Name: 神経筋解析のためのラット声帯の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶラット声帯の調製法を神経筋解析のため。凍結切片技術を用いて甲状披裂筋などの喉頭筋構造を正確に同定し、発達・加齢・疾患に伴う神経筋適応を組織学的に評価する。

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この研究は、国立国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害研究所のF31DC017053-01A1(LENELL、PI)およびK23DC014517(ジョンソン、PI)の助成金によって支えられた。

この研究は、ニューヨーク大学医学部の施設動物ケア・使用委員会に従って行われました。
1. ラット喉頭を解剖する
<ol><li>制度的に承認されたプロトコルに従ってラットを安楽死させる。組織標本の毛皮の汚染を防ぐために、下顎からマニュリウムに腹側の首を剃り、アルコールで綿棒を剃ります。</li>
	<li>10倍の拡大率を持つ解剖スコープの下で、気管が露出するまでメスで中線の首の切開を作成することによって喉頭全体を切除する。</li>
	<li>中線で腹側外線喉頭筋を分離し、鉗子と解剖ハサミまたはメスを使用して喉頭を露出させます。</li>
	<li>気管尾骨を第3気管リングに切断し、舌骨に切開ロストラルを作り、切除ハサミを使って喉頭全体を切除する。</li>
	<li>拡大縮小の下で、マイクロディスセクションツール(ピンセット、ピン、ピン、マイクロシザー)を使用して喉頭から外因性喉頭組織(食道、甲状腺、外回喉頭筋)を取り除きます。</li>
	<li>マイクロシザーでは、後部コラリテノイド筋肉の間の正中線をランドマークとして使用して、喉頭をarytenoidの間にドーセリーします。喉頭の横壁をピンで留め、声帯を露出させ、次いでマイクロシザーで声の前部のコミュシャの間の甲状腺軟骨の正中線を通って腹孔を二分する(図1)。 注: この手順はオプションです。喉頭全体を保つためにスキップすることができます。喉頭の二角切除は、同じ喉頭の左右の側面を別々に使用することにより、複数の免疫染色技術を可能にする。</li>
	<li>各ヘミ喉頭をリン酸緩衝溶液(PBS)で~10秒にリンスし、凍結中の氷晶形成を低減する作業ワイパーで繊細に乾燥させます。</li>
</ol>2. 喉頭組織の固定および/またはフラッシュフリーズ
注: 固定は、すべての免疫染色プロトコルに最適とはいえない場合があります。多くの場合、喉頭組織は、解剖直後に新鮮なフラッシュ冷凍である。ステップ 2.1 をスキップして、固定せずに喉頭組織をフラッシュフリーズします。
<ol><li>ヘミ喉頭を固定するために、PBSで4%ホルムアルデヒドを充填した遠心管に組織を配置し、70rpmで軌道シェーカー上の室温で1時間置く。ティッシュをきれいな遠心管に移し、PBSで20分間3倍洗いします。その後、クリーン遠心管に移し、4°Cで20%スクロース/5%グリセロール溶液(約18時間または組織が沈むまで)に沈水する。 注意:ホルムアルデヒドは危険であり、適切な個人用保護具と一緒にヒュームフードで使用する必要があります。</li>
	<li>すべてのヘミ喉頭を均一な位置に配置し、最適な切削温度(OCT)化合物で満たされたクライオモールドに入れます。ヘミラNXの場合は、声帯の内側の表面がクリオマールの底に面し、声楽の縦方向の側面がクリオマール開口部の下端と平行に配置されます。喉頭全体の場合、クリオマールの底に向かって後部クリコアリテノイドと、声楽の縦方向の側面を、クリオマール開口部の下端と平行に配置します。 注:OCTコンパウンド内の一貫した喉頭配は、ラットの声帯の凍結切断に重要です。ヘミヤNXが埋め込まれ凍結されると、その向きを変更するために解凍する必要があり、それによって、複数の融解凍結サイクルによる組織損傷のリスクを導入する。</li>
	<li>液体窒素に囲まれたスチールビーカーで冷やされたイセペンタン(2-メチルブタン)を用いたフラッシュフリーズ組織。 注:白い沈殿物がビーカー13の側面および底部に形成され始めると、isopentaneは組織凍結のための最適な温度に達する。イセペタンは液体窒素よりも熱伝導率が高いため使用され、急速凍結時の組織ブロックの割れを防ぐのに役立ちます。OTCにおける凍結組織のより詳細な説明については、クマールら13を参照してください。</li>
	<li>各金型を事前にラベル付けされたホイルで包み、脱水を防ぐために個々の冷凍袋に入れ、-80°C冷凍庫に保管するために移されるまですぐにドライアイスに保管します。</li>
</ol>3. 断面面におけるクライオセクションヘミヤクス
<ol><li>クライオスタットのチャンバー温度を-20 °Cに設定し、メーカーのマニュアルで筋肉組織の切断に推奨される温度範囲(15-25 °C)の真ん中にあります。</li>
	<li>クライオスタットセクションの厚さを10μmの厚いセクションに設定します。 注:筋線維断字解析では、10 μmの厚い断面が最適で、繊維タイピング解析用のラベル付き筋繊維の完全な染色と堅牢なイメージング強度を可能にします14,15,16。いくつかのプロトコルは、神経筋の標的に応じて異なるセクション厚さを必要とするかもしれない。</li>
	<li>凍結スタットチャンバーに組織を移し、凍結スタット標本ディスク(チャック)にOCT化合物の均一な層を追加し、組み込まれた組織ブロックをOCT化合物の上に置きます。チロイルテノイド(TA)筋線維解析のために声帯の断面を得るために、腹側甲状腺軟骨がクライオスタットブレードに面し、アリテノイド軟骨が検体円盤に面するように、試料をチャックに貼り付ける。 注: これらのランドマークは、OCT コンパウンドが凍結すると白色になり不透明になるため、この段階では表示されないことに注意してください。この視界の欠如は、フラッシュ凍結段階でヘミラリクスの向きに注意することが重要である理由です。</li>
	<li>甲状腺軟骨の腹側部分が現れるまで、検体頭部を100μm進めることによりOCT化合物をトリムする。</li>
	<li>次に、甲状腺軟骨の発症から、層状のプロプリア、内側TA筋肉、および横TA筋肉が露出するまでの30μmの切片をトリムして追跡します。 注:喉頭のランドマークは、断面の角度が斜めではないことを確認するために、100 μmごとに甲状腺軟骨の発症から追跡および注意する必要があります。 図2 は、10倍の倍率で断面面の喉頭ランドマークの2つのセットを表しています。</li>
	<li>ターゲットTA筋肉に到達したら、10μmで正に帯電したスライドのセクションを収集します。</li>
	<li>4°CでPBSにセクションを保管し、汚れる準備ができるまで水分を保持します。 注:固定組織はIHCターゲットに応じて1週間までPBSに保存できますが、固定されていない組織は直ちに処理する必要があります。</li>
</ol>4. 縦方向の平面におけるクライオセクションヘミナクス
<ol><li>クライオスタットチャンバーを再び-20°Cに設定して、断面の厚さを30μmに変更します。 注:NMJ分析では、30-60 μmの間の組織厚を使用して、神経末端またはモータエンドプレート11,12,17の断片化を伴わずに喉頭筋内の複数の完全なNmJをキャプチャすることができます。</li>
	<li>TA筋肉のNMJ分析のための縦方向の声帯セクションを得るために、喉頭蓋がクライオスタットブレードに向き、気管腔が検体ディスクに向かって下向きになるように、試料をチャックに貼り付ける。</li>
	<li>甲状腺軟骨が現れるまで、検体頭部を100μm進めてOCT化合物をトリミングします。</li>
	<li>TA筋の層および内側の部分および内側の分裂が露出するまで、甲状腺の発症から30μmのトリムおよびトラックセクション。 注:縦方向の平面の喉頭のランドマークの5つのセットは、ターゲットTA筋肉に向かって組織の深さの進行を追跡することをお勧めします。 図3 は、10倍の倍率で縦方向の面における喉頭のランドマークを表しています。</li>
	<li>ターゲットTA筋肉に到達したら、30μmで正に帯電したスライドのセクションを収集します。</li>
	<li>4°CでPBSにセクションを保管し、汚れる準備ができるまで水分を保持します。</li>
</ol>

<ol><li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

神経筋解析のためのラットの声帯を準備すると、様々な課題を提示することができます。喉頭筋は軟骨に囲まれ小さいだけでなく、標的筋を直接抽出することが困難となり、喉頭解剖学的ランドマークの深部に動物間に高いばらつきも見られた。筋肉の断面平面プロトコルの場合、完全な声の折り目のセクションは、腹側甲状腺軟骨の最初の出現後に21-85セクション(1セクションあたり10 μm)の間に現れました。
各種類のプロトコルの組織の均一な埋め込み、配向、および断面にもかかわらず、喉頭のランドマーク間の距離に変動性が指摘された。さらに、体重の違いは、喉頭ランドマークの1セットから次のセットまでの組織深さの広い範囲の変動を考慮していなかった。喉頭のランドマーク間のこの距離の変動は、動物間の喉頭解剖学の個人差、解剖時のOCT化合物内のクリオマール内の喉頭の配向の小さな違い、または断面時に検体円盤に標本を配置した方法(すなわち、離れ取りまたは配置の差の差の前に検体に置かれたOCT化合物の量)に起因する可能性がある。
検体調製...

ラット喉頭は、発達、老化、疾患および薬理学的薬剤1,2,3,4,5に対する構造的および機能的な神経筋喉頭適応を調査するための確立されたモデルである。組織学的方法の一貫性は、筋肉の準備と分析に関与する複数の複雑さだけでなく、喉頭軟骨内にカプセル化された筋肉の喉頭の大きさ、形状、および地形に関連する課題があるので、この作業ラインに不可欠です1,6,7,8,9,10,11 .ラットの本来の喉頭筋のサイズが小さいため、系統的埋め込み、凍結、および凍結切断は、一貫した正確な結果を達成するために重要です。例えば、ラットの声帯をコロナ平面で切り離すとき、4つの内在性喉頭筋の神経筋接合(NJ)は、組織深度11の1.8mm未満以内に位置する。したがって、凍結切断中の喉頭筋解剖学の正確なモニタリングは、対象のセクションを正確に特定し、組織の過剰切除を防ぐことが不可欠です。ターゲット筋肉の過大な切断は、NMJs11の数と地形の不正確な識別をもたらすか、または目標筋肉がランドマークの向きの混乱のために廃棄された場合、サンプルサイズの全体的な減少をもたらす可能性があります12。喉頭筋の研究とそれぞれの適応の新しいモデルが開発される中で、結果が正確で信頼性が高く、研究全体で再現可能であることを保証するためには、標準的な手術手順が不可欠です。
本稿の目的は、最適な縦断および断面分析のためのラットの声の折り目の調製を詳述することです。当研究室で定期的に使用される詳細な方法は、凍結切断中に標的筋のランドマークを同定するために記述されています。同様の方法は複数の研究室で使用されていますが、初心者の研究者によって実装された場合に信頼性と正確なレプリケーションを確実にするために、文献よりも詳細な情報が提供されています。このチュートリアルの目的は、検査室と調査の一貫性を向上させるために、ラットの声帯の免疫組織化学(IHC)評価のための標準的な方法論を提供することです。

<table><tbody><tr><td>2-メチルブタン認定</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td>ルフィッシャーブランド</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>クライオトングSS</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td>ライ<td>カバイオシステムズ</td><td>CM3050</td><td></td></tr>クライ<tr><td>オスタットブレードCL</td><td>ターキー D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てベースモールド15mmx15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルアンダーパッド</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>解剖キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>冷凍切片 ミディアム</td><td>フィッシャーヘルスケア</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>ベルアート</td><td></td><td></td>11999054</tr><tr><td>免疫染色モイスチャーチャンバー</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>不織布スポンジ、4 プライ</td><td>クイック メディカル</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>オービタル シェーカー</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>パップ ペン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16% w/v aq. soln.、メタノールフリー</td><td>アルファ エーザー</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>プレミアム マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>試料保管バッグ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼目盛り測定32オンス/ 100ミリリットル</td>ポー<td>ラーウェア</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>タスクワイパー</td><td>キンバリークラークプロフェッショナル&トレード; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>バンナスパターンはさみ</td><td>Assi</td><td>ASSI。</td><td></td>SAS15RV</tr><tr><td>注:すべての消耗品について、これらは購入する機器の例です。私たちの方法を完成させるために、正確なモデルは必要ありません。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

神経筋解析のためのラット声帯の調製

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

このチュートリアルの目的は、神経筋の研究のためのラットの声の折り目の準備を説明することです。このプロトコルは、ラット喉頭解剖、フラッシュ凍結、および声帯の凍結切断の手順を概説する。本研究では、縦方向および断面面の両方で声を折るクライオセクションの方法を説明する。このプロトコルの目新しさは、本質的な喉頭筋の正確な同定を保証し、組織喪失の可能性を低減する、凍結切断中の喉頭追跡である。図は、両方の平面の進行性の凍結切断を示しています。29匹のラットヘミ喉頭は、甲状腺軟骨の出現から、完全な声の折り目を含む最初のセクションの出現まで、凍結切断され、追跡された。完全なボーカルフォールドは、両方の平面のすべての動物のために視覚化されました。甲状腺軟骨の出現から両方の平面におけるフルボーカルフォールドの出現までの距離には、高いばらつきがあった。体重は喉頭のランドマークの深さと相関しておらず、個々の変動性および組織製剤に関連する他の要因が、断面化中のランドマークの出現における高い変動性を引き起たす可能性があることを示唆した。本研究は、方法論を詳述し、組織化学的神経筋の調査のためにラットの声の折り目を準備するための形態学的データを提示する。個人の変動性が高いため、喉頭のランドマークは、組織および組織の損失を切除することを防ぐために、凍結切断中に密接に追跡する必要があります。ラット喉頭内のランドマークの適切な組織準備と意識を含む一貫した方法論の使用は、研究全体で一貫した結果を支援し、喉頭神経筋メカニズムを調査するためのモデルとしてラットボーカルフォールドを使用することに興味を持つ新しい研究者を支援します。

代表的な結果は、喉頭神経筋系における声の運動の影響に関する継続的な調査の一環であった。29匹の雄フィッシャー344/褐色ノルウェーラット(生後12匹、24ヶ月齢12匹)を計量し、CO2 吸入で安楽死させ、続いて両側性乳房離脱手術を行った。
手順は、NmJと側面および内側TA筋肉の繊維サイズにラベルを付けるために概説されたプロトコルに従った。喉頭のランドマーク間の距離は、喉頭筋と周囲の軟骨を使用して縦方向および断面の両方で追跡され、凍結切断中の進行を決定した(表1)。追跡は、両方の指向性面で甲状腺軟骨の最初の出現で開始されました。図2は、TA筋肉の内側と層状に現れる甲状腺(図2a、b)との時間的順序での断面の極性の断面の目印の出現を示す(図2c,d)。<strong class="xf...

このプロトコルは、検査用神経筋研究のためのラットの声の折り目を準備するために使用される方法を記述します。

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

このプロトコルは、最適な縦断的および横断的分析のためのラットおよび声帯の準備を容易にします。このプロトコルでは、凍結切片中の喉頭トラッキングを利用して、内在する喉頭筋を正確に特定し、組織損失の可能性を減らします。暴言喉頭は、発生、老化、疾患、および薬理学的因子に応答した神経筋喉頭の構造的および機能的適応を調査するための確立されたモデルです。このデモンストレーションは声帯の甲状筋に焦点を当てていますが、この方法論は他の内因性喉頭筋にも適用できます。ラット喉頭の解剖には、下顎骨から腹側頸部を剃り、露出した部分をアルコールで綿棒で拭いて、組織標本の毛皮汚染を防ぎます。ラットを10倍の倍率で解剖顕微鏡の下に置き、メスを使用して気管が露出するまで頸部の正中線を切開します。鉗子と鋭利な器具を使用して、正中線で腹側外因性喉頭筋を分離し、気管尾側を3番目の気管輪まで切断します。喉頭を切除するには、解剖ハサミを使用して、3番目の気管リングに尾側を切開し、舌骨に吻側を切開します。ピンセット、ピン、マイクロハサミを使用して、喉頭から食道、甲状腺、および外因性喉頭筋を取り出します。輪状突起後筋の間の正中線を目印として、マイクロハサミを使用して喉頭を披裂骨の間の背側に二等分します。喉頭の側壁をピンで固定して声帯を露出させ、マイクロハサミを使用して、声帯の前交連の間の甲状軟骨の正中線を通じて組織を腹側に二等分します。次に、各半咽頭をPBSで10秒間すすぎ、タスクワイパーで組織を繊細に乾燥させて、凍結中の氷の結晶形成を減らします。半咽頭組織を固定するには、4%ホルムアルデヒドとPBSを含む遠心分離管にサンプルを室温で1時間、眼窩シェーカーで毎分70回転で置きます。インキュベーションの終了時に、組織を新しい遠心分離チューブに移し、サンプルを新鮮なPBSで20分間3回すすぎます。最後の洗浄後、組織を摂氏4度の20%ショ糖5%グリセロール溶液を含む新しい遠心分離チューブに最大18時間移します。組織がチューブの底に沈んだら、声帯の内側表面がクライオモールドの底を向くようにして、声帯の内側がクライオモールドの開口部の下端に平行な声帯の長手方向の側面で、最適な切断温度媒体で満たされたクライオモールドにヘミリンパスを置きます。液体窒素で囲まれた鋼製ビーカーで冷やしたイソペンタンに沈めた組織を瞬間凍結し、各型をあらかじめラベル付けしたホイルで包み、マイナス80°Cで保存します。凍結した半咽頭組織サンプルの断面平面切片を取得するには、クライオスタットチャンバーを摂氏マイナス20度に設定し、切片の厚さを10ミクロンに設定します。組織サンプルをクライオスタットチャンバーに移し、追加の最適温度切断媒体を使用して、腹側甲状軟骨をクライオスタットブレードに、アリテノイド軟骨を検体ディスクに向け、1つの埋め込み組織サ

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

テクニックは運動中に哺乳類の神経細胞の生体内生理的反応の定量化と神経形態、神経化学的表現型とシナプス超小型回路とニューロンの生理学を相互に関連付ける説明されています。...

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

合成声帯モデルを製造するための方法論が説明されています。モデルは等身大であり、人間の声帯の多層構造を模倣する。結果は、モデルは肺の圧力に匹敵する圧力で自己発振し、人間の声帯に似ている流動誘起振動応答を示すことを示しています。...

合成、マルチレイヤ、自己発振声帯モデルの作製

出典: Andreatta, RD et al., 浸透圧ポンプまたは直接筋肉注射を使用した皮下ニューロトロフィン 4 注入は老化したラットの喉頭筋を強化します。J. Vis. 経験。 (2017年)このビデオは、加齢に伴う除神経と神経筋接合部の減少によって影響を受ける喉頭筋機能を回復するために、高齢ラットモデルにニューロトロフィン 4 (NTF4) を注入することを示しています。NTF4...

高齢ラットにおける喉頭神経再生のためのニューロトロフィン4注入

嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚ニューロンの成長を可能にする神経堤細胞である。この特定のプロパティは、細胞移植のために使用することができる。ここでは喉頭神経損傷モデルでたOECの使用に基づいて細胞移植のモデルを提示。...

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

呼吸不全は、子宮頸部脊髄損傷後の死亡の主要な原因である。部分的な頚椎損傷によって誘発される呼吸不全の、再現性の定量化、および信頼性の前臨床動物モデルを持つことは、その後の呼吸器および非呼吸神経可塑性を理解するのに役立つと推定される補修戦略をテストすることができます。...

ポスト病変呼吸神経可塑性を研究するための子宮頸脊髄損傷のマウスモデル

ここでは、ラットの老化喉頭筋をリモデリングするために、ニューロトロフィン4（NTF4）の使用を全身的かつ直接的に記述するためのプロトコールを提示する。...

浸透圧ポンプまたは直接的筋肉注射を用いる皮下ニューロトロフィン4注入は、老齢ラット喉頭筋を増強する

我々は、舌の筋緊張および粘弾性を決定するための麻酔したラットモデルにおける外科的処置を記載する。この手順は、舌下神経の特異的刺激、および受動的リサージュ力/変形曲線の筋肉への適用を含む。...

ラット舌の機械的および粘弾性的特性のインビボ評価

このプロトコルは、マウスおよびラットの連続経口喉頭鏡検査アプローチについて説明しており、最適化された麻酔レジメンと微調整された内視鏡操作技術を使用して、呼吸および嚥下中の喉頭のクローズアップ、遮るもののないビデオイメージングを可能にします。...

呼吸および嚥下中の喉頭運動のクローズアップイメージングのための低侵襲マウス喉頭鏡検査

この研究では、ラットのダイヤフラム運動ユニットの接続性を定量化するために、運動ユニットの数とサイズを推定するための in vivo 法を紹介します。これらの手法に対する段階的なアプローチについて説明します。...

横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価

実験室でのラットおよびマウスの超音波発声(USV)は、発声および神経機能の研究に役立ちます。このプロトコルは、交尾関連の交絡を伴わずに食欲的なUSVを確実に誘発するフード報酬パラダイムを記述しています。動物の条件付け、刺激提示、記録、音響解析を詳細に扱い、感情動機付けおよび頭蓋感覚運動機能の再現可能な研究方法を提供します。...

実験ラットおよびマウスにおける食欲的超音波発声の予期的食糧報酬誘発

学ぶラット声帯の調製法を神経筋解析のため。凍結切片技術を用いて甲状披裂筋などの喉頭筋構造を正確に同定し、発達・加齢・疾患に伴う神経筋適応を組織学的に評価する。

神経筋解析のためのラット声帯の調製

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