Name: 循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶ 循環腫瘍細胞株の樹立と3D培養法、転移性大腸がん患者由来のCTCを用いた薬剤スクリーニングとin vivo実験。個別化医療とがん研究の両方に活用可能な革新的モデルです。

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パンヌキン研究室でのこの研究プロジェクトは、SIRICからの研究助成金によって支援されました: グラント « INCa-DGOS-Inserm 6045 » .ギヨーム・ベルトィエとゼイナブ・ホマイドの博士課程は、抗がんリーグ/リーグ・コントル・ル・ガンによって支えられました。セリーヌ・ブークリエの給与は「地域オクシタニー」によって資金提供されました。英語編集のためのジュリアン・ヴァナブルズに感謝します。

すべての生体内プロトコルは、動物倫理機関によって承認されました。
1. 3D培養条件におけるCTC増幅
<ol><li>懸濁液中のCTCを培養するには、超低添付着物(ULA)24ウェルプレートのウェル内の第1シードCTCを5細胞/μLの最大濃度で、M12培地の1mL(すなわち、 高度なDMEM-F12は、2 mM l-グルタミン、100単位/mLペニシリンおよびストレプトマイシン、N2サプリメント、20 ng/mL表皮成長因子および10 ng/mL芽線維増殖因子10を添加した。</li>
	<li>球体形成と細胞増殖を可能にするために、細胞を低酸素状態(2%O2)で6~10日間インキュベートする。</li>
	<li>球体が十分な大きさ(100 μm)になったら、壊死を防ぐために、増幅のためにそれらを解約する。<ol>
<li>細胞懸濁液を2mLチューブまたは15mLチューブに入れ、遠心分離機を300xgで5分間置きます。</li>
		<li>上清を取り除き、ペレットに500μLの穏やかな解離試薬(例えば、Accumax)を加えます。</li>
		<li>37°Cで20~30分間穏やかな解離試薬で細胞懸濁液を穏やかにインキュベートします。 注:穏やかな解離試薬(Accumax)でインキュベーション時間を超えると、細胞死亡率が異常に増加する可能性があります。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1.5mLを加え、300 x gで5分間チューブを遠心分離します。</li>
		<li>上清を注ぎ、新鮮なM12培地でペレットを再懸濁して、μL当たり1〜5細胞の密度に達します。</li>
		<li>超低い付着プレートの新しいウェルに細胞懸濁液をシード:T75フラスコ用10mL、6ウェルプレート用2mL、96ウェルプレートの場合は100 μL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CTC球部における免疫蛍光(IF)染色
<ol><li>CTCの遠心分離機は、300 x gで15 mLチューブに5分間、上清を吸引し、ペレットをPBSで2回洗浄します。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500 μLでペレットを再懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。懸濁液を300xgで遠心分離し、5mLのPBSで2回洗浄する。</li>
	<li>ペレットを熱く液体ヒストゲル(すなわち、15~20 μL)で再懸濁します。ピペットで、すべての懸濁液を取り、4°Cで予冷した表面に液滴を作り、5〜10分間重合させます。 注:先端に懸濁液の重合を避けるために速く働きます。</li>
	<li>メスの刃で固体液滴を取り外し、コンパートメント埋め込みカセットに挿入します。</li>
	<li>パラフィン含有、パラフィン切裂、切除、抗原検索および抗体インキュベーションの手順を実行します。これらのステップは、パラフィンに埋め込まれた任意の腫瘍または器官と同様であり、免疫蛍光染色12のために処理される。 注:カセットは、パラフィン埋め込みまで4°Cで70%エタノールに保存することができます。</li>
</ol>3. 細胞測定分析
<ol><li>遠心CTCは300 x gで15mLチューブに5分間球を入れ、ペレットをPBSで2回洗浄します。</li>
	<li>上清を吸引し、ペレットに穏やかな解離試薬の500 μLを加えます。</li>
	<li>37°Cで20~30分間穏やかな解離試薬で細胞懸濁液を穏やかにインキュベートします。 注:穏やかな解離試薬(Accumax)のインキュベーションの40分を超えると、異常な細胞死亡率の増加をもたらす可能性があります。</li>
	<li>遠心分離細胞懸濁液を300xgで5分間、上清を除去し、ブロック緩衝液の5mL(すなわち、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を有するPBS)の中にペレットを再懸濁させる。</li>
	<li>40 μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を通過し、残りの球を除去します。</li>
	<li>計数後、200,000個の細胞を3つの蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブに入れ、遠心分離機を300xgで5分間入れ、上清を取り除きます。3つのFACSチューブのうちの1つを、染色試薬を受け取らないコントロールとして使用してください。</li>
	<li>データシートによれば、残りの2つのFACSチューブに適切な抗体を加える(すなわち、目的のタンパク質に対する1つの共役抗体、1つの共役アイソタイプ対照)。</li>
	<li>推奨インキュベーション時間の後、ブロッキングバッファーの300 μLを加えて細胞を洗浄し、3管を300 x gで遠心分離し、上清を吸引します。この手順を 2 回繰り返します。次いで、細胞生存性染色試薬を用いてブロッキング緩衝液を用いてペレットを再懸濁する(染色を行わないFACSチューブ制御を除く)。</li>
	<li>FACS分析までチューブを氷の上に置いてください。細胞生存率と抗体染色のためのゲートを識別するために、染色せずに最初のチューブを使用してください。次に、FACSチューブを対象のタンパク質に対して共役抗体で分析し、目的のタンパク質を発現するCTCの割合を定量化する。共役アイソタイプ制御を有するFACSチューブは、シフトを示すべきではない。これは、シフトが対象の標的タンパク質に特異的であることを確認します。 注:可能であれば、目的のタンパク質の高レベルを発現する細胞株を陽性対照として使用し、陰性対照としてタンパク質を発現しない細胞株を使用してください。</li>
</ol>4. 発光の生存率アッセイ(セルテイヤーグロ)
<ol><li>M12 メディアで解離された CTC (セクション 1.4.5 で説明) を再中断します。細胞を数え、細胞濃度を200,000細胞/mLに適応させます。</li>
	<li>ULA 96ウェルプレートでは、種子10,000の解約CTC(1ウェルあたり50μL)で、低酸素(2%O2)でプレートを24時間インキュベートします。</li>
	<li>翌日、CTCに50μLの試験薬を添加する。薬物濃度の滴定を行い、半最大阻害濃度(IC50)を決定することが推奨される。基礎細胞の生存率を決定するためだけに車両でいくつかの井戸を扱います。 注: シードされるセルの数は、CTC ラインの間で、倍の時間によって異なる場合があります。また、結果の変動を最小限に抑えるために、細胞を三量体で播種する必要があります。</li>
	<li>さらに48時間低酸素下のプレートをインキュベートする。</li>
	<li>3日目に、培養プレートと発光細胞の生存率バッファーと基板を室温に置き、メーカーのプロトコルに従って、適切な量のバッファーで基板を再構成する。</li>
	<li>各培養プレートに70μLの発光生用混合を加えます。プレートを軌道シェーカーに20分間置いて細胞のリシスを誘導し、100 μLの混合を不透明な壁面のマルチウェルプレートに移し、照明メーターと互換性があります。</li>
	<li>プレートを室温で休ませ、発光信号を安定させるためにアルミホイルで覆います。 注:発光信号は3時間まで安定しています。</li>
	<li>マイクロプレートリーダー(テカン無限200 Pro)を使用して発光を記録します。</li>
	<li>データ解析では、条件ごとに相対光単位 RLU の三重化の平均を計算します。必要な各薬剤濃度に応じた生存率の割合を評価するには:(未処理細胞の処理細胞/RLUのRLU)x 100。</li>
</ol>5. 皮下注射
<ol><li>マイクロ遠心チューブで、100 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁します。注入された細胞の数が少ない場合、細胞を1:1 PBS/Matrigelで再懸濁し、増殖因子で減少させ、細胞を一緒に濃縮し、腫瘍開始を促進する。 注:細胞密度は、科学的な質問と実験の目的に応じて、10個の細胞(腫瘍開始能力に挑戦する)から100万個の細胞までであり得る。</li>
	<li>インスリン注射器でフルボリュームを引き上げる。</li>
	<li>免疫欠乏マウスで、インデックスと薬指の間の側面の皮膚をつまみ、皮膚の基部に針をそっと挿入します。 注:この手順は痛みがなく、意識的なマウスで行われます。</li>
	<li>細胞の広がりを防ぐために、同じ場所にゆっくりとボリュームを注入します。これは、皮膚の下に小さなブレブを作成します。</li>
	<li>注入部位に穏やかな圧力をかけ、体積の逆流を防ぎます。</li>
	<li>1日おきに、キャリパーを使用して腫瘍の成長を監視する。</li>
	<li>腫瘍が1500mm3を超える場合は、動物を犠牲にする。材料の可用性に応じて、二酸化炭素または麻酔ガス吸入または頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。</li>
</ol>6. 脾臓内注射
<ol><li>開始する前に、手術器具(はさみと鉗子)を124°Cで15分間オートクレーブし、70%エタノールで作業スペースのすべての表面を清掃してください。</li>
	<li>マイクロ遠心チューブでは、50 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁し、氷の上に保管します。細胞密度は0.5から100万の細胞に行くことができます。より多くの細胞が血行に血栓の発達を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>細胞を注入する前に、痛みを軽減するために、0.015 mg/mLブプレノルフィンを皮下に100μL注入します。</li>
	<li>イオブルランが3%で維持される誘導室にマウスを2〜3分間置きます。動物が動きに反応しなくなったら、加熱パッドの右側に置き、O2 とイソフルランのガス混合物を送達する呼吸回路フェイスマスクを使用して麻酔を維持します。</li>
	<li>手術中の眼の乾燥を避けるために、各目の上に目の潤滑剤を塗布してください。ポビドネ-ヨウ素溶液(すなわちベタジン)で胸部領域を消毒する。</li>
	<li>ドーソベントラル側で、10番目の偽の肋骨の下のはさみを使用して0.5cmの小さな切開を行います。</li>
	<li>脾臓をそっと持ち上げ、滅菌ガーゼの上に置きます。インスリン注射器を使用して、脾臓の先端に50μLのCTCを注入する。シリンジを直立状態に保ち、3~5分待って逆流を防ぎ、針を外します。</li>
	<li>両側(動脈と静脈)から脾臓の血管をリゲートし、2つの合字の真上を切断することによって脾臓を取り除きます。脾臓は、この器官の不要な腫瘍形成を防ぐために除去される。</li>
	<li>腹部腹膜を縫い合わせ、5.0分解性の無菌縫合糸を使用して皮膚をステッチします。</li>
	<li>麻酔から完全に回復するまで、マウスを暖かく保ちます。</li>
	<li>異常な身体機能、異常な動きや姿勢、体重減少のために週3日マウスを監視します。</li>
	<li>ヒトの終点が到達したときに動物を犠牲にする (手術後約 6 週間) 肝臓転移を分析します。.</li>
</ol>

<ol><li>Wittekind, C., Neid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and metastasis.</a> Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).</li>
<li>Eger, A., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%3A+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of epithelial-mesenchymal transition.</a> Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).</li>
<li>Palmirotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+of+cancer%3A+a+multimodal+diagnostic+tool+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).</li>
<li>Hong, B., Zu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circulating+tumor+cells%3A+current+challenges+and+new+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends.</a> Theranostics. 3, 377-394 (2013).</li>
<li>vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+in+the+isolation+and+analysis+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells.</a> Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+diagnostic+value+of+circulating+tumor+cells+with+CytoSorter%C2%AE+CTC+capture+system+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer.</a> Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+circulating+tumor+cells+and+tumor+response+in+colorectal+cancer+patients+treated+with+chemotherapy%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis.</a> BMC Cancer. 14, 976(2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cell+Clusters+are+Oligoclonal+Precursors+of+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis.</a> Cell. 158, 1110-1122 (2014).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66, 1802-1810 (2017).</li>
<li>Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Colorectal+Cancer+in+Differentially+Established+Liver+Metastasis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models.</a> Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).</li>
<li>Giraud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progastrin+production+transitions+from+Bmi1%2B%2FProx1%2B+to+Lgr5high+cells+during+early+intestinal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis.</a> Translational Oncology. 14, (2020).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10, 0138032(2015).</li>
<li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system%3A+the+clinician%27s+guide+to+breast+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment.</a> Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).</li>
<li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic%2C+marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Science Translational Medicine. 5, (2013).</li>
</ol>

著者らは開示する競合する利益を持っていません。

上述のプロトコルは、最初は大腸CTC機能特性評価に使用されたが、乳癌などの他のタイプの癌に使用することができ、マウスモデルに適応することができる。
実際の制限要因は、血液サンプルに存在するCTCの数と、それらを分離および拡大するために使用される技術の効率です。いくつかのCTC分離技術は、Parsortixのような特定のCTC特性に基づいて記述されている、マイクロ流体デバイスは、細胞サイズとその圧縮性13に基づいてCTCの分離を可能にする。さらに、EpCAMおよびサイトケラチン8/18/19 14などの陽性上皮マーカー標識と組み合わせた汚染性のリンパ球を排除するために、陰性CD45標識に基づいて血液サンプル中のCTCを列挙する唯一のFDA承認の方法である免疫ビーズベースのアッセイであるCellSearchがある。iChipは別のサイズベースの技術ですが、それはまた、EpCAMベースの正の選択またはCD45負の枯渇15、16</sup...

早期癌診断および治療戦略における最近の改善にもかかわらず、癌罹患率の90%以上は転移によるものである。転移過程は、原発腫瘍からの細胞の局所剥離と、それらが循環腫瘍細胞(CTC)となる血流への入り口から始まり、最終的に肝臓および肺などの遠方部位を植民地化する多段階カスケードである、大腸癌(CRC)2の場合。最近では、患者の血液サンプルからCTCを検出して列挙するための非侵襲的なツールである液体生検への注目が高まっています。腫瘍内の遺伝的不均一性は薬剤耐性の主要な原因である;したがって、代表的な細胞を腫瘍材料から分離することは、個別化医療3のための有望なツールを構成する。
血液中のCTCの低頻度(106-10 7白血球あたり1CTC)4にもかかわらず、CTCと血液5の他の成分との間の特性の違いに基づいていくつかの検出および分離技術が開発された。患者の血液サンプル中のCTCの数は、単独で、悪性腫瘍の段階、治療応答および疾患進行に関する情報を提供することができる6、7。したがって、CTC単離は、遺伝的不均一性を評価したり、薬物スクリーニングを行ったりするための翻訳研究や、転移誘導8,9の主要なアクターであるこれらの侵襲性細胞を特徴付けるための基礎的研究にとって重要なツールである。実際、時間の経過とともに何千もの突然変異を蓄積した商業的に確立された癌細胞株と比較して、新鮮なCTCは転移する強力な能力を含む元の原発性腫瘍の主な特徴を共有し、疾患のより良い反映である。これらの特徴は、特に転移に関与する予測された重要な要因のノックアウト実験において、基礎研究のための堅牢なツールです。これらの実験の結果は、以下に説明されるように、マウス上でインビボで検証することができる。
CTCが単離されると、それらは非接着性培養条件で拡大することができ、その後、それらは利用可能な癌細胞株と同じように操作することができ、すなわち、科学的な質問10に応じて、同じように接着状態で培養またはマトリゲルに埋め込むことができる。例えば、目的のタンパク質の発現および局在を試験するために、CTC球体を懸濁状態で増殖させ、ヒストゲルに埋め込んで球部に免疫蛍光を行うことができる。また、タンパク質が膜状であれば、生細胞に対するその発現は細胞測定によって測定することができる。
機能研究のために、肝コロニー形成に役割を果たす可能性のある目的のタンパク質の役割を試験するために、遺伝子を編集したCTCは、shRNAまたはCRISPR/Cas9によって、免疫不全マウスの脾臓に注入することができる。この後者の実験は、肝転移コロニー形成11を模倣する強力なモデルである。
CTCが腫瘍を開始する能力は、非常に少数の細胞を免疫欠損マウスに注入することによって評価することができる。腫瘍開始は癌幹細胞(CSC)の特徴であるため、このアッセイはCTCライン内のCSCの割合を示す。この幹細胞表現型は、循環腫瘍細胞株をいくつかのゴールドスタンダード癌療法に耐性にする。拡張されたCTCは、したがって、薬物をスクリーニングし、患者のための最良の潜在的な効率的な治療を特定するために使用することができます。治療に対するCTC応答は、例えば発光生存アッセイを用いてインビトロで試験することができる。
長期的な観点から、新たに単離され増幅されたCTCの薬物スクリーニングは、患者のための最も効率的で適応された治療法を選択するのに役立つパーソナライズされた医療のための新しいツールとして使用することができます。
本論文では、CTCラインを培養するためのプロトコル、免疫染色および細胞測定を介して特定のタンパク質を染色し、CTCを用いた生体内異種移植実験と同様に細胞傷害アッセイを行う方法が詳述されている。

<table><tbody><tr><td>Accumaxソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 発光細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multipleウェルプレート、</td><td>コーニング</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Histiogel Specimen Medium</td><td>LabStorage</td><td>HG-4000</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF、プレミアムグレード</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FGF-2、プレミアムグレード</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-564</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502048</tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr></tbody></table>

循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

転移は癌死の主な原因である。治療戦略の改善にもかかわらず、転移性癌は予後が悪い。そこで、転移のメカニズムを理解し、進行癌に対して効率的な治療法を提案することが急務に直面する。転移性癌は、生検が侵襲的でアクセス不能であるため、治療が困難である。近年、末梢血から細胞を含まない循環性デオキシリボ核酸(DNA)と循環腫瘍細胞の両方を含む液体生検に大きな関心があり、転移性大腸癌患者からいくつかの循環腫瘍細胞株を確立し、その特性評価に参加しています。確かに、これらの稀で十分に記述されていない細胞を機能的に特徴付けるためには、重要なステップはそれらを拡大することです。一旦確立されると、循環腫瘍細胞(CTC)株は、懸濁または付着状態で培養することができる。分子レベルでは、CTCラインは、免疫蛍光または細胞測定分析による関心のある特定のマーカー(分化、上皮、癌幹細胞など)の発現を評価するためにさらに使用することができる。さらに、CTCラインは、ゴールドスタンダード化学療法および標的療法に対する薬物感受性を評価するために使用することができる。腫瘍を開始するCTCラインの能力は、免疫不全マウスにおけるCTCの皮下注射によっても試験することができる。
最後に、短いヘアピンリボ核酸(shRNA)またはCrispr/Cas9によってCTC遺伝子を編集することによって、癌の播種に関与する可能性のある特定の関心遺伝子の役割をテストすることが可能である。このようにして修飾CTCを免疫不全マウス脾臓に注入することができ、 インビボにおける転移開発プロセスの一部を実験的に模倣することができる。
結論として、CTCラインは、将来の研究とパーソナライズされた医療のための貴重なツールであり、もともと転移を担っている細胞を使用して治療効率を予測することができます。

IF(図1A右パネル)およびFACS(図1B)で観察されたEpCAMおよびCD26の両方の式は、CTC線が上皮であることを示し、CSCの特徴10の1つを表示する。この上皮形質は、他の上皮および間葉系マーカーに対する抗体による染色によってさらに特徴付けることができる。それにより、上皮間葉軸に沿ってCTC線がどこであるかをほぼ知ることができる。他のCSCマーカーの発現は、免疫染色およびサイトメトリーの両方によっても試験することができた。さもなければ、生体内での薬剤耐性および腫瘍の起点アッセイとしての機能試験は、このCSC表現型10を検証することができる。ここで、発光生用アッセイは、CTC IC50が高い薬剤濃度で到達するだけで、これらの細胞の高抵抗性を強調することを示している(図2)。また、皮下CTC注射は、このCTCラインが腫瘍形成能...

CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

転移は癌関連死の主な原因である。この現象は、がん細胞が原発腫瘍から脱離したときに起こり、最終的に遠くの標的器官に到達するために血液循環に入る。これらの剥離細胞が血液中に入ると、我々はそれらを二次腫瘍細胞と呼びます。一方で、転移形成の主な原因であり、他方では腫瘍生検よりも容易であるため、可変材料を表します。確かに、それらは単純な血液穿刺によって収集することができる。血液検体中のこれらの細胞の数が少ないにもかかわらず、我々は3D制御された状態を使用してより大きな懸念を持つ患者の血液からいくつかの循環腫瘍細胞株を確立する最初のものである。この細胞株は、ルーチン実験用の任意の市販細胞株で使用することができる。例えば、遺伝薬物スクリーニングのために、目的とするタンパク質に対して、腫瘍開始能力およびその転移電位を試験するin vivo実験についてもも行う。CTCは、循環腫瘍細胞株、低酸素症の3D条件で培養されるべきである。CTCが球体を形成したら、それを中型に入れて、300 RCFで5分間遠心分離することができます。上清を捨て、アキュマックスの500マイクロリットルを加えます。我々は1つを中断し、37度で溶液を20分インキュベートする。次に、解き放った球をPBSとペレットで洗浄します。ペレットを補充し直したDMEM/F12で再懸濁し、新しい24低付着プレートでマイクロリットル当たり5細胞の密度で細胞を見ます。遠心分離機CTC球は上清を除去し、PBSでペレットを2回洗浄します。PFEの500マイクロリットルでよく混合し、20分間氷の上にチューブをインキュベート。次いで、固定球を遠心分離し、PBSでペレットを2回洗浄し、PBSの最大体積を排除し、20マイクロリットルのフィストゲルを形成した。懸濁液に持って行き、培養花瓶に液滴を作り、10分間乾燥させ、メスを使って取り外します。必要な目的のタンパク質を標的とするCTCに対して、任意の所望の処理が可能になりました。CTC を収集し、前述したように球と Accumax との関連付けを解除します。Accumaxを排除し、ブロッキングバッファーの3 mLでペレットを再懸濁し、14マイクロメートルのセルストレーナーを介して懸濁液を転送して単一細胞溶液を得る。細胞を数え、チューブにディスパッチし、200,000個の細胞の体積を追加し、チューブを遠心分離し、上清を捨てます。抗体データシートによると、チューブ、抗体の所望の体積、および別のチューブのアイソタイプを追加し、メーカーのガイダンスに従って手順を続行します。残りのチューブはラベル付けされず、生存率市場の使用がこの実験で強く示唆されています。サイトメーターで、非ラベル付きチューブから始め、負の標識領域の電圧を設定します。これに続いて、アイソタイプチューブを配置します。アイソタイプは、正のシグナルと非特異的な信号を区別する負のコントロールとして機能します。そして、目的のタンパク質が発現している場合は、正に標識されたゲートのシフトを見る必要がある目的の抗体を持つ標識された細胞で実験を終了します。これは、mL当たり200,000細胞の密度で補充された培地での解約CTCを中断する。超低付着96では、ウェルプレート、50マイクロリットルの体積を密封し、低酸素でプレートを24時間インキュベートする。翌日、試験薬物の異なる濃度の50マイクロリットルを追加し、さらに細胞生存率の塩基を決定し、さらに48時間プレートをインキュベートするためにDMEM / F12の同じボリュームを追加します。3日目に、薬剤を再構成し、各ウェルに70マイクロリットルのミックスを加える。プレートを軌道シェーカーに20分間置き、発光を測定します。このアッセイは、CTCの細胞増殖に及ぼす影響を評価するために多数の薬物を試験するのに有用なツールである。エペンドルフでは、PBSの100マイクロリットルの細胞を再懸濁して、マウスの背面の皮膚をつまみ、針を皮膚の下に挿入する。同じ場所に全容をゆっくりと注入し、2日ごとに腫瘍の成長を監視し、腫瘍が1.5立方センチメートルのサイズを超えた場合にマウスを犠牲にする。手術の前に、皮下に鎮痛剤を注入し、マウスの側側の側腹側で、10番目の肋骨の下に小さな切開を行う。脾臓をそっと持ち上げ、滅菌ガーゼの上に置きます。インスリン注射器を使用して、PBSに再懸濁されたCTCの50マイクロリットルを注入し、針を取り外さずに3分間待ちます。一方の側から動脈血管をリゲートし、もう一方の側から静脈血管をリゲートします。その後、2つの合字の真上を切って脾臓を取り除く。腹部腹膜と皮膚を縫い合わせ、よくその領域を消毒します。本実験の目的は、大腸癌患者由来のCTCが、目に見える転移性の先見性を誘発することによって肝臓を植民地化する能力を試験することである。クリニック腫瘍細胞株の分離と確立は、基礎的および翻訳的研究の両方のための創発的なツールである。例えば、インビボ研究がこの大腸癌細胞株の移動および浸潤能力に関与していることを示した関心のある遺伝子を有する場合、マウスの脾臓に注射する前に循環腫瘍細胞株でこの遺伝子をノックアウトし、肝臓を植民地化させるのは、生体内での結果を確認する良いツールであるかもしれない。翻訳研究のために、循環腫瘍細胞株を単離するという私たちの主な視点は、この貴重な材料をパーソナライズされた医学に使用することです。患者の血液サンプルから、利用可能な薬物のパネルをスクリーニングし、最終的に帰属する細胞毒性を評価するのに十分な材料を持つために、培養中のCTCを2〜3週間分離して増幅する

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がん研究

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分子および計算研究のためのツールとしてのマウス乳腺腫瘍からの癌関連線維芽細胞

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学ぶ 循環腫瘍細胞株の樹立と3D培養法、転移性大腸がん患者由来のCTCを用いた薬剤スクリーニングとin vivo実験。個別化医療とがん研究の両方に活用可能な革新的モデルです。

循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

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