega bio-tek</td><td>D6493-01</td><td>または推奨方法/ベンダー</td></tr><tr><td>EcoRI-HF、制限 endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>ブルドッグ バイオ</td><td>NC0492929</td><td>via FisherScientific</td></tr><tr><td>FastLink II DNAライゲーションキット</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7833</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane</td><td>Henry Scheinアニマルヘルス</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td><td>パーキンスとエルマー</td><td>CLS136340</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン一硫酸塩</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LE アガロース</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>via フィッシャーサイエンティフィ</td></tr>ック <tr><td>ルリアブロス</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>via フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>マイクロパルサーエレクトロポレーター</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar, ultrapure</td><td>Affymetris/USB</td><td>AAJ10907A1</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>NotI-HF, restriction endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404052</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline powder</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td></tr><tr><td>Pseudomonas isolation</td><td>agar Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas isolationブロス</td><td>アルファ バイオサイエンス</td><td>P16-115</td><td>カスタムメイド バッチ</td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップ キット (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>または優先方法/ベンダー</td></tr><tr><td>振とうインキュベーター</td><td>ニューブランズウィック サイ</td>クタイエント <td>イノーバ 4080</td><td>200 rpm</td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマル サイクラー</td><td>アプライド バイオシステム</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>スキム ミルク</td><td>ディフコ</td><td>DF0032-17-3</td><td>経由フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>スモールプレート (外径 100 x 10 mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 分光光度計</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>または推奨メソッド/ベンダー</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>つまようじ、丸</td><td>型 ダイヤモンド</td><td></td> つ<td>まようじの任意のブランド、オートクレーブ済み</td></tr><tr><td>TOPO TA クローニングキット、シーケンシング用</td><td>Invitrogen</td><td>45-0030</td><td></td></tr><tr><td>XAF-8 麻酔システムフィルター</td><td>パーキンス&エルマー</td><td>118999</td><td></td></tr><tr><td>XGI 8 ガス麻酔システム</td><td>キャリパー ライフサイエンス/Xenogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

微生物は遺伝的に汎用性が高く多様であり、多くの市販品やバイオ医薬品の主要な供給源となっています。これらの製品のいくつかは、生物によって自然に生産されますが、他の製品は、生産の収量を増加させるために生物の遺伝子工学を必要とします。大腸菌のアビドロン酸株は、伝統的にバイオ医薬品を生産するための好ましい細菌種であった;しかし、大腸菌が生産しにくい製品もある。したがって、他の細菌種のアビトリュント株は、いくつかの市販品の生産に有用な代替手段を提供することができる。緑膿菌は、大腸菌に代わる適切な代替を提供できる一般的でよく研究されたグラム陰性細菌である。しかしながら、P.アルギノーサは日和見ヒト病原体である。ここでは、pEX100T-NotIプラスミドを用いた逐次ゲノム欠失を介してP.アルギノーサの非病原性株を生成するために使用できる手順を詳述する。この方法の主な利点は、マーカーフリー株を生成することです。この方法は、市販品の製造のための高度に減衰したP.アルギノーサ株を生成するために、または他の特定の用途のための株を設計するために使用され得る。我々はまた、大腸菌のFDA承認BL21株と比較して遺伝子操作された株の減衰をテストするために検証された試験株の腹腔内注射を介して細菌全身感染の単純かつ再現可能なマウスモデルを記述する。

図2に示すように、標的ゲノム欠失は、目的領域を増幅する特定のプライマーを有するコロニーPCRを用いて確認することができる。ゲノム欠失を伴うコロニーは、野生型コロニーに比べてPCRバンドサイズが短くなります。10-12コロニーのPCRスクリーンは、通常、標的欠失を運ぶ少なくとも1つのコロニーを検出するのに十分である。画面の複数のラウンド後に削除が検出されない場合は、コンジュゲーションから手順を繰り返します。それでも削除が失敗する場合は、プラスミド挿入物をシーケンシング、再設計、または削除が致死的であることを確認する必要があります。PCRを介した遺伝子欠失の検証に際して、シーケンシングによる欠失を確認する。得られた株は、逐次ゲノム修飾を生成する手順を繰り返し行って行われ得る。
図3に示すように、P.アルギノーサPGN5(...

ここでは、市販品に対する米国食品医薬品局(FDA)承認の大腸菌と比較して、緑膿菌の遺伝子組み換え株の減衰を評価する感染のマウスモデルの簡単かつ再現性の高いプロトコルについて説明する。

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

このプロトコルは、緑膿菌のゲノムに望ましい心体の変異を作成および決定し、また、再現可能なマウスモデルにおける病原性低下に対する突然変異の効果を試験する上で重要である。この手法の主な利点は、クロムの検証とマウス感染モデルの再現性です。細菌は絶えず働き続け、絶えず変化しています。このプロセスを遅くするには、フリーズされたストップを使用し、それらを袋に入れ、マウスモデルでテストする前に、変更時に複数のラングに掛けます。これらの方法に精通していない人は、おそらくテストするために可能なクロスオーバー組換えの開発と選択に苦労するでしょう。さらに、動物の仕事に慣れていない人にとっては、感染のためのマウスの取り扱いが難しくなります。この方法は、他の病原体とその変異体の検査に適用できるだけでなく、マウスの毒性感染も可能である。現在のモデルと比較して、再現性と感染前後のクローン検証を伴う手順は、現場の他の研究者に利益をもたらす可能性があります。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、読み取りだけでは理解または理解することが困難な広範な手順に関する洞察を提供します。シュードモナスアイソレーションブロス、またはPIBで単一のクロスオーバー、組換えコロニーを成長させることから始めます。各培養物の10マイクロリットルを事前に温めたPIAプレートに接種し、10%スクロースを加える。その後、37°Cで一晩プレートをインキュベートします。翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、成長検査を行います。スクロース耐性コロニーは、二重交差組換えであるべきである。滅菌爪楊枝を使用して、PIAの事前に温めたプレートに少なくとも20個のコロニーをパッチし、PIAに10%スクロースを加え、PIAにカルベニシリンを加えます。プレートを一晩インキュベートし、翌日に成長を調べます。真の二重交差組換えは、カルベニシリン感受性およびスクロース耐性である。10〜20コロニーを削除する、コロニーPCRを用いた。無菌爪楊枝を持つ疑わしい二重クロスオーバー組換え剤の成長を拾い、PBSの50マイクロリットルでそれを中断します。100°Cで10分間沸騰させます。Gの13,000倍で3分間遠心分離し、氷の上に置きます。次に、原稿の指示に従ってPCRを行う。PCRが終了したら、製品に対してアガロースゲル電気泳動を行います。より小さい増幅産物は、対象領域が削除されたコロニーを示す。注射の朝、細菌細胞の凍結を摂氏4度で3~4時間解凍する。解凍後にバイアルを氷の上に置き、2時間以内にマウスを注入します。各凍結の内容物を新しい2ミリリットルチューブに移し、それを4,500回Gで10分間遠心分離します。上清を捨て、PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再中断します。遠心分離を繰り返し、PBS中の細胞を1ミリリットル当たり9番目のコロニー形成単位に2.5倍の最終濃度に再中断する。各菌株の最終懸濁液から3つのサンプルを採取し、濃度、遺伝子型、表現型を検証します。各株について、2ミリリットルチューブに細胞懸濁液のアリコート1.5ミリリットルを、コントロール注射のためにPBSを準備します。無菌動物外科室で注射に必要なマウスと材料を収集し、開始する前に消毒ワイプですべての表面を拭きます。ラテックス手袋を2足着用して、刺された場合のパンクのリスクを制限し、ラボコート、安全メガネ、フェイスマスクを着用してください。ケージからマウスを取り出し、重量を量り、注射後の追跡のために永久的なマーカーで尾をマークします。27ゲージ針で新しい1ミリリットルの注射器を開き、200マイクロリットルの無菌PBSを引き出します。親指と人差し指を使って耳の後ろにマウスをつかみ、首のうなじで皮膚の折り目を作成するためにピンチ。その後、ピンキーを使用して尾を手のひらに固定し、マウスを平らにして不動の状態にします。正中線の左右の腹腔に30度の角度で針を挿入します。わずかに、それが臓器に挿入されていないことを確認するために針を持ち上げます。その後、ゆっくりとPBSを注入し、針を引き出します。注射部位のボーラスは典型的です.針を指定されたシャープ処理容器に入れ、マウスを別のケージに移動します。次のマウスで手順を繰り返し、1つのケージからのすべてのマウスを注入した後、元のケージに戻します。コントロールグループを注入した後、同じ手順を使用してテストグループを注入します。すべての注射が完了したら、マウスをハウジングルームに戻し、消毒ワイプで作業領域をきれいにします。動物を画像化するには、カメラパラメータを設定し、ステージを加熱して撮像システムを準備します。酸素の流れを1分あたり1.5リットル、イオブルランを3.5%に設定し、マウスを麻酔室に移動し、麻酔に続いて温度安定化ステージに移動します。マウスを腕を伸ばして背中に置き、イメージング中に2.5%isofluraneを投与するために鼻コーンをフィットさせます。ドアを閉め、マウスの生物発光画像とX線を撮ります。イメージングが完了したら、マウスをケージに戻して監視します。それは3〜5分以内に意識を取り戻す必要があります。標的ゲノム欠失は、対象領域を増幅する特異的プライマーを有するコロニーPCRによって確認された。ゲノム欠失を有するコロニーは、野生型コロニーに比べて短いPCRバンドを生み出す。P緑素吸皮症の減衰株の腹腔内注射は、PGN5、0%の死亡率をもたらし、大腸菌BL21で観察された死亡率と同等である。しかし、親株の注射は、マウスの80%に致命的であった。感染の進行は、生物発光印の親および減衰株を用いて追跡された。減弱株は、生物発光が薄れるまで注射部位に局在したままでした, 感染のクリアランスと一致する可能性が高いです.提示された方法は、株によって生成された死亡率のみを調べた。より深い免疫学的および毒物学的側面は、感染のダイナミクスと感染が死に至らない最終的な影響を決定するために利用することができる。手順で最も重要なことは、最初の識別から動物実験までの様々なステップの間に行われる広範な検証です。特定の検証ステップを見逃すと、テストされた株が突然変異や選択を受けたり、汚染されたりする可能性があるため、間違った結果につながる可能性があります。これら2つの技術の開発により、感染免疫学の分野の研究者は、強力なパッケージ相互作用が極端な表現型、敗血症、死亡率につながる方法をより効果的に調査できるようになると考えています。異なる栄養素の変異体への影響は、細菌のサイズのドージングを介して比較することができます。.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典:バレンタイン、ME、他。Pseudomonas aeruginosaにおけるインフレーム遺伝子欠失変異株の作製と感染の単純なマウスモデルにおける病原性減衰の試験J. Vis. 経験。(2020年)このビデオでは、生物発光を使用して、マウスにおける毒性細菌株と弱毒菌株のin...

生物発光を用いたマウスにおける細菌感染動態の追跡

出典:バレンタイン、ME、他。Pseudomonas aeruginosaにおけるインフレーム遺伝子欠失変異株の作製と感染の単純なマウスモデルにおける病原性減衰の試験J. Vis. 経験。 (2020)。このビデオでは、プラスミドベースの遺伝子欠失戦略を使用した緑 膿...

標的遺伝子欠失のための緑 膿菌 の二重クロスオーバー組換え体の生成

出典: Valentine, M. E.ら、『 緑膿菌 におけるインフレーム遺伝子欠失変異体の生成および感染の単純なマウスモデルにおける病原性減損の検証』。 J. Vis.

生物発光を用いたマウスモデルにおける細菌感染のリアルタイムイメージング

肺炎球菌は、重症市中肺炎、世界中200万人以上の死亡の原因を引き起こす主要な病原体である。フィットネスまたは病原性に関与する細菌性因子の影響は、生物発光細菌を用いて、マウスの急性肺炎または菌血症モデルにおいてリアルタイムでモニターすることができる。...

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

ここでは、画面に高密度の挿入変異体ライブラリーを生成するためのミニhimar1マリナートランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述し隔離し、原型緑膿菌 PAO1株における新規アルギン酸レギュレータを識別します。...

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト...

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

線虫におけるアエロモナス感染症を研究する 3...

病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。...

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

λ-Red媒介組換え系を用いて、小さなノンコーディングRNA micCの欠失変異体を作製した。...

ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ...

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

学ぶPseudomonas aeruginosaの遺伝子欠失変異体生成とマウス感染モデルによる毒性評価法。この再現性の高いプロトコルは細菌の病原性メカニズム解明に有用です。

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

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