Name: Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez la biopsie liquide non invasive pour isoler l'ADN circulant libre du plasma sanguin de patients atteints de cancer. Cette méthode permet de surveiller la progression tumorale et d'identifier les mutations.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de génomique du cancer et de bioincompétation des maladies complexes pour leurs contributions observationnelles et leur participation à de multiples discussions à différentes étapes de ce projet. Le soutien financier comprend l’Association israélienne contre le cancer (subvention de l’ICA pour M.F-M 2017-2019) et la subvention Kamin de l’Autorité israélienne de l’innovation (pour M.F-M.).

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La collecte du sang d’un patient dans un tube, l’expédition et le stockage sont des étapes initiales cruciales dans la biopsie liquide. Une mauvaise manipulation peut nuire à la qualité du plasma et, par conséquent, peut interférer avec les résultats de la biopsie liquide47. Si un échantillon de sang est prélevé dans un tube sanguin EDTA, le plasma doit être séparé dans les deux heures suivant la collecte de sang afin d’éviter la lyse des CWB et la libération de son ADN génomique dans le plasma<su...

Les progrès technologiques ont conduit au séquençage de centaines de génomes de cancer et transcriptomes1. Cela a contribué à comprendre les paysages des changements moléculaires entre les différents types de cancer2. D’autres études sur ces paysages ont contribué à caractériser les altérations somatiques séquentielles et les fusionsgène-gène 3 qui sont impliquées dans le cancer ou la progression tumorale, en perturbant périodiquement les voies d’apoptose4. Par conséquent, les mutations somatiques et les fusions gène-gène peuvent fournir l’information au sujet des tumeurs en servant de biomarqueurs dans les patients individuels pour un type particulier de tumeur5,identifiant le pronostic primaire existant de tumeurs6,catégorisant des tumeurs secondaires basées sur des changements moléculaires7,et identifiant des cibles de tumeur druggable8. Ces informations peuvent faciliter la sélection d’un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancer et dans la détermination des réponses positives et négatives autraitement 9. Cependant, obtenir le matériel de tumeur pour identifier le profilage génomique du tissu de tumeur est une procédureenvahissante 10. En outre, une biopsie de tumeur comprend seulement une petite partie d’une tumeur hétérogène ; et peut, par conséquent, ne pas être représentatif pour le profil moléculaire de la tumeur entière11. La surveillance périodique et le génotypage de tumeur exigent une collection répétée des tissus de tumeur, qui, habituellement, n’est pas faisable en raison de l’invasivité de la procédure de biopsie de tumeur et des issues de sûreté qui découlent de telles procédures12.
La technique de biopsie liquide, d’autre part, a gagné l’attention énorme dans l’oncologie de précision au cours dela dernière décennie 13,14. Elle est principalement due à la non-invasiveness de cette technique, et à la possibilité qu’elle soit répétée à plusieurs moments, permettant ainsi une technique de surveillance facile à utiliser et sûre pour les coursde la maladie 15,16. La biopsie liquide est basée sur un phénomène que les cellules tumorales se multiplient rapidement, et simultanément beaucoup d’entre elles subissent l’apoptose et la nécrose. Ceci mène à la libération des débris apoptotiques de cellules dans le sang des patients, avec les fragments d’ADN qui sont coupés à des tailles précises pendant l’apoptose17. L’apoptose des cellules non cancéreuses conduit également à la libération de ses débris cellulaires dans le sang, cependant, le taux d’apoptose dans ces cellules est relativement beaucoup plus faible que les cellules tumorales18. Le rationnel de la technique de biopsie liquide est de capturer les molécules tumeur-associées telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, et les cellules de tumeur14,19 qui circulent continuellement dans le sang. Diverses techniques20 peuvent être utilisées pour l’analyse de ces molécules, y compris le séquençage de prochaine génération (NGS), la réaction en chaîne de polymése de gouttelette numérique (DdPCR), le PCR en temps réel et l’essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA). La technique de biopsie liquide permet d’identifier les biomarqueurs qui sont des caractéristiques des cellules tumorales. Ces molécules de biomarqueur ne sont pas seulement libérées des parties spécifiques d’une tumeur, mais plutôt de toutes les parties de latumeur 21. Par conséquent, les marqueurs identifiés dans la biopsie liquide représente le profilage moléculaire d’une tumeur hétérogène entière, en plus d’autres tumeurs dans le corps, ayant ainsi des avantages au-dessus de la technique basée sur la biopsie de tissu22.
Le cfDNA a une courte demi-vie dans le sang circulant allant de quelques minutes à 1-2 heures23. Cependant, le temps court de demi-vie de cfDNA facilite des analyses en temps réel en évaluant la réponse de traitement et les évaluations dynamiques de tumeur. Les niveaux de cfDNA tumeur-dérivés indiquent le pronostic du stade/taille de tumeur démontré par plusieurs études, qui ont montré une relation entre des niveaux de cfDNA et les résultats de survie24. En outre, les études ont prouvé que le cfDNA a une meilleure capacité de prévision que les marqueurs de tumeur existants25. Le pronostic de cfDNA est encore plus prononcé après traitement de cancer, les niveaux plus élevés de cfDNA suivant le traitement corrélé bien avec un taux réduit de survie, et la résistance au traitement. Attendu que les niveaux inférieurs de cfDNA suivant la thérapie correspondent généralement à la réponse positive de traitement. En outre, l’ADNfc facilite la détection précoce de la réponse au traitement que les méthodes de détection traditionnelles.
Le cfDNA augmente la possibilité de détection précoce des mutations associées au cancer : pendant la maladie à un stadeprécoce 15,l’apparition des symptômes26 et avant le diagnostic du cancer jusqu’à 2ans 27. Comme cfDNA est libéré de plusieurs régions tumorales ou foyers, son analyse fournit une vue complète du génome tumoral qu’il représente28. Par conséquent, le cfDNA permet de détecter des mutations somatiques qui auraient pu être manquées dans les échantillons de tissu29. Comme l’hétérogénéité intra-tumorale et les mutations subclonales peuvent être détectées par séquençage profond des régions génomiques couvrant des milliers de bases, d’où l’analyse de la CFDNA permet de découvrir des sous-types moléculaires spécifiques avec des signatures génomiques distinctes13. Pour obtenir un niveau similaire d’information par l’échantillon de tissu beaucoup de biopsies pleines aurait été nécessaire.
En outre, les niveaux de cfDNA dans les patients présentant une maladie localisée telle que le cancer du côlon, de l’ovaire, et du poumon après un traitement chirurgical et/ou une chimiothérapie, ont démontré pour être un marqueur pronostique puissant pour la répétition de cancer et les résultats detraitement 20. En outre, dans les patients présentant le cancer du côlon, du sein, et du poumon, les analyses de cfDNA du sang pourraient avec succès détecter les changements tumeur-spécifiques, qui ont mené à la prévision précise de répétition plusieurs mois àl’avance 13. En outre, les marqueurs de résistance au traitement, tels que les mutations KRAS chez les patients atteints de CRC recevant une thérapie anti-EGFR30; VAFs pour des gènes tels que PIK3CA, MED1 ou EGFR chez les patients atteints de cancer du sein après le traitement avec diverses thérapies31; et la mutation de résistance d’EGFR T790M dans les patients de cancer du poumon traités avec EGFR-ciblés TKIs32 peut également être identifiée par l’analyse de cfDNA.
En résumé, l’analyse cfDNA peut être utilisée pour identifier des biomarqueurs précis dans le domaine de l’oncologie13,33. Dans ce protocole, des échantillons de sang de 3 patients de glioma et de 3 contrôles sains ont été traités pour obtenir l’ADN génomique des WBCs et cfDNA du plasma. Dans le cancer de gliome, les mutations dans IDH, TERT, ATRX, EGFR, et TP53 sert de marqueurs diagnostiques aussi bien que pronostiques qui peuvent aider dans le diagnostic tôt des tumeurs de glioma, classant différents types de tumeurs de glioma, guidant le traitement précis pour le patient individuel et comprenant la réponsede traitement 34,35. L’état mutationnel de ces gènes peut être identifié à l’aide de cfDNA dérivé du sang. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé de cfDNA plasma-dérivé qui a été employé pour étudier des changements mutationnels dans le cancer de gliome12. Un tel protocole de biopsie liquide basé sur cfDNA expliqué dans cet article peut être employé pour étudier des changements mutationnels dans beaucoup d’autres types de cancers. En outre, une étude récente a montré que la biopsie liquide à base de cfDNA peut détecter 50 différents types de cancers36.
La collecte, l’entreposage et l’expédition d’échantillons de sang sont des étapes cruciales de ce protocole, car la température incontrôlée pendant ces étapes provoque la lyse desWBCs, conduisant à la libération de l’ADN génomique du WBC dans le plasma et causant la contamination de l’échantillon cfDNA, qui affecte le reste de laprocédure 37. L’hémolyse due à une température incontrôlée peut nuire aux processus de préparation de l’échantillon en aval de cfDNA, tels que les étapesPCR 38. Le sérum contient une proportion élevée de germline cfDNA plutôt que de plasma, bien qu’il présente un grand bruit de fond pour cfDNA39 tumeur-associé. Par conséquent, pour isoler cfDNA tumeur-associée, le plasma est un échantillon approprié39. Le sang prélevé dans un tube anticoagulant contenant du sang doit être centrifugé immédiatement ou dans un délai de deux heures, afin de séparer le plasma et d’éviter la contamination par l’ADNfc. Dans ce protocole, des tubes commerciaux dédiés de collecte de sang de conservation de cfDNA sont employés (voir tableau des matériaux),qui sont une alternative à l’anticoagulant contenant des tubes de collecte de sang. Ces tubes dédiés à la collecte de sang préservent l’ADNfc et l’ARNfc, et empêchent la lyse des CCB jusqu’à 30 jours à température ambiante, et jusqu’à 8 jours à 37 °C. Cela facilite le maintien de la température appropriée lors d’une expédition d’échantillons de sang et jusqu’à ce que le plasma et wbc sontséparés 40.
Il existe actuellement trois types de méthodologies d’extraction cfDNA : l’isolement de phase, la colonne de spin à base de membrane de silicium et l’isolement magnétique à basede perles 41. La méthode de colonne de spin à base de silicium-membrane a donné une grande quantité de cfDNA avec l’intégrité élevée comparée à d’autres méthodes d’extraction de cfDNA42.
L’évaluation quantitative de l’ADN est une exigence fondamentale dans la biopsie liquide, il est nécessaire de développer une procédure simple, abordable et standardisée pour leur mise en œuvre facile et leur utilisation à grande échelle. Trois méthodes couramment utilisées pour la quantification de cfDNA sont spectrophotométriques, fluorimétriques, et qPCR. La méthode fluorimétrique s’avère meilleure que les autres méthodes concernant l’exactitude, le coût et la facilité de conducttion43.
L’intégrité et la pureté de la cfDNA peuvent être estimées soit par électrophoresis agarose ou électrophoresis capillaire. L’électrophoresis d’Agarose ne montre ni sensibilité à la faible concentration de cfDNA ni à haute résolution pour montrer la taille précise de fragment de cfDNA. D’autre part, l’électrophorèse capillaire a un avantage sur l’électrophoresis agarose en surmontant les défis associés et, par conséquent, largement utilisé par les chercheurs pour l’analyse de la taille des fragments cfDNA. Dans ce protocole, la distribution de la taille des fragments de cfDNA isolé a été estimée à l’aide d’un instrument automatisé d’électrophoresis capillaire (voir tableau des matériaux).

<table><tbody><tr><td>2100 Instrument de bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>G2939BA</td><td>Le système de bioanalyseur 2100 est un outil d’électrophorèse automatisé établi pour le contrôle de la qualité des échantillons de biomolécules.</td></tr><tr><td>Clip réglable pour station d’amorçage</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5042-1398</td><td>Utilisé en combinaison avec une seringue pour appliquer une pression définie pour l’amorçage des puces.</td></tr><tr><td>Kit d’ADN haute sensibilité Agilent</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5067-4626</td><td>Les tests d’ADN à haute sensibilité sont souvent utilisés pour le contrôle de la qualité des échantillons pour les banques de séquençage de nouvelle génération</td></tr><tr><td>: cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td><td>, Norgen Biotek Corp.</td><td>63950</td> Les <td>tubes de conservation de l’ADN-cf/ARNcf de Norgen sont des tubes en plastique fermés et sous vide pour la collecte et la préservation de l’ADN-cf, de l’ADN tumoral circulant, de l’ARN-cf et des cellules tumorales circulantes dans des échantillons de sang total humain pendant le stockage et</td></tr><tr><td>l’expédition</td><td>.</td><td>5065-4401</td><td>Utilisé pour charger une matrice de gel dans une puce avec une seringue fournie avec chaque kit de dosage, utilisé pour les dosages d’ARN, d’ADN et de protéines. Comprend une station d’amorçage, un chronomètre et 1 pince à seringue</td></tr><tr><td>Kit de nettoyage d’électrode</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-9951</td><td>Empêche la contamination croisée. Élimine les contaminants bactériens ou protéiques des électrodes.</td></tr><tr><td>Filtres pour matrice de gel</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>185-5990</td><td>Utilisé pour le mélange correct du concentré de colorant d’ADN et de la matrice de gel d’ADN</td></tr><tr><td>IKA Basic Chip Vortex</td><td>IKA-Werke GmbH & Co. KG</td><td>MS-3-S36</td><td>Utilisé pour le mélange correct de l’échelle d’ADN et de l’échantillon d’ADN sur les puces de dosage Bioanalyzer</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue kit</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td>Avec le kit NucleoSpin Tissue, l’ADN génomique peut être préparé à partir de tissus, de cellules (par ex. bactéries), et bien d’autres sources.</td></tr><tr><td>QIAamp (en) (en</td>) <td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Le kit d’acides nucléiques circulants QIAamp permet une purification efficace de ces acides nucléiques circulants à partir de plasma ou de sérum humain et d’autres fluides corporels acellulaires.</td></tr><tr><td>Collecteur à vide QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Le collecteur à vide QIAvac 24 Plus est conçu pour le traitement sous vide des colonnes QIAGEN en parallèle.</td></tr><tr><td>Système de raccordement QIAvac</td><td>Qiagen</td><td>19419</td><td>En combinaison avec le système de raccordement QIAvac, le collecteur d’aspiration QIAvac 24 Plus peut être utilisé comme système à flux continu. Le flux d’échantillons, contenant des matières potentiellement infectieuses, est collecté dans une bouteille de déchets séparée.</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Le fluorimètre Qubit 2.0 est un instrument analytique facile à utiliser conçu pour fonctionner avec les dosages Qubit pour la quantification de l’ADN, de l’ARN et des protéines.</td></tr><tr><td>Tubes de dosage</td><td>Qubit Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td> Les <td>tubes de dosage Qubit sont de 500 & micro ; L tubes en polypropylène à paroi mince à utiliser avec le fluorimètre Qubit.</td></tr><tr><td>Kit de dosage Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Le kit de dosage Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) est spécialement conçu pour être utilisé avec le fluorimètre Qubit. Le test est hautement sélectif pour l’ADN double brin (ADNdb) par rapport à l’ARN et est conçu pour être précis pour les concentrations initiales d’échantillons à partir de 10 pg/&micro ; L à 100 ng/&micro ;L.</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>Qiagen</td><td>84010</td><td>utilisée pour le traitement sous vide des colonnes</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> QIAGEN <tr><td><fort>Divers</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Tubes <td></td><td></td><td></td>à <td>centrifuger de 50 ml</td></tr><tr><td>Glace</td><td></td><td></td><td></td>pilée</tr><tr><td>Éthanol (96&ndash ; 100 %)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant ou similaire à 56 &deg ; C (capable de contenir des tubes de prélèvement de 2 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (100 %)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (réglable)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette stériles (les pointes de pipette avec barrières anti-aérosols sont recommandées pour aider à prévenir la contamination croisée)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie ou bloc chauffant capable de contenir des tubes de centrifugation de 50 mL à 60 &deg ; L</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection de l’adn sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

L’identification des mutations dans les tumeurs des patients cancéraux est une étape très importante dans la gestion de la maladie. Ces mutations servent de biomarqueurs pour le diagnostic tumoral ainsi que pour la sélection du traitement et sa réponse chez les patients atteints de cancer. La méthode actuelle d’étalon-or pour détecter des mutations de tumeur implique un essai génétique de l’ADN de tumeur au moyen des biopsies de tumeur. Cependant, cette méthode envahissante est difficile à effectuer à plusieurs reprises comme essai de suivi du répertoire mutationnel de tumeur. La biopsie liquide est une technique nouvelle et émergente pour détecter les mutations tumorales comme approche de biopsie facile à utiliser et non invasive.
Les cellules cancéreuses se multiplient rapidement. En parallèle, de nombreuses cellules cancéreuses subissent une apoptose. Les débris de ces cellules sont libérés dans le système circulatoire d’un patient, ainsi que des morceaux d’ADN finement fragmentés, appelés fragments d’ADN sans cellules (CFDNA), qui portent des mutations de l’ADN tumoral. Par conséquent, pour identifier les biomarqueurs basés sur cfDNA utilisant la technique liquide de biopsie, des échantillons de sang sont rassemblés des patients cancéraux, suivis de la séparation du plasma et du manteau buffy. Ensuite, le plasma est traité pour l’isolement de cfDNA, et la couche buffy respective est traitée pour l’isolement de l’ADN génomique d’un patient. Les deux échantillons d’acide nucléique sont ensuite vérifiés pour leur quantité et leur qualité; et analysé pour les mutations à l’aide de techniques de séquençage de prochaine génération (NGS).
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé pour la biopsie liquide, y compris la collecte de sang, le plasma, et la séparation buffy de manteau, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Séparation plasmatique Le sang de 8,5-9 mL recueilli dans les tubes de conservation cfDNA ou cfRNA donne environ ~4 mL de plasma en volume. Le volume de plasma séparé du sang recueilli dans les tubes EDTA peut varier en fonction de la température. L’exposition de tubes EDTA contenant du sang à une température supérieure à 37 °C entraîne une diminution du volume plasmatiquede rendement 44.
Résultats de l’analyse fluoromètre La conc...

Dans cet article nous présentons un protocole détaillé pour la technique non invasive de biopsie liquide, y compris la collecte de sang, la séparation de manteau de plasma et de buffy, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

La biopsie liquide à l’aide d’ADN acellulaire peut identifier les mutations et les fusions tumorales pour potentiellement diagnostiquer le type de tumeur et sa réponse médicamenteuse. Contrairement à la biopsie tissulaire, la biopsie liquide à base d’ADN acellulaire offre une approche non invasive qui peut être effectuée plusieurs fois pour surveiller la progression de la maladie cancéreuse. Pour isoler l’ADN acellulaire circulant à partir d’un échantillon de plasma de patient, ajoutez 100 microlitres de protéinase K et 800 microlitres de tampon de lyse complétés par un microgramme d’ARN porteur à un millilitre de plasma de patient.Pulsez soigneusement la solution pendant 30 secondes avant de l’incuber pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez 1,8 millilitre de tampon de liaison dans le tube et mélangez soigneusement avec 15 à 30 secondes de vortex pulsé. Après une incubation de cinq minutes sur de la glace, insérez une colonne à membrane de silice dans un appareil à vide relié à une pompe à vide et insérez fermement un prolongateur de tube de 20 millilitres dans la colonne ouverte pour éviter les fuites d’échantillon.À la fin de l’incubation, versez

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Analyse automatisée de la distribution de la taille des fragments d’ADN de cf basée sur l’électrophorèse capillaire : une méthode basée sur une micropuce d’ADN pour étudier la distribution de la taille de fragments d’ADN isolés à partir de biofluides

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Cell-gratuit Analyse d&#39;intégrité de l&#39;ADN dans des échantillons d&#39;urine

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