Name: Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a detectar anticorpos contra SARS-CoV-2 em amostras de soro usando o biorelator HiBiT-RBD. Este ensaio de alta vazão combina sensibilidade e rapidez para diagnóstico eficiente da COVID-19.

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Agradecemos e agradecemos a assistência técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Agradecemos também a Mina Ghahremani pelo Design Gráfico. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo. A DWC é apoiada em parte pela Faculdade uOttawa e pelo Departamento de Medicina.

NOTA: O protocolo descrito abaixo adere a todas as diretrizes éticas de acordo com o código de protocolo 20200371-01H.
1. Produção e avaliação do biorelatador HiBiT-RBD
<ol><li>Produzindo uma quantidade suficiente de bioreporter HiBiT-RBD<ol>
<li>Prepare-se para a cultura celular<ol>
<li>Prepare o meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal e 1% penicilina/estreptomicina. Em seguida, aqueça a mídia em um banho de água de 37 °C.</li>
			<li>Ligue o gabinete de segurança biológica (BSC) e use 70% de v/v de etanol para esterilizar a superfície do gabinete.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cultura a linha celular.<ol>
<li>Retire a linha celular de -80 °C ou nitrogênio líquido, e descongele-a em um banho de água de 37 °C. NOTA: Uma linha celular adequada é fácil de manter na cultura, tem alta eficiência de transfecção e é adequada para a produção de proteínas exógenas. Rim embrionário humano, células HEK293 foram usadas para este protocolo.</li>
			<li>Misture as células descongeladas com pelo menos 10 mL de meio completo, pipete a suspensão celular a uma placa de Petri de 10 cm e gire a placa para distribuir células na placa uniformemente. Coloque o prato em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% de CO2 e 85-95% de umidade.</li>
			<li>Observe as células sob o microscópio até que o nível de confluência atinja 80-90%. Em alta confluência, remova o meio, lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato quente (PBS) e adicione 1 mL de 0,25% de ácido tetraacético trypsin-etilenodiamina para separar as células da superfície. NOTA: As células HEK293 são facilmente separadas. Assim, a etapa de lavagem deve ser feita com muita gentileza para evitar o descolamento acidental e a perda de células.</li>
			<li>Depois de aproximadamente 5 minutos, olhe para as células sob um microscópio. Se todas as células estiverem flutuando, adicione pelo menos 4 mL de meio e transfira a suspensão celular para um novo tubo estéril. Conte as células usando um hemótmetro, e adicione 1 × 106 células em cada poço de uma placa de 6 poços para transfecção. NOTA: Após 24h, as células devem estar em 80% ou mais confluentes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transfecção do plasmídeo HiBiT-RBD<ol>
<li>Use 1 μg da expressão HiBiT-RBD plasmid com um reagente de transfecção adequado. Incubar por 10-15 min em temperatura ambiente, e, em seguida, adicionar o volume total a cada poço da placa, em termos de gota. NOTA: Siga o protocolo de transfecção do fabricante. Neste caso, uma mistura (uma quantidade especificada) do reagente de transfecção com DMEM foi adicionada ao plasmídeo diluído (1 μg) em DMEM (ver a Tabela de Materiais). Use um marcador contendo (por exemplo, proteína fluorescente verde [GFP]) plasmid como um controle para monitorar a eficiência da transfecção.</li>
			<li>No dia seguinte, substitua o meio contendo a mistura de transfecção por meio completo. Observe o controle de transfecção bem 48 h após a transfecção. NOTA: Se a transfecção foi positiva e eficiente (mais de 80% GFP-positivo), as células devem estar prontas para a colheita do bioreporter HiBiT-RBD. A construção também contém Sua tag, que pode ser usada para obter proteína purificada no lugar do supernanato total.</li>
			<li>Colete o supernatante em microtubos de 1,5 mL. Adicionar 500 μL de 1x tampão de lise passiva (PLB) às células; incubar e agitar a placa por 15 minutos em temperatura ambiente para a lise celular. NOTA: A solução de sobrenascimento e a solução de lise pode ser preservada a -20 °C com menor perda de integridade por pelo menos 6 meses. De acordo com Azad et al.22, o repórter está estável em uma ampla gama de pH (4-12) e temperatura (4-42 °C).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação do sinal luminescente do biorelatório por ensaio de luciferase<ol>
<li>Preparando os componentes de reação<ol>
<li>Use o supernatante como fonte do biorelador. NOTA: Tanto o supernatante quanto o lysate contêm o biorelato HiBiT-RBD e podem ser usados para o ensaio. No entanto, o supernante é recomendado como fonte devido a razões explicadas nas seguintes notas.</li>
			<li>Diluir o LGBiT e substrato para 1x antes do uso (a concentração de estoque é de 100x). NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o LGBiT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ensaio de luciferase<ol>
<li>Transfira 50 μL do supernasciente de cada poço ou tubo para uma placa de 96 poços, e adicione 50 μL de 1x LgBiT a cada poço. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
			<li>Abra o software do luminômetro, adicione 50 μL de substrato de 1x (furimazine) a cada poço, coloque a placa no luminômetro e execute o software. NOTA: Adicione o substrato imediatamente antes de ler a placa para evitar o consumo do substrato pelas enzimas ativas antes da medição do sinal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Detectando anticorpo anti-RBD com um ensaio rápido e sensível
<ol><li>Ensaio de detecção de anticorpos HiBiT-RBD<ol>
<li>Prepare o biorelatador HiBiT-RBD conforme descrito na seção 1.1 do protocolo. NOTA : Recomenda-se usar o supernascido para o seguinte ensaio, pois é mais simples de coletar e contém a versão glicosylated madura da proteína. Além disso, o lise tem várias outras proteínas que poderiam interferir na interação hibit-RBD-anticorpos.</li>
		<li>Combine 50 μL do supernatante contendo HiBiT-RBD com 1 μg do anticorpo sars-cov-2-RBD comercial em um microtubo de 1,5 mL. Adicione 20 μL de proteína de ligação de imunoglobulina (proteína G) à solução. Ele traga o volume total para 300 μL adicionando PBS. NOTA: O volume total da mistura pode ser reduzido para 150 μL. Volumes totais mais baixos não são recomendados, pois podem resultar em mistura inadequada de anticorpos com o biorelato.</li>
		<li>Incubar o tubo em um agitador ou rotador por 30 minutos. Centrifugar a 12.000 × g para 30 s, descartar o supernaspe e lavar com PBS. Repita o processo três vezes para remover o HiBiT-RBD gratuito. Resuspend em 50 μL de PBS e transferir para uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Adicione 50 μL de 1x LGBiT e espere por 5 min. Em seguida, adicione 50 μL de substrato nanoluc 1x. Leia imediatamente o sinal luminescente com um luminômetro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Detecção de alto rendimento dos anticorpos sars-cov-2 específicos de amostras de soro do paciente
<ol><li>Prepare quantidades maiores do bioreporter HiBiT-RBD para um ensaio de alto rendimento seguindo a seção 1.1 do protocolo.</li>
	<li>Combine 20 μL de proteína magnética G com 50 μL do supernanato HiBiT-RBD em um poço de placa de 96 poços para cada amostra. Adicione 10 μL da amostra de soro a cada poço e elevo o volume total para 150 μL adicionando PBS. NOTA: Utilize tanto o IgG não específico (controle negativo) quanto o anticorpo SARS-CoV-2 neutralizante (controle positivo) a 1 μg/mL de concentração conforme descrito na etapa 2.1.2. Além disso, amostras de soro de camundongos vacinados também podem ser avaliadas para anticorpos. Neste teste, amostras de soro foram obtidas no Campus Geral do Hospital de Ottawa sob um procedimento aprovado e com consentimento informado dos indivíduos.</li>
	<li>Incubar por 30 min em um shaker à temperatura ambiente. Coloque a placa em uma arruela magnética para precipitar o complexo de proteínas G-anticorpos. NOTA: A estrutura específica da arruela magnética precipitará o complexo nas paredes laterais de cada poço.</li>
	<li>Descarte a solução na seção do meio de cada poço e adicione PBS para lavagem. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o excesso de HiBiT-RBD. Adicione 50 μL de 1x PBS e 50 μL de 1x LgBiT. Incubar por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare o software do luminômetro e adicione 50 μL de substrato de 1x. Coloque a placa na máquina, execute o software e grave os sinais. Compare os sinais de amostras de soro, amostras de controle e fundo (poços vazios).</li>
</ol>

<ol><li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+coronavirus+2019+%28COVID-19%29+pandemic+outbreak%3A+A+comprehensive+review+of+the+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Vacunas%22%5BJournal%5D)">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li>
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<li>Piccoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+neutralizing+and+immunodominant+sites+on+the+SARS-CoV-2+Spike+receptor-binding+domain+by+structure-guided+high-resolution+serology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology.</a> Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).</li>
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<li>Azad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoluciferase+complementation-based+biosensor+reveals+the+importance+of+N-+linked+glycosylation+of+SARS-CoV-2+Spike+for+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry.</a> Mol Ther. , 0074-0075 (2021).</li>
<li>Bastos, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+serological+tests+for+covid-19%3A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 370, 2516(2020).</li>
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<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinome-wide+screen+using+a+NanoLuc+LATS+luminescent+biosensor+identifies+ALK+as+a+novel+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+tumorigenesis+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion.</a> The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Luciferase+-+a+multifunctional+tool+for+high+throughput+antibody+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 27(2016).</li>
<li>Nouri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+celastrol+as+a+novel+YAP-TEAD+inhibitor+for+cancer+therapy+by+high+throughput+screening+with+ultrasensitive+YAP%2FTAZ-TEAD+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors.</a> Cancers. 11 (10), 1596(2019).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+S1+NanoBiT%3A+A+nanoluciferase+complementation-based+biosensor+to+rapidly+probe+SARS-CoV-2+receptor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition.</a> Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).</li>
<li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li>
<li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+NanoBiT-based+serological+assay+detects+SARS-CoV-2+seroconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion.</a> Nanomaterials. 11 (3), 807(2021).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

O número crescente de pessoas infectadas com o SARS-CoV-2 e o esforço contínuo para a vacinação global exigem testes sorológicos sensíveis e rápidos que podem ser usados em serosurveys em larga escala. Pesquisas recentes mostram que bionotáciferas com base em nanoluciferase divididos podem ser usados para desenvolver tais ensaios. Recentemente desenvolvemos o bioreporter HiBiT-RBD para projetar um teste que pode ser usado para detectar anticorpos específicos SARS-CoV-2 no soro do paciente de forma rápida e confiável (<st...

O recente surgimento de um novo coronavírus, SARS-CoV21, causou mais de 2.800.000 mortes e 128 milhões de infecções a partir de 30 de março de 20212. Devido à falta de um procedimento de tratamento confiável e bem estabelecido para as terapias clínicas SARS-CoV-2, muitos esforços têm sido feitos para restringir a transmissão viral e, mais importante, desenvolver um tratamento eficaz e robusto ou uma vacina3. Até o momento, há mais de 50 candidatos à vacina COVID-19 em ensaios relatados pela Organização Mundial da Saúde4. A detecção de anticorpos contra o SARS-CoV-2 é de suma importância para determinar a estabilidade a longo prazo da resposta humoral após a administração da vacina, bem como em pacientes recuperados de COVID-195. Alguns estudos demonstraram que existe a possibilidade de que pacientes recuperados de SARS-CoV-2 percam a maioria dos anticorpos de ligação de RBD após 1 ano5,6,7,8,9. Uma investigação mais aprofundada é necessária para entender melhor a imunidade duradoura, e plataformas de detecção de anticorpos mais sensíveis podem ajudar a continuar esse trabalho. Relatos de imunidade sustentada de infecções leves de SARS-CoV-2, que sugerem respostas de anticorpos a longo prazo, também é uma área de estudo interessante e valiosa. Um método rápido e preciso de detecção é essencial para o monitoramento de anticorpos na sera dos indivíduos para fornecer mais informações sobre imunidade na população.
Como outros coronavírus, o SARS-CoV-2 usa glicoproteína de espigão saliente para se ligar à enzima conversor de angiotensina-2 (ACE2) para iniciar uma cascata de eventos que levam à fusão das membranas virais e celulares6,7. Vários estudos provaram recentemente que o RBD da proteína Spike tem um papel crucial na obtenção de resposta de anticorpos poderosos e específicos contra SARS-CoV28,9,10,11. Em particular, as correlações observadas por Premkumar et al. entre o titer de anticorpos de ligação RBD e a potência de neutralização SARS-CoV-2 do plasma dos pacientes são consistentes com a RBD ser um compartimento imunogênico da estrutura do vírus9. Com isso em mente, muitos testes diagnósticos disponíveis para detecção de anticorpos SARS-CoV-2 são tempo e custo-intensivo, requerem um longo procedimento de incubação e lavagem (ensaio imunosorbente ligado à enzima [ELISA]), ou falta de sensibilidade e precisão (imunoensaio de fluxo lateral [LFIA])12. Portanto, um método sorológico quantitativo e rápido complementar da detecção de anticorpos derivados do COVID-19 com alta sensibilidade, resposta rápida e custo relativamente baixo serviria à necessidade de um teste sorológico confiável para a vigilância epidemiológica SARS-CoV-2.
Coletivamente, as limitações dos ensaios sorológicos atuais levaram à investigação do sistema de relatórios bioluminescentes como um potencial agente diagnóstico em futuras pesquisas. Bioluminescência é uma reação enzimática/substrato de ocorrência natural, com emissão de luz. A luciferase nanoluc é a menor (19 kDa), mas o sistema mais brilhante comparado à Renilla e à luciferase de vagalume (36 kDa e 61 kDa, respectivamente)13,14. Além disso, a Nanoluc tem a maior relação de sinal para ruído e estabilidade entre os sistemas mencionados anteriormente. A alta intensidade de sinal de Nanoluc suporta a detecção de quantidades ainda muito baixas de fusões de repórteres15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) é uma versão dividida do sistema Nanoluc, que é composto por dois segmentos: pequeno BiT (11 aminoácidos; SmBiT) e biT grande (LgBiT) com interações relativamente baixas de afinidade (KD = 190 μM ) para formar um complexo luminescente16. O NanoBiT é amplamente utilizado em diversos estudos envolvendo a identificação de interações proteína-proteína15,17,18,19 e vias de sinalização celular11,20,21.
Recentemente, outro pequeno peptídeo com uma afinidade distintamente maior com o LGBiT (KD = 0,7 nM ) foi introduzido, ou seja, o sistema HiBiT Nano-Glo, no lugar do SmBiT. A alta afinidade e o forte sinal do ensaio "add-mix-read" de Nano-Glo fazem do HiBiT uma etiqueta de peptídeo adequada, quantitativa e luminescente. Nesta abordagem, a tag HiBiT é anexada à proteína alvo, desenvolvendo uma construção que impõe interferência estrutural mínima. A fusão hiBiT-proteína se ligaria ativamente à contraparte lgBiT, produzindo uma enzima luciferase altamente ativa para gerar bioluminescência detectável na presença de reagentes de detecção (Figura 1). Da mesma forma, desenvolvemos um sistema baseado em HiBiT Nano-Glo para medir prontamente o titer de anticorpos neutralizante na sera de indivíduos recuperados SARS-CoV-2 e recentemente desenvolvemos um SARS-CoV-2 RBD com marca HiBiT. Este artigo descreve o protocolo para a produção do bioreporter HiBiT-RBD usando procedimentos e equipamentos de laboratório padrão, e mostra como este biorelato pode ser usado em um ensaio rápido e eficiente para detectar anticorpos alvo SARS-CoV-2 RBD.

<table><tbody><tr><td>5x Tampão de Lise Passivo</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>Bio-Plex Arruela Magnética Portátil</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Ensaio de luciferase Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>Kit de 100 mL</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HiBiT-RBD Plasmídeo</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgtacgtgtacgt aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgtacgggccagatacgc gttgacattgattattgactagttattagt aatcaattacggggtcattagtttatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggccccctggctgcccccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtgtatcatatgccaagta 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catttccccgaaaagtgccccggtc</td></tr><tr><td>LgBiT</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td></td></tr><tr><td>penicilina estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Pierce Protein G Grânulos Magnéticos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88848</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688.5</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorpo Neutralizador de Pico, Mouse Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx Microplate Reader</td><td>Luminômetro</td> de leitor de placas de 96 poços BioTek <td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2520056</td><td>0,25%</td></tr></tbody></table>

detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em hibit

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

O surgimento da pandemia COVID-19 aumentou a necessidade de melhores métodos de detecção sorológica para determinar o impacto epidemiológico da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). O número crescente de infecções por SARS-CoV-2 aumenta a necessidade de melhores ensaios de detecção de anticorpos. Os métodos atuais de detecção de anticorpos comprometem a sensibilidade para a velocidade ou são sensíveis, mas demorados. Uma grande proporção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 tem como alvo o domínio de ligação receptora (RBD), um dos compartimentos imunogênicos primários do SARS-CoV-2. Recentemente projetamos e desenvolvemos um RBD altamente sensível, bioluminescente marcado (NanoLuc HiBiT-RBD) para detectar anticorpos SARS-CoV-2. O texto a seguir descreve o procedimento para produzir o complexo HiBiT-RBD e um ensaio rápido para avaliar a presença de anticorpos direcionados a RBD usando esta ferramenta. Devido à durabilidade do produto de proteína HiBiT-RBD em uma ampla gama de temperaturas e ao procedimento experimental mais curto que pode ser concluído dentro de 1 h, o protocolo pode ser considerado como uma alternativa mais eficiente para detectar anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente.

Foram registrados os sinais tanto do liseto celular contendo HiBit-RBD quanto do sobrenante das células transfeinadas (Figura 2) para avaliar a fonte proteica apropriada. HiBiT-RBD e LgBit foram usados separadamente como controles, e os dados mostraram baixo fundo em comparação com um sinal forte quando ambas as partes foram combinadas. Assim, a interação HiBiT-RBD com o LGBiT é necessária para gerar enzima ativa para digestão substrato e atividade de bioluminescência (F...

O protocolo delineado descreve o procedimento para a produção do complexo de proteína de domínio de ligação receptora HiBiT e sua aplicação para detecção rápida e sensível de anticorpos SARS-CoV-2.

Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Meu laboratório tem trabalhado em pesquisa COVID-19, e recentemente desenvolvemos um novo ensaio que nos permitiu detectar rapidamente e com precisão anticorpos SARS-CoV-2. Este protocolo descreve um alto ensaio de rendimento para detectar anticorpos anti-SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente, o que é crítico dada a pandemia atual. A maioria dos ensaios sorológicos atuais sacrifica a velocidade para sensibilidade ou vice-versa.Nossos dados mostram que nosso ensaio é sensível e tem um tempo de resposta rápido. A fim de produzir uma quantidade suficiente de bioreporter HiBiT-RBD alto, comece por preparar-se para a cultura celular. Primeiro, prepare o meio de águia modificado de Dulbecco completo contendo 10% de soro bovino fetal e 1%penicilina e estreptomicina.Em seguida, aqueça a mídia em um banho de água de 37 graus Celsius. Ligue o armário de segurança biológica e use 70% de etanol para esterilizar a superfície do gabinete. Para cultivar a linha celular, retire-a de menos 80 graus Celsius ou nitrogênio líquido e descongele-a em um banho de água de 37 graus Celsius.Misture as células descongeladas com pelo menos 10 mililitros de meio completo. Pipete a suspensão da célula em uma placa de Petri de 15 centímetros e gire a placa para distribuir as células uniformemente. Coloque o prato em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 85 a 95% de umidade.Observe as células sob o microscópio até que o nível de confluência atinja 80 a 90% Em alta confluência, remova o meio, lave as células com PBS quente e adicione três a cinco mililitros de 0,25% trypsin-EDTA para separar as células da superfície. Depois de aproximadamente cinco minutos, olhe para as células sob um microscópio. Se todas as células estiverem flutuando, adicione pelo menos quatro mililitros de médio e transfira a suspensão celular para um novo tubo estéril.Conte as células usando um hemócito e adicione um milhão de células em cada poço de uma placa de seis poços para transfecção. Para realizar a transfecção do plasmídeo HiBiT-RBD, use um micrograma da expressão HiBiT-RBD plasmid com um reagente de transfecção adequado. Incubar por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente, em seguida, adicione o volume total a cada poço da placa dropwise.No dia seguinte, substitua o meio contendo a mistura de transfecção por meio completo. Observe bem o controle de transfecção 48 horas após a transfecção. Colete o supernatante em microtubos de 1,5 mililitro.Adicione 500 microliters de 1X tampão de lise passiva ou PLB às células, depois incubar e agitar a placa por 15 minutos à temperatura ambiente para a lise celular. Em seguida, para avaliar o sinal de luminescência do bioreporter utilizando um ensaio de luciferase, primeiro preparar os componentes de reação e usar o supernatante como fonte do biorelador. Diluir o BiT grande e substrato para 1X antes de usar.Transfira 50 microlitres do supernatante de cada poço ou tubo para uma placa de 96 poços e adicione 50 microliters de 1X grande BiT a cada poço. Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Abra o software do luminômetro, adicione 50 microlitadores de substrato 1X a cada poço, coloque a placa no luminômetro e execute o software.Para realizar o ensaio de detecção de anticorpos HiBiT-RBD, prepare o bioreporter HiBiT-RBD como descrito anteriormente e combine 50 microliters do HiBiT-RBD contendo supernante com um micrograma do anticorpo COMERCIAL SARS-CoV-2 RBD em um microtubo de 1,5 mililitro. Adicione 20 microliters de proteína de ligação de imunoglobulina ou proteína G à solução. Leve o volume total para 300 microliters adicionando PBS.Incubar os tubos em um agitador de tubo ou rotador por 30 minutos. Centrífuga a 12.000 G por 30 segundos. Em seguida, descarte o supernaspe e lave com PBS.Repita o processo três vezes para remover o HiBiT-RBD gratuito. Resuspenque as células em 50 microliters de PBS e transfira para uma placa de 96 poços. Adicione 50 microliters de 1X biT grande e espere por cinco minutos.Em seguida, adicione 50 microliters de 1X substrato NanoLuc. Leia imediatamente o sinal de luminescência com um luminômetro. Prepare quantidades maiores do biorelato hibit-RBD para um ensaio de alto rendimento e combine 20 microliters de proteína magnética G com 50 microliters do supernatante HiBiT-RBD em cada poço de uma placa de 96 poços para cada amostra.Adicione 10 microliters da amostra de soro a cada poço e leve o volume total a 150 microliters adicionando PBS. Incubar por 30 minutos em um shaker à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a placa em uma arruela magnética para precipitar o complexo de anticorpos Protein G.Descarte a solução na seção do meio de cada poço e adicione PBS para lavagem. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o excesso de HiBiT-RBD. Adicione 50 microliters de 1X PBS e 50 microliters de 1X bit grande e incubar por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente.Prepare o software luminômetro. Em seguida, adicione 50 microliters de substrato 1X. Coloque a placa na máquina, execute o software e regise os sinais.Compare os sinais de amostras de soro, amostras de controle e sinal de fundo de poços vazios. Os sinais tanto do HiBiT-RBD contendo liseto celular quanto de sobrenante das células transfeinadas foram registrados para avaliar a fonte proteica apropriada. Os dados mostraram baixo fundo em comparação com um sinal forte quando ambas as partes foram combinadas.A adição de Protein G ajuda a precipitação de anticorpos. O ensaio foi usado para comparar o sinal de um anticorpo neutralizante SARS-CoV-2 comercial com um IgG de controle. O sinal de anticorpo específico era robusto, enquanto o anticorpo de controle tinha perto do nível de fundo luminescente.O vírus da estomatite vesicular oncolítico recombinante ou VSV com uma mutação na posição 51 da proteína M expressando RBD exógeno foi usado para vacinar camundongos. O soro coletado de camundongos vacinados produziu um sinal robusto em comparação com nenhum sinal em camundongos injetados com controle VSV. Este protocolo pode ser usado para detecção dos anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente.As etapas de lavagem após a incubação com protein G são fundamentais para reduzir o fundo. Além disso, é importante adicionar o substrato o mais rápido possível para evitar a perda de sinal. Com algumas etapas adicionais de otimização, o mesmo ensaio pode ser usado para analisar amostras de sangue e pode ser um método eficaz para determinar anticorpos anti-SARS-CoV-2 em amostras de sangue do paciente.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em...

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

O vídeo demonstra o ensaio de luciferase usado para quantificar proteínas marcadas com luciferase. O ensaio usa uma enzima luciferase projetada composta por um grande fragmento que se liga ao pequeno fragmento, que é conjugado com uma proteína de interesse. As subunidades ligadas formam uma enzima ativa que, na presença do substrato, libera um sinal luminescente. Este sinal é então quantificado usando um luminômetro.

O ensaio de luciferase: um ensaio de alto rendimento para medir sinais luminescentes usando biorepórteres baseados em sistema de nanoluciferase projetados

Neste vídeo, mostramos o ensaio baseado no sistema HiBit-RBD bioreporter para detectar anticorpos neutralizantes do SARS-CoV-2. Este sistema tem como alvo o domínio RBD viral usando um sistema repórter bioluminescente contendo HiBiT fundido ao domínio RBD.

Ensaio Bioreporter: Uma técnica sensível usando um sistema repórter bioluminescente para detectar anticorpos SARS-CoV-2

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Neste protocolo, os pontos quânticos conjugados ao pico SARS-CoV-2 recombinante permitem que ensaios baseados em células monitorem a ligação de espigão para hACE2 na membrana plasmática e a endocitose subsequente das proteínas ligadas ao citoplasma.

Imagem confocal de alta taxa de imagem confocal de sars-cov-2 trimers de pico conjugados de alta throughput para rastrear a vinculação e a endocitose em células HEK293T

Este artigo descreve um método conveniente para monitorar mudanças dinâmicas em tituladores de anticorpos para dois isótipos de imunoglobulina simultaneamente (IgA, IgM ou IgG) resultante de uma resposta imune à infecção ou vacinação SARS-CoV-2. Este 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' emprega três imunoensaias indiretas baseadas em microesferas codificadas que são lidas usando um leitor multiplex baseado em fluxo com capacidade de 'canal duplo'.

Monitoramento Dinâmico da Soroconversão usando um Ensaio de Imunobead Multianalyte para Covid-19

O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o KD para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.

Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

Aqui, descrevemos um imunoensaio fluorescente multiplex recém-desenvolvido que usa um sistema de citometria de fluxo de repórter duplo para detectar simultaneamente dois epítopos de proteína spike exclusivos em partículas virais intactas do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que foram capturadas por microesferas magnéticas acopladas à enzima conversora de angiotensina 2.

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex

Descrevemos uma plataforma de imunoensaio recentemente desenvolvida com base nos princípios da biologia sintética livre de células e na técnica de dot-blot para detecção personalizável da resposta de anticorpos em soros humanos e animais.

Cell-free Dot Blot como uma plataforma de imunoensaio prática e adaptável para a detecção da resposta de anticorpos em soros humanos e animais

Aprenda a detectar anticorpos contra SARS-CoV-2 em amostras de soro usando o biorelator HiBiT-RBD. Este ensaio de alta vazão combina sensibilidade e rapidez para diagnóstico eficiente da COVID-19.

Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT

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