Name: Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez l'étiquetage balistique des neurones pyramidaux chez le rat combiné à un logiciel de reconstruction neuronale avancé. Cette méthode permet d'analyser la morphologie dendritique et les épines pour mieux comprendre les dysfonctionnements neurocognitifs.

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Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

Tous les protocoles d’animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028).
1. Préparation de tubes de perles DiI/Tungsten
<ol><li>Dissoudre 100 mg de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec 10 ml de ddH2O. Vortex la solution PVP à la légère.</li>
	<li>Remplissez le tube avec la solution PVP (voir Tableau des matériaux) et laissez-le pendant 20 min. Ensuite, expulsez la solution PVP à l’autre extrémité de la tubulure à l’aide d’une seringue de 10 ml.</li>
	<li>Mélanger 170 mg de perles de microcarrier de tungstène avec 250 lil de chlorure de méthylène. Vortex la suspension de perle de tungstène à fond.</li>
	<li>Mélanger 6 mg de colorant lipophile DilC18(3) avec 300 lil de chlorure de méthylène. Vortex la solution de teinture DilC18(3) à fond. REMARQUE : Effectuez les étapes 1.3-1.4 dans un capot de fumée.</li>
	<li>Pipette 250 L de la suspension de perle de tungstène sur une glissière en verre. Attendez que la suspension soit sèche à l’air (3 min).</li>
	<li>Ajouter 300 L de solution de teinture DilC18(3) sur le dessus de la couche de suspension de perle de tungstène. Mélanger la solution de teinture DiIC18(3) et la suspension de perle de tungstène à fond avec une pointe de pipette et laisser sécher le mélange (3 min).</li>
	<li>Une fois séché, utiliser une lame de rasoir pour diviser le mélange en deux tubes de centrifugeuse de 1,5 mL. Remplir les tubes d’eau.</li>
	<li>Sonicate dans un bain d’eau (Amp I, 100%) jusqu’à consistance homogène (5 min). Assurez-vous que la pointe du sonicateur se trouve directement sur les tubes avec la suspension de perle.</li>
	<li>Mélanger les deux 1,5 ml de mélange homogénéisé dans un tube conique de 15 ml. Sonicate le mélange pour un autre 3 min.</li>
	<li>Dessiner le mélange de teinture de tungstène-DilC18(3) dans le tube enrobé de PVP à l’aide d’une seringue de 10 ml. Nourrir les tubes dans la station de préparation (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Tourner pendant 1 min sur la station de préparation. Retirez soigneusement toute l’eau du tube à l’aide d’une seringue de 10 ml.</li>
	<li>Allumez le gaz azoté et ajustez le débit d’azote à environ 0,5 litre par minute (LPM), faites pivoter le tube dans la station de préparation et séchez avec de l’azote pendant 30 min.</li>
	<li>Retirer le tube de la station de préparation et couper en longueurs de 13 mm (correspondant à la taille de chargement de la cartouche) à l’aide d’un coupe-tubing. Gardez les longueurs de 13 mm dans les flacons scintillants dans l’obscurité.</li>
</ol>2. Préparation des sections cérébrales
REMARQUE : Les rats mâles adultes F344/N étaient des rats de paire logés dans un environnement contrôlé sous un cycle clair:obscurité de 12/12 avec l’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge à l’aide des lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
<ol><li>Anesthésiez profondément les rats à l’aide de 5 % de sévoflurane.</li>
	<li>Passez à l’étape suivante lorsque les rats ne sont pas sensibles aux stimuli nocifs et les réflexes sont absents.</li>
	<li>Fixez le rat en position de supine à l’intérieur d’une hotte chimique.</li>
	<li>Faire une incision à travers la peau le long de la ligne médiane thoracique. Séparer le diaphragme et ouvrir la poitrine avec des ciseaux. Insérez une aiguille de 20 G et 25 mm dans le ventricule gauche.</li>
	<li>Couper immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux. Perfuse 50 mL de 100 mM PBS avec un débit de 5 ml/min. Perfuse 100 ml de paraformaldéhyde de 4 % tamponné dans 100 mM PBS.</li>
	<li>Retirez tout le cerveau du rat juste après la perfusion.</li>
	<li>Postfix le cerveau entier pendant 10 min avec 4% de paraformaldéhyde. REMARQUE : Ne pas postfixer dans 4% de paraformaldéhyde pendant plus de 30 minutes, car il affectera l’étiquetage.</li>
	<li>Couper 500 m d’épaisseur sections coronales à l’aide d’une matrice du cerveau de rat (voir Tableau des matériaux). Faire la première coupe et garder la lame en place. Faire une deuxième coupe à l’aide d’une deuxième lame et enlever verticalement la première lame, en gardant le tissu sur la surface de la lame.</li>
	<li>Placer les tranches de cerveau dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de PBS de 100 mM dans chaque puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les tranches aient été coupées.</li>
</ol>3. Étiquetage et visualisation balistiques des sections cérébrales
<ol><li>Retirez le PBS de chaque puits ciblé.</li>
	<li>Chargez la cartouche avec un morceau de tuyauterie de perles DiI/Tungsten et placez-la dans l’applicateur.</li>
	<li>Mettez un morceau de papier filtre entre deux écrans en maille. Connectez l’applicateur au tuyau d’hélium. Ajuster la pression de sortie de l’hélium à 90 livres par pouce carré (psi).</li>
	<li>Placez l’applicateur verticalement à la main au centre du puits ciblé à une distance de 1,5 cm entre l’échantillon et l’écran de maille. Feu le tuyau de perles DiI/Tungsten. REMARQUE: Assurez-vous de supprimer tous les PBS des puits ciblés avant le tournage.</li>
	<li>Chargez la cartouche avec le prochain tube de perles DiI/Tungsten. Tirer continuellement les perles DiI/Tungstène de la tuyauterie sur les tranches restantes.</li>
	<li>Remplissez la plaque de 24 puits de 100 mM de PBS. Laver avec 500 L de frais 100 mM de PBS 3x. Ne laissez pas les tranches se retourner pendant le lavage avec PBS.</li>
	<li>Ajouter 500 L de PBS frais de 100 mM et garder les tranches à 4 oC dans l’obscurité pendant 3 h.</li>
	<li>Transférer les tranches de cerveau sur des toboggans en verre à l’aide d’une brosse fine. REMARQUE : Trois sections cérébrales peuvent être transférées sur chaque lame de verre.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 1 ml d’antifade à montage moyen sur chaque section. Placez un housse de 22 mm x 50 mm sur les sections du cerveau. Sécher les toboggans en verre dans l’obscurité pendant 2 jours.</li>
	<li>Allumez le système de microscope confocal et passez à un objectif de 60 degrés.</li>
	<li>Réglez le système de microscope confocal pour avoir un grossissement de 60 '(A/1.4, huile) et un intervalle Z-plan de 0.15 'm (taille de trou d’épingle 30 'm, rétro-projeté rayon de trou d’épingle 167 nm). Utilisez une longueur d’onde de 543 nm pour acquérir des images des neurones d’intérêt.</li>
	<li>Obtenez des images Z-stack pour le type de neurone ciblé basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones. REMARQUE : Acquérir au moins trois images de chaque animal.</li>
</ol>4. Utilisation de la méthodologie avec la culture cellulaire
<ol><li>Isoler les neurones corticaux primaires des rats F344/N au premier jour postnatal en utilisant la méthodologie précédemmentrapportée 14.</li>
	<li>Culture principales neurones corticaux dans un plat de fond en verre de 35 mm pendant une semaine. Changer la moitié du milieu de culture avec le milieu de croissance de neurone frais au troisième jour après l’isolement. Laver le plat de fond de verre 2x avec 1 mL de 100 mM PBS.</li>
	<li>Fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez les étapes 3.2-3.6 pour étiqueter balistiquement les cellules.</li>
	<li>Laver avec 1 mL de 100 mM PBS 3x. Ajouter 500 L de 100 mM frais de PBS et le garder à 4 oC dans l’obscurité pendant 3 h.</li>
	<li>Ajouter 200 L de milieu de montage d’antifade.</li>
	<li>Obtenez des images Z-stack pour chaque neurone ciblé en utilisant les paramètres de l’étape 3.10.</li>
</ol>5. Analyse neuronale et quantification de la colonne vertébrale dendritique
<ol><li>Neurones aveugles utilisant des numéros de code pour empêcher le biais d’expérimentateur.</li>
	<li>Établir des critères de sélection pour les neurones en fonction de la région cérébrale d’intérêt. REMARQUE : Les critères de sélection des neurones comprennent la coloration dendritique continue, le bas fond, l’absence de grappes de colorant à l’intérieur des cellules, la diffusion minimale du colorant DiI dans l’espace extracellulaire, la morphologie correcte des neurones pyramidaux(figure 1).</li>
	<li>Logiciel de reconstruction neuronale ouvert (Voir la vidéo ci-jointe 1).</li>
	<li>Chargez un fichier d’image en cliquant sur l’image «File Folder» dans le coin supérieur gauche.</li>
	<li>Cliquez sur "Soma" et marquez la sme des neurones sur l’image.</li>
	<li>Cliquez sur "Tree" et sélectionnez "User-Guided".</li>
	<li>Tracez toutes les branches d’intérêt dendritiques. REMARQUE : Pour les neurones pyramidaux, qui sont caractérisés par un dendrite apique et de multiples dendrites basilaires, seul le dendrite apique est tracé. Assurez-vous que toutes les branches de connexion sont attachées les unes aux autres.</li>
	<li>Cliquez sur "Spine".</li>
	<li>Définir les paramètres de détection et cliquez sur " Détectertous". REMARQUE : Pour les tranches de cerveau, les paramètres cohérents utilisés dans les régions du cerveau sont : 2,0 (outer Range), 0.3 (hauteur minimale), 100% (sensibilité de détecteur), et 10 (compte minimum). Pour la culture cellulaire, il est nécessaire d’augmenter la sensibilité au détecteur et de diminuer le nombre minimum.</li>
	<li>Classer les épines en sélectionnant «Classify All». REMARQUE : Les épines dendritiques sont classées à l’aide d’un algorithme faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction neuronale15.</li>
	<li>Enregistrez le traçage en sélectionnant l’image de disque dans le coin supérieur gauche.</li>
	<li>Effectuez des analyses morphologiques neuronales et dendritiques de la colonne vertébrale.<ol>
<li>Logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale ouvert (Voir la vidéo ci-jointe 2).</li>
		<li>Chargez l’image en cliquant sur "File" et "Open Data File".</li>
		<li>Cliquez sur "Analyse" et "Analyse de structure ramifiée" pour analyser la morphologie neuronale et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique.</li>
		<li>Pour la morphologie neuronale, cliquez sur "Tree Totals" et sélectionnez la case pour "Dendrite Totals".</li>
		<li>Pour la morphologie de la colonne vertébrale dendritique, cliquez sur "Spines" et sélectionnez ensuite la boîte pour "Spine Details".</li>
		<li>Enregistrez la sortie sous forme de fichier texte (.txt) en cliquant à droite sur la table de sortie et en sélectionnant «Enregistrer pour le fichier».</li>
		<li>Cliquez sur "Analyse" et "Analyse Sholl".</li>
		<li>Réglez le rayon de départ à 10 m et l’incrément de rayon à 10 m.</li>
		<li>Cliquez sur la case "Dendrites" et cliquez sur "Display".</li>
		<li>Enregistrez la sortie sous forme de fichier texte (.txt) en cliquant à droite sur la table de sortie et en sélectionnant « Enregistrer pour lefichier».</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Analyser les données de morphologie neuronale (c.-à-d. complexité de branchement dendritique).<ol>
<li>Ajoutez le nombre de dendrites à chaque ordre de branche et divisez par le nombre total de dendrites. Multipliez par 100 pour calculer les fréquences relatives pour le nombre de dendrites à chaque commande de branche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser les données d’analyse Sholl pour examiner la complexité neuronale de l’arborescence et la connectivité de la colonne vertébrale dendritique.<ol>
<li>Calculez l’erreur moyenne et standard de la moyenne pour le nombre d’intersections à chaque rayon.</li>
		<li>Résumez le nombre d’épines dépendantes du type de colonne vertébrale (c.-à-d. mince, trapue, champignon) à chaque rayon et divisez par le nombre total d’épines pour ce type de colonne vertébrale. Multipliez par 100 pour calculer les fréquences relatives pour le nombre d’épines à chaque rayon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%22DiOlistic%22+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).</li>
<li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
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<li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations%2C+spinules%2C+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li>
<li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dendritic+spine+detection%3A+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Filamentous+Actin+%28F-actin%29+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Dans ce protocole, nous décrivons une technique d’étiquetage polyvalente pour les neurones du cerveau de rat et ceux cultivés in vitro. En outre, nous rapportons la méthodologie pour utiliser le logiciel de reconstruction neuronale et le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. L’évaluation de la morphologie neuronale et des épines dendritiques fournit une occasion de déterminer des altérations dans la complexité de ramification dendriti...

En 2000, Gan et coll. ont décrit une technique d’étiquetage rapide pour les neurones individuels et les glia dans le système nerveux qui a combiné divers colorants lipophiles, permettant l’étiquetage simultané de nombreuses cellules du cerveau avec des couleurs différentes1,2. Plus récemment, une technique d’étiquetage balistique a été décrite par Seabold et coll.3 qui a introduit des colorants fluorescents (Dil) dans les neurones des tranches de cerveau. Technique polyvalente de coloration, l’étiquetage balistique est apprécié pour sa capacité à être utilisée chez plusieurs espèces animales et à travers un large éventail d’âges. En outre, il peut être combiné avec l’immunostaining pour identifier les sous-populations des cellules du cerveau3. Par rapport aux techniques traditionnelles (p. ex., l’imprégnation argentée Golgi-Cox, microinjection)4, l’étiquetage balistique offre l’occasion de distinguer plus clairement les caractéristiques morphologiques, y compris les épines dendritiques, une caractéristique essentielle pour tirer des inférences sur la complexité neuronale et la connectivité synaptique5.
Les neurones pyramidaux excitatoires sont caractérisés par un seul, grand dendrite apical, de multiples dendrites basales plus courtes, et des milliers d’épines dendritiques6. Les neurones pyramidaux se trouvent dans plusieurs régions du cerveau liées au traitement cognitif de l’ordre supérieur, y compris le cortex préfrontal (PFC) et l’hippocampe. Dans le PFC, les neurones pyramidaux sont observés dans les couches II/III et la couche V, chacun présentant une morphologie unique. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la couche II/III du PFC ont un dendrite apique plus court et moins de ramification que les neurones pyramidaux dans la couche V6. Dans l’hippocampe, les neurones pyramidaux sont situés dans les régions CA1 et CA3, chacun affichant des morphologies distinctes. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la région de CA1 présentent un dendrite apical plus distinctif, avec la branche se produisant plus loin de la soma, par rapport à la région de CA36.
Les épines dendritiques sur les neurones pyramidaux dans le PFC et l’hippocampe sont le site primaire des synapses excitatrices7. Les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques, qui sont classiquement caractérisées en trois catégories primaires (c.-à-d. minces, trapues, ou champignons8), ont été liées à la taille de la synapse excitatrice9. Les épines minces, caractérisées par un long cou mince, une petite tête bulbeuse et de plus petites densités postsynaptiques, sont plus instables et développent des connexions plus faibles. Cependant, les épines de champignon, qui ont une tête de colonne vertébrale dendritique plus grande, sont identifiées pour former des connexions synaptiques plus fortes, un effet résultant de leur plus grande taille. En contraste net, les épines trapues sont dépourvues d’un cou de la colonne vertébrale, présentant un rapport de volume de la tête et du cou à peu près égal8. Dans l’hippocampe, des épines ramifiées peuvent également être observées, auquel cas la colonne vertébrale a plusieurs têtes qui émergent du même cou de la colonne vertébrale dendritique10. Par conséquent, les changements morphologiques des épines dendritiques pourraient refléter la fonctionnalité et la capacité structurelle. En outre, des études ont démontré que la taille et la forme des épines dendritiques se rapportent à leur plasticité structurelle, conduisant à l’idée que les petites épines sont impliquées dans l’apprentissage et l’attention, tandis que de plus grandes épines plus stables, sont impliqués dans des processus à long terme, y compris la mémoire11. En outre, la distribution des épines dendritiques le long de la dendrite peut être associée à la connectivité synaptique5,12.
Ainsi, le présent document méthodologique a trois objectifs: 1) Présenter notre protocole d’étiquetage balistique, qui a été utilisé avec un taux de réussite (c’est-à-dire, neurones répondant aux critères de sélection et approprié pour l’analyse) de 83,3%5,12,13 et à travers les régions du cerveau multiples (c.-à-d., PFC, noyau accumbens, hippocampe); 2) Démontrer la généralisation de la technique et son application aux neurones cultivés in vitro; 3) Détail de la méthodologie utilisée dans le logiciel de reconstruction neuronale et les inférences qui peuvent être tirées à partir de ces données.

<table><tbody><tr><td>20Gx25mm Aiguille PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits</td><td>Costar</td><td>3562</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plats à fond de verre</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>B-27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Doublure de canon</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2417</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Porte-cartouche</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2426</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie confocale</td><td>Nikon</td><td>EZ-C1</td><td>version 3.81b</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>TE-2000E</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle verre</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>DilC18(3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>F344 rat</td><td>(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Écrans de diffusion Helios</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2475</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pistolet à gènes Helios</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2411</td><td></td></tr><tr><td>Système de pistolet à gènes Helios</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2431</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau d’hélium</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2412</td><td></td></tr><tr><td>Pince à iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de méthylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>D150-1</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 360 software</td><td>mbf bioscience</td><td></td><td>analyse dendritique de la colonne</td></tr><tr><td>vertébrale Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Fisher Scientific</td><td>5295</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>support de montage</td></tr><tr><td>Matrice de cerveau de rat, 300 - 600g, coronale, 0,5 mm</td><td>Ted Pella</td><td>15047</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154 %</td><td></td></tr> <tr><td>Kit</td> <td>de seringueBIO-RAD</td><td>165-2421</td><td></td></tr><tr><td>Tube en tefzel</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Coupe-tube</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Station de préparation de tubes</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2418</td><td></td></tr><tr><td>Tungstène M-25 Microcarrier 1.7 &micro ; m</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2269</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Ciseaux</td><td>World Instruments</td><td>de précision 500086</td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Il a été rapporté que la taille et la forme des épines dendritiques est liée à leur plasticité structurelle. Pour identifier la structure morphologique des neurones pyramidaux et des épines dendritiques, une technique d’étiquetage balistique peut être utilisée. Dans le protocole actuel, les neurones pyramidaux sont étiquetés avec le colorant DilC18(3) et analysés à l’aide d’un logiciel de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. Pour étudier la structure neuronale, l’analyse de branchement dendritique et l’analyse de Sholl sont exécutées, permettant aux chercheurs de tirer des inférences au sujet de la complexité de ramification dendritique et de la complexité neuronale d’arborescence, respectivement. L’évaluation des épines dendritiques est effectuée à l’aide d’un algorithme de classification assisté automatique faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction, qui classe les épines en quatre catégories (c.-à-d. minces, champignons, stubby, filopode). De plus, trois autres paramètres (c.-à-d. longueur, diamètre de la tête et volume) sont également choisis pour évaluer les altérations de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Pour valider le potentiel d’application large de la technique d’étiquetage balistique, les neurones pyramidaux de la culture cellulaire in vitro ont été étiquetés avec succès. Dans l’ensemble, la méthode d’étiquetage balistique est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué, permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents dysfonction neurocognitive.

Dans la figure 2A, les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampique dans les sections du cerveau de rat ont été identifiés par la technologie d’étiquetage balistique, caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basales plus petites autour du soma. La figure 2B montre le neurone dans le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale après que le soma ait été détecté, des branches dendritiques ont été tracées, et des ...

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Ce protocole permet d’évaluer les altérations morphologiques potentielles des neurones et des épines dendritiques qui peuvent souligner les anomalies neurochimiques et comportementales. Il est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents au dysfonctionnement neurocognitif. Commencez par préparer la solution PVP selon les directives manuscrites.Remplissez le tube de PVP et laissez-le pendant 20 minutes. Et l’expulser à travers l’autre bout avec une seringue de 10 millilitres. Mélanger 170 milligrammes de perles de microcarrier de tungstène avec 250 microlitres de chlorure de méthylène.Puis bien vortex de la suspension. Ensuite, ajoutez 6 milligrammes de colorant lipophile DilC18(3) à 300 microlitres de chlorure de méthylène et de vortex. Pipet 250 microlitres de la suspension de perle de tungstène sur une glissière en verre.Attendez que la suspension sèche à l’air libre et ajoutez 300 microlitres de la solution de teinture. Une fois séché, utiliser un rasoir pour diviser le mélange en deux tubes centrifugeuses de 1,5 millilitre et remplir les tubes d’eau. Sonicate le mélange dans un bain d’eau jusqu’à homogénéité.S’assurer que la pointe du sonicateur se trouve directement sur les tubes. Dans un tube conique de 15 millilitres, mélanger les deux mélanges. Et sonicate pendant encore trois minutes, en s’assurant qu’il ne reste pas de grandes touffes de perles enduites de teinture.Après la sonication, dessiner le mélange dans le tube enduit PVP avec une seringue de 10 millilitres. Et nourrir le tube dans la station de préparation. Faites pivoter le tube pendant une minute.Retirer soigneusement toute l’eau à l’aide d’une seringue. Allumez le gaz azoté et ajustez le débit d’azote à environ 0,5 litres par minute. Faites pivoter le tube dans la station de préparation et séchez-le avec de l’azote pendant 30 minutes.Retirez le tube de la station et coupez-le en segments de 13 millimètres à l’aide d’un coupe-tube. Assurez-vous que le rat n’est pas sensible aux stimuli nocifs et les réflexes sont absents. Ensuite, fixez-le dans la position supine.Faire une incision le long de la ligne médiane thoracique. Séparez le diaphragme et ouvrez la poitrine avec des ciseaux. Insérez ensuite une aiguille de 20 jauges de 25 millimètres dans le ventricule gauche.Coupez immédiatement l’atrium droit avec des ciseaux et perfusez 15 millilitres de PBS de 100 millimolaires avec un débit de 5 millimètres par minute. Puis parcourir 100 millilitres de 4%PFA tamponné en PBS. Après la perfusion, retirez tout le cerveau du rat.Et postfix il avec 4%PFA pendant 10 minutes. Utilisez une matrice cérébrale de rat pour couper 500 micromètres d’épaisseur section coronale. Faire une coupe de poing et garder la lame en place.Ensuite, faites une deuxième coupe avec une deuxième lame et retirez verticalement la première lame, en gardant le tissu sur la surface de la lame. Placez les tranches de cerveau dans la plaque de 24 puits avec 1 millilitre de PBS dans chaque puits. Et répétez le processus jusqu’à ce que toutes les tranches aient été coupées.Retirez le PBS de chaque puits ciblé. Chargez le cartilage avec un morceau de tube de dil/tungstène et placez-le dans l’applicateur. Mettez un morceau de papier filtre entre les deux écrans de maille.Et connectez l’applicateur au tuyau d’hélium. Réglez ensuite la pression de sortie de l’hélium à 90 livres par pouce carré. Placez l’applicateur verticalement au centre du puits ciblé de 1,5 centimètre entre l’échantillon et l’écran en maille.Puis tirez sur le tube de dil/tungstène. Chargez le cartilage avec le tube suivant et tirez continuellement les perles du tube sur les tranches restantes. Remplissez la plaque de 24 puits avec 100 millimolar PBS.Et laver les tranches trois fois avec 500 microlitres de PBS frais. S’assurer que les tranches ne se retournent pas pendant le lavage. Une fois terminé, ajouter 500 microlitres de PBS frais aux tranches.Et les incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans le noir. Après l’incubation, utiliser une brosse fine pour transférer les tranches de cerveau sur des toboggans en verre. Et ajoutez immédiatement un millilitre de support de montage antifade à chaque section.Placez un coverslip de 22 par 15 millimètres sur les sections et séchez les glissières dans l’obscurité. Allumez le système de microscope confocal et passez à un objectif 60X. Ajustez les paramètres d’imagerie en fonction des instructions manuscrites.Et obtenir des images Z-stack pour le type de neurone ciblé basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones. Isoler le neurone cortical primaire des rats F344/N au premier jour postnatal et les culture dans un plat de fond en verre de 35 millimètres pendant une semaine. Rafraîchissant la moitié du milieu le troisième jour après l’isolement.Lavez le plat deux fois avec 1 millilitre de 100 millimolar PBS. Et fixer les cellules avec 4%PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Étiquetez balistiquement les cellules comme précédemment décrites.Et lavez-les trois fois de plus avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de PBS aux cellules et les incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Ajouter ensuite 200 microlitres de milieu de montage antifade.Et obtenez des images Z-stack pour chaque neurone ciblé. Les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampale dans les sections de cerveau de rat ont été identifiés avec la technologie d’étiquetage balistique caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basiques plus petits autour du soma. Le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale a été utilisé pour tracer les branches dendritiques et détecter les épines.Par la suite, le logiciel a été utilisé pour évaluer la complexité des ramifications dendritiques et la complexité neuronale des arbres. Des changements morphologiques dans des épines dendritiques ont été évalués utilisant la longueur, le volume, et le diamètre de tête. Puis les épines ont été classées en épines minces, stubby, et champignons.Et la fréquence relative du nombre d’épines entre chaque rayon a été examinée. En outre, la technique d’étiquetage balistique a été validée sur un neurone pyramidal primaire dans la culture cellulaire. Des neurones pyramidaux ont été identifiés basés sur la forme de triangle du soma et le grand dendrite apical.Puis le logiciel de reconstruction neuronale a été utilisé pour analyser la distribution des épines dendritiques minces et de la longueur de la colonne vertébrale dendritique. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important d’éviter de grandes touffes ou des grappes de perles de tungstène enduites de colorant balistique qui commencent la préparation. Les touffes ne permettraient pas de distinguer les neurones individuels.Combinée à un logiciel de reconstruction neuronale, cette méthode nous permet d’examiner la morphologie neuronale et dendritique de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux hippocampiques. Le logiciel de reconstruction neuronale utilise un algorithme pour offrir la classification assistée automatique des épines dendritiques. La quantification de paramètres neuronaux multiples offre l’occasion de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent au dysfonctionnement cognitif neuronal.

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